Оптимизация способа выделения ДНК растений рода лотос

* Подготовить одноразовую полипропиленовую пробирку объемом 1,5 мл с завинчивающейся или плотно закрывающейся крышкой для отрицательного контроля экстракции (ОК). В пробирку внести 100 мкл ОКО.
* Добавить в пробирки с исследуемыми образцами и ОК по 400 мкл буфера для лизирующего реагента, по 17 мкл лизирующего реагента...

Методика №3 Выделение геномной ДНК с использованием СТАB
Состав СТАВ-буфера для выделения ДНК

Компонент: Конечная концентрация: На 40 мл:
СТАВ 2 % (вес/объем) 0,8 г
Tris Cl, pH 8,0 0,1 М 4 мл 1М раствора
NaCl 1,4 М 3,272 г

Для исследований растений необходимо подключать на молекулярно-генетическом уровне новые методы анализа. Для них необходимо найти простые и удобные способы выделения ДНК из разнообразных источников.
В последнее время получила развитие и широкое применение в диагностике и генотипировании патогенных микроорганизмов полимеразная цепная реакция (ПЦР). При постановке ПЦР необходимо выделить достаточное количество ДНК с минималь ным содержанием белков и других ингибирующих примесей.

• Методы выделения ДНК

Выделение ДНК— важный шаг подготовки проб перед биохимическими и диагностическими процессами как: амплификация, проведение обратной транскрипции, детектирование накопления продуктов амплификации методом ПЦР в реальном времени, гибридизация, клонирование, сиквенс, синтез ДНК не могут быть выполнены на биологических образцах без предварительной очистки нуклеиновых кислот. При выборе метода учитывают высокий выход нужной нуклеиновой кислоты, быстрота метода, большая пропускная способность или высокое качество продукта(2Klintschar M., Neuhuber F. Evaluation of an Alkaline Lysis Method for the Extraction of DNA from Whole Blood and Forensic Stains for STR Analysis // J. Forensic Sci. 2000. V. 45. P. 669–673.). Есть различные методы, позволяющие выделять нуклеиновые кислоты из широкого спектра образцов, лишь малое число пригодно для автоматизации и на многих стадиях выделения есть риск контаминации 3(Moss D., Harbison S.A., Saul D.J.
...

• Принципы выделения
В основе выделения ДНК лежат как физические, так и химические процессы. Чтобы экстрагировать ДНК из растительных объектов требуется избавиться от клеточных ферментов и «удалить» запасные вещества, например, полисахариды а также вторичные метаболиты, (алкалоиды, фенольные соединения, терпены), которые мешают изолированию ДНК, и отрицательно влияют на ее качество. Определенные группы полисахаридов при выделении ДНК образуют с ней вязкую желеподобную единообразную массу.
Серьезное повреждающее воздействие оказывают окислители различной биохимической природы, в том числе фенольные соединения. [2] Различающийся состав метаболитов представителей различных таксонов, а иногда даже представителей одного рода растений, требует индивидуального протокола изолирования ДНК.
Этапы выделения ДНК из замороженных и свежих листьев лотоса орехоносного:
• Разрушение клеток - необходимо разрушить клеточные стенки и нарушить целостность клетки и внутриклеточных компарментов.
...

• Особенности исследуемого материала

Лотос орехоносный (Nelumbo nucifera) Многолетнее травянистое земноводное растение, стебли которого превратились в мощное толстое корневище, погруженное в подводный грунт. Одни листья у лотоса подводные, чешуевидные, другие надводные — плавающие или высоко поднимающиеся над водой. Плавающие листья лотоса плоские, округлые, на длинных гибких черешках. Листья, возвышающиеся над водой, расположены на прямостоящих черешках, имеют воронковидную форму и крупнее плавающих- до 50-70 см в диаметре. 
Листья лотоса покрыты восковым налетом и потому не смачиваются водой — капли воды перекатываются на них, как шарики ртути. 
Цветки лотоса крупные, 25—30 см в диаметре, и высоко поднимаются над водой на прямой цветоножке. Они обладают слабым, но очень приятным ароматом. Широкое обратно-коническое (т.е.
...

• Схема эксперимента

Для подготовки пробы к постановке ПЦР используют различные методики выделения и очистки ДНК в зависимости от поставленных задач. Их суть заключается в экстракции (извлечении) ДНК из биопрепарата и удалении или нейтрализации посторонних примесей для получения препарата ДНК с чистотой, пригодной для постановки реакции амплификации.
Объектом наших исследований стали растения рода лотос (Nelumbo). Для реализации поставленной цели в ходе эксперимента выделяли ДНК из разных частей лотоса:
• Замороженных листьев;
• высушенных листьев;
• зародыша семени;
• коробочек;
• семян.
Из каждой части растения делали три повтора. ДНК выделяли несколькими способами. Для сравнения количества выделенной ДНК по разным методам использовали одно и то же количество для каждого образца – 1 г растительного материала, для гербарных листьев и зародышей количество пробы было уменьшено до 0,1 - 0,5 г.
...