Клонирование генов гликозид гидролазы из Lactobacillus brevis с помощью сверхэкспрессии и очистки белков.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Экспресс-методы амплификации нуклеиновых кислот (МАНК) уже не один десяток лет успешно применяются для решения различных прикладных задач биотехнологии и здравоохранения. Эти методы доступны для большинства лабораторий, стандартны и обладают высокой воспроизводимостью, так как оборудование, расходные материалы и реагенты строго регламентированы.
Неоспоримые преимущества, связанные с доступностью видовой идентификации микроорганизмов, высокой степенью достоверности, точности и скорости получения результатов при контроле готовых продуктов питания, БАД к пище и лекарственных форм, содержащих лактобациллы, возможностью оперативного мониторинга популяций на этапе производственного контроля, обосновывают актуальность введения МАНК в методическую базу лабораторного обеспечения ...

Оглавление

ВВЕДЕНИЕ 3
Экология лактобацилл 5
Таксономия 11
Метаболизм сахаров 14
Индикация лактобацилл с использованием бактериологических экспресс-анализаторов 23
Гликозил-гидролазы 31
ТРАДИЦИОННАЯ (ЭНЗИМАТИЧЕСКАЯ) КЛАССИФИКАЦИЯ ГЛИКОЗИЛ-ГИДРОЛАЗ 33
КЛАССИФИКАЦИЯ CAZy: СЕМЕЙСТВА И КЛАНЫ ГЛИКОЗИЛ-ГИДРОЛАЗ 37
ИЕРАРХИЧЕСКАЯ КЛАССИФИКАЦИЯ ГЛИКОЗИЛ-ГИДРОЛАЗ 41
КЛОНИРОВАНИЕ ГЕНА GLNK ИЗ LACTOBACILLUS BREVIS И ОЧИСТКА БЕЛКА 55
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 57
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 58

ВВЕДЕНИЕ

С конца XIX века и до настоящего времени лактобациллы (Lactobacillus spp.) являются объектом научных исследований, так как с древних времен они использовались в качестве стартерных культур для производства кисломолочных продуктов.
Лактобациллы широко применяются в различных отраслях биотехнологии и пищевой промышленности. Основная область их использования – производство кисломолочных продуктов, обогащение различных продуктов питания, а также создание пробиотиков в форме лекарственных препаратов и БАД к пище. На данный момент на отечественном рынке представлен широкий ассортимент продуктов и препаратов, содержащих бактерии рода Lactobacillus [1].
Следует отметить также, что бактерии рода Lactobacillus зачастую становятся причиной порчи продуктов питания, как на этапе производств а, так и на этапе хранения.
Помимо предусмотренного в действующей нормативной документации Федеральной службы Роспотребнадзора контроля безопасности продукта, то есть отсутствия в его составе санитарно-показательных и патогенных микроорганизмов, и «полезности» – только констатации факта наличия лактобацилл в определенном количестве, в настоящее время назрела необходимость введения качественно нового этапа бактериологического контроля – контроля видовой структуры пробиотических штаммов [2, 3].
В течение многих лет для контроля продуктов, содержащих лактобациллы, было регламентировано использование микробиологических методов исследования, не направленных на биохимическую идентификацию лактобацилл, включающих работу с чистыми культурами микроорганизмов и изучение их биохимических свойств, так как это длительные и дорогостоящие методики [3, 4]. Кроме того, микробиологический метод не всегда позволяет точно идентифицировать отдельные виды бактерий рода Lactobacillus ввиду вариабельности их фенотипических свойств и также дифференцировать филогенетически родственные бактерии ввиду идентичности свойств [5]. В связи с этим необходимо дополнение методической базы Федеральной службы Роспотребнадзора достоверными, удобными в использовании, экономически выгодными методами контроля продуктов и препаратов, содержащих лактобациллы, в том числе и методами на основе амплификации нуклеиновых кислот (МАНК). Это позволит проводить контроль видового состава лактобацилл, заявленного в нормативно-технической документации и рекламируемого производителем, тем самым дополнить контроль «полезности» и пищевой ценности продукта.
Материалы, представленные в обзоре, содержат актуальную информацию о биологии лактобацилл, их таксономии на современном этапе и раскрывают возможности молекулярно-биологических методов для решения основной задачи Федеральной службы Роспотребнадзора по сохранению здоровья и благополучия населения страны.
В настоящее время азотный метаболизм молочнокислых бактерий Lactobacillus практически не исследован, несмотря на их широкое применение в производстве молочнокислых продуктов, квашении и силосовании. Таким образом, анализ молекулярных механизмов регуляции азотного метаболизма в клетках лактобацилл является актуальной задачей. В единичных работах имеются данные о некоторых аспектах особенностей азотного метаболизма лактобацилл. Предварительный анализ геномов Lactobacillus brevis и Lactobacillus buchneri выявил наличие гена белка GlnK, гомолог которого в клетках бактерий представляет собой небольшой регуляторный белок, принадлежащий к семейству PII белков, участвующих в регуляции азотного метаболизма [Javelle et al., 2004, V. 279, p. 8530-8539; Hallenbeck, 2008, V. 98, р. 275-284]. В клетках B. subtilis белок GlnK, по-видимому, регулирует активность мембранного белка AmtB и фактора транскрипции TnrA играющего ведущую роль в контроле активности генов азотного метаболизма у B.subtilis [Detsch, Stulke, 2003, V.149, р. 3289-3297; Kayumov et al., 2011,V. 278, р. 1779-1789].
Целью работы явилось клонирование и очистка белка GlnK молочнокислых бактерий Lactobacillus brevis. Для этого синтезировали ген glnK из L. brevis и клонировали в экспрессионный вектор pASKIBA3.

Гибридизация может быть проведена непосредственно в геле, либо на нейлоновой или нитроцеллюлозной мембране. Рестрикты, содержащие копии этих генов визуализируются, формируя индивидуальную конфигурацию – риботип [66].Этот метод был использован для изучения разнообразия лактобацилл репродуктивного тракта женщин [88]. Данный метод оказался максимально информативным, с помощью полученных результатов удалось установить штаммовую принадлежность большинства свежевыделенных культур основных представителей лактофлоры влагалища здоровых женщин в «холодном периоде» –L. jensenii, L. casei, L. rhamnosus, L. acidophilus, L. plantarum,L. fermentum .Часто для изучения видового разнообразия и внутривидового типирования бактерий рода Lactobacillus применяют метод анализа полиморфизма амплифицированныхфрагментов ДНК (RAPD), основанный на использовании коротких произвольных олигонуклеотидных праймеров длиной 9–10 пар нуклеотидов, которые гибридизуются с ДНК-мишенью при низкой температуре отжига. Суть метода заключается в амплификации случайных последовательностей ДНК-мишени с одного праймера, для которого неизвестно, где на ДНК мишени он имеет участки гомологии и сколько их. В данном методе стадия рестрикции амплификатов отсутствует, поскольку в процессе амплификации синтезируются фрагменты разной длины, которые разделяют электорофорезом в агарозном геле и анализируют полученные электрофореграммы [87]. Метод RAPD обладает высокой чувствительностью и позволяет дифференцировать близкородственные виды, он прост в исполнении и экономически выгоден. Для его использования не обязательно иметь информацию о строении генома искомого микроорганизма, один протокол можно применять для работы с широким спектром культур. К недостаткам метода отнесится плохая воспроизводимость, так как малейшие изменения условий реакции могут привести к изменению конечного результата.Triplicate Arbitrarily Primed-PCR (TAP-PCR). Этот метод является модификацией RAPD с более высокой чувствительностью. Суть TAP-PCR заключается в параллельной постановке с одним коротким праймером трех реакций амплификации при разной температуре отжига (38°, 40° и 42°С) и дальнейшем анализе наработанных фрагментов в агарозном геле и их сравнении. Чувствительность метода высока, как и у метода RAPD, а сравнение трех фореграмм одного штамма увеличивает точность и достоверность анализа [93].ПЦР с электрофорезом в денатурирующем градиенте геля. Электрофоретический метод разделения макромолекул с высоким разрешением, используемый для идентификации точковых мутаций в молекуле ДНК, заключается в том, что двухцепочечные фрагменты ДНК, наработанные в ходе ПЦР, помещают в полиакриламидный гель, содержащий линейный градиент концентрации денатурирующего агента, что позволяет идентифицировать молекулы, различающиеся даже по единственному нуклеотиду.Метод основан на изучении конформационных профилей ДНК. Последовательность нуклеотидов в двухцепочечных фрагментах гена 16S рРНК определяет особенности изменения конформации этих фрагментов в денатурирующих условиях. Мутации (в том числе и одиночные замены нуклеотидов) изменяют температуру плавления (денатурации) доменов ДНК и приводят к изменению конформации и, соответственно, скорости миграции ампликона в геле. Фрагмент ДНК, содержащий мутацию, плавится при другой концентрации денатурирующего агента в геле и двигается с другой скоростью при электрофорезе по сравнению с аналогичным фрагментом ДНК дикого (неизмененного) типа.Денатурация происходит под действием формамида, входящего в состав геля. Разновидностью метода DGGE является метод электрофореза в температурном градиенте геля (TGGE), где в роли фактора плавления выступает повышение температуры.Для исключения возможности расхождения комплементарных цепей ДНК при денатурации, к 5'-концу одного из праймеров, использующихся для наработки фрагмента, присоединяют последовательность, богатую G и C основаниями, которая, будучи тугоплавкой, удерживает вместе цепи ДНК [66].Метод электрофореза в денатурирующем градиенте геля эффективно используется для изучения видового разнообразия лактобацилл различных биотопов организма человека, микробных ассоциаций различных экологических ниш и субстратов [94, 95].Гликозил-гидролазыГликозил-гидролазы (гликозидазы или карбогидразы; К.Ф. 3.2.1) – обширная группа ферментов, катализирующих гликолитическое расщепление O-гликозидной связи. Их принято относить к катаболическим ферментам углеводного обмена; в течение многих десятилетий они являются объектами разнообразных биохимических исследований [2–10]. Гены гликозилгидролаз обнаружены в геномах почти всех живых организмов, исключение составляют часть архей и некоторые паразитические одноклеточные эукариоты [11, 12]. Ряд вирусов также кодирует гликозидазы. На гликозидазы и их близкие гомологи приходится около 1% всех известных генов [12]. Доля этих генов в геноме существенно варьирует в зависимости от таксономического положения организма [11]. Набор гликозилгидролаз у микроорганизмов в значительной мере зависит от их экологической ниши: гены гликозидаз часто подвержены дупликациям (могут быть представлены в виде нескольких паралогов [7, 13–17]), элиминации (набор генов может различаться даже у штаммов одного вида [18]) и горизонтальному переносу (филогенетические деревья гликозидаз, как правило, сильно отличаются от деревьев организмов-хозяев [14–16, 19, 20]). Эволюционно близкородственные гликозидазы часто различаются по субстратной специфичности [9, 11, 21, 22], а среди гомологов гликозидаз обнаружены ферменты с самыми различными энзиматическими активностями, а также белки, не являющиеся ферментами [11, 23]. Минимальные изменения в первичной структуре гликозил-гидролаз способны изменить их субстратную специфичность [24]. Многие гликозил-гидролазы обладают сложной доменной структурой, а разные домены одного белка часто имеют независимую эволюционную историю. При этом в одном белке могут содержаться два или более гомологичных [25–27] или негомологичных [7, 28, 29] каталитических домена.Гликозил-гидролазы и их гены стали модельными объектами для различных областей биологии: исследования дрожжевых лизатов, содержащих инвертазу (К.Ф. 3.2.1.26), когда-то заложили основы энзимологии [30]; своего рода эталоном регуляции экспрессии генов у бактерий стал lac-оперон из Escherichia coli [31], содержащий в-галактозидазный (К.Ф. 3.2.1.23) ген lacZ, который нашел широкое применение при конструировании векторов для клонирования; первым белком с экспериментально определенной третичной структурой (PDB, 1HEW) оказался лизоцим (К.Ф. 3.2.1.17) из куриного яйца [32].Двумя самыми распространенными органическими веществами в живых организмах являются целлюлоза и хитин [2, 33], что делает углеводы доминирующим по массе компонентом в живой материи на Земле. Некоторые гликозидные связи, в частности, связи между двумя глюкозными остатками, являются химически наиболее стабильными связями между мономерами в природных биополимерах [34]. Расщепляющие такие связи гликозил-гидролазы ускоряют соответствующую реакцию на 17 порядков в сравнении со спонтанным гидролизом, что делает их одними из наиболее эффективных из известных нам катализаторов [34].ТРАДИЦИОННАЯ (ЭНЗИМАТИЧЕСКАЯ) КЛАССИФИКАЦИЯ ГЛИКОЗИЛ-ГИДРОЛАЗГликозил-гидролазы в широком смысле слова (К.Ф. 3.2) объединяют O-, Nи S-гликозилгидролазы [4, 8, 35]. Однако N-гликозил-гидролазы (К.Ф. 3.2.2) являются, главным образом, ферментами метаболизма нуклеиновых кислот и в настоящем обзоре не рассматриваются. Единственно известная S-гликозил-гидролаза (К.Ф. 3.2.3) – тиоглюкозидаза (К.Ф. 3.2.3.1) – в 2001 г. была реклассифицирована как O-гликозил-гидролаза с энзиматическим номером (К.Ф. 3.2.1.147) [36].Большое разнообразие известных энзиматических активностей гликозил-гидролаз связано с огромным числом их природных субстратов – ди-, олигои полисахаридов, а также их производных. Количество теоретически возможных структур углеводов воистину астрономическое. Например, низкомолекулярный восстанавливающий (редуцирующий) гексасахарид C36H62O31 может иметь более 1012 разветвленных и линейных изомеров [37]. Традиционная (биохимическая) номенклатура гликозидаз основана исключительно на их субстратной специфичности и лишь иногда (в случае амилаз – К.Ф. 3.2.1.1 и К.Ф. 3.2.1.2) учитывает молекулярный механизм катализируемой реакции [35]. При этом рассматривается только основной, наиболее предпочтительный субстрат того или иного фермента. Преимуществом этой номенклатуры является сравнительная простота и длительный опыт применения, что обеспечило ее стандартизацию. К настоящему времени зарегистрированы энзиматические активности от (К.Ф. 3.2.1.1) до (К.Ф. 3.2.1.165), при этом регистрация части номеров по разным причинам была аннулирована [36].Многие гликозидазы имеют широкую субстратную специфичность [3, 21], что затрудняет их классификацию. Часто гликозидазы наряду с гликозил-гидролазной (К.Ф. 3.2.1) проявляют еще и трансгликозидазную активность (К.Ф. 2.4.1) [2–4, 21, 38–40]. Это формально позволяет рассматривать их как представителей другого класса ферментов – трансфераз. Для целого ряда гликозилтрансфераз (точнее трансгликозидаз) обнаружено существенное структурное сходство (на уровне первичных или третичных структур) с некоторыми гликозил-гидролазами [11]. Однако эти данные, свидетельствующие об общности эволюционного происхождения и сходстве механизма катализа у ферментов этих двух групп, не принимаются во внимание биохимической классификацией [35, 36].Гликозидазы катализируют гидролиз гликозидной связи по двум различным механизмам (retaining и inverting), приводящим либо к сохранению (путем двойного обращения), либо к обращению аномерной конфигурации субстрата в процессе реакции [4–6, 19, 41–44]. Каждый фермент обладает одним из них вне зависимости от выбора субстрата, а энзиматический гидролиз гликозидной связи всегда является стереоспецифическим. Однако известны случаи, когда гидролиз некоторых низкомолекулярных синтетических субстратов – производных или аналогов углеводов – идет по иному механизму, чем гидролиз природного субстрата, или гидролизу могут подвергаться синтетические субстраты (например, гликозил-фториды) обеих (α и β) аномерных конфигураций [3–5, 39, 44, 45]. Знание стереохимии реакции гидролиза позволяет предсказать способность фермента к катализу побочной реакции – переносу гликозидных остатков между молекулами субстрата (трансгликозилирование). Такая способность свойственна только гликозидазам, действующим с сохранением аномерной конфигурации субстрата у продукта реакции [3–7, 19, 46].Огромный экспериментальный материал накоплен в результате исследований механизма действия и специфичности различных гликозил-гидролаз. Показано, что абсолютной специфичностью гликозидазы практически во всех случаях обладают лишь по отношению к двум элементам структуры субстрата – к конфигурации расщепляемой гликозидной связи (α или β) и размеру окисного цикла отщепляемого моносахаридного остатка (шестичленный пиранозный или пятичленный фуранозный циклы). В остальном для них характерна большая широта специфичности [5].Для гликозидаз, действующих на пиранозные остатки, было предложено [4, 46–48] наряду с механизмом реакции (приводящим либо к сохранению, либо к обращению аномерной конфигурации) учитывать еще аксиальную (как правило, α) или экваториальную (как правило, β) направленность гидролизуемой гликозидной связи, что позволяет выделить четыре класса ферментов. Аналогичная система классификации применима и к фуранозидазам. Наряду с этим, гликозидазы подразделяются на syn( и anti(протонаторы в зависимости от пространственного расположения каталитических остатков фермента по отношению к субстрату [49]. Стереохимия реакции гидролиза обуславливается взаимным расположением каталитически важных групп в активном центре фермента. Как правило, энзиматический гидролиз гликозидной связи нуждается в наличии двух каталитически важных аминокислотных остатков в активном центре. В подавляющем большинстве случаев их роль выполняют карбоксилсодержащие остатки (Asp и/или Glu). Карбоксильные группы этих двух остатков обычно находятся на расстоянии около 5–6 или 9–10 ангстремов в случае гликозидаз, действующих с сохранением и обращением аномерной конфигурации субстрата соответственно. В последнем случае большее расстояние обусловлено необходимостью одновременного нахождения в процессе реакции гидролиза субстрата и молекулы воды в активном центре фермента [3, 4, 41–44, 49–52].Гликозидазы, гидролизующие олигои полисахариды, на основании характера расщепления ими субстрата могут быть подразделены на две группы – ферменты экзои эндо-типа. Несмотря на наличие некоторых переходных случаев, в целом, подобное разделение весьма удачно [5, 7, 46].КЛАССИФИКАЦИЯ CAZy: СЕМЕЙСТВА И КЛАНЫ ГЛИКОЗИЛ-ГИДРОЛАЗНакопление данных о первичной структуре гликозил-гидролаз позволило разработать принципиально новую систему классификации этих ферментов, основанную на сравнении аминокислотных последовательностей их каталитических доменов. Впервые этот подход был использован при анализе β-1,4-гликозидаз, что позволило сгруппировать их в восемь семейств [53–55]. Затем были изучены все известные тогда последовательности гликозил-гидролаз (более 300), в итоге выявлено 36 семейств белковгомологов [56]. За прошедшие с тех пор два десятилетия произошло, по крайней мере, стократное возрастание числа гликозидаз с известными аминокислотными последовательностями (табл. 1). Бульшая часть новых последовательностей оказалась принадлежащей ранее известным семействам, а остальные образовали ряд новых семейств [11, 29, 46, 47, 57–59]. С 1998 г. классификация гликозил-гидролаз была распространена на ферменты с трансгликозидазной активностью. В настоящее время известно 120 семейств гликозидаз: GH1–GH125. При этом семейства GH21, GH40, GH41, GH60 и GH69 были аннулированы, поскольку более тщательные исследования показали, что относящиеся к ним ферменты не обладают гликозидазными активностями [11, 47, 60]. Текущая версия классификации доступна в интернете на сайте CAZy [11].Критерием для отнесения какого-то белка, точнее белкового домена, к тому или иному семейству гликозил-гидролаз является наличие в последовательности этого белка протяженного участка (не менее 100 аминокислотных остатков), гомологичного последовательности, по крайней мере, одного ранее известного представителя семейства [56]. Применение этого критерия привело к включению в состав семейств гликозил-гидролаз целого ряда ферментов, не обладающих гликозидазными активностями [23], а также большого числа «гипотетических» белков с неизвестными энзиматическими свойствами [11]. Доля неохарактеризованных белков среди членов семейств гликозидаз постоянно возрастает, что связано с быстрыми темпами секвенирования новых геномов. Семейства гликозидаз с большим числом известных представителей было предложено подразделять на подсемейства (subfamilies, subtypes) на основании уровня сходства аминокислотных последовательностей [53, 61, 62].В настоящее время в большинстве семейств гликозил-гидролаз, по крайней мере, для одного представителя известен молекулярный механизм катализируемой реакции: с обращением или сохранением аномерной конфигурации субстрата [9, 11, 41, 43, 46, 49, 58, 63]. Во всех известных случаях ферменты одного семейства имеют одинаковый механизм [41, 43, 63], исключением являются семейства GH23 и GH97, объединяющие «сохраняющие» и «обращающие» гликозил-гидролазы [64]. Консервативной в пределах каждого семейства гликозидаз также является аномерная конфигурация расщепляемой гликозидной связи (α или β), точнее говоря, ее аксиальная или экваториальная ориентация [43, 46]. Единственно известное исключение представляет семейство GH4 гликозидаз: в его состав входят как ферменты расщепляющие α-глюкозидную связь, так и ферменты расщепляющие β-глюкозидную связь [11, 52, 65].Более высокая консервативность третичных структур белков в сравнении с первичными позволяет предполагать возможное сходство пространственных структур некоторых гликозидаз, относящихся к разным семействам. Известен целый ряд подобных случаев, которые, прежде всего, касаются семейств, содержащих белки с экспериментально определенными третичными структурами. В ряде других случаев о предполагаемом сходстве трехмерных структур гликозидаз можно судить на основании наличия отдаленного, но статистически достоверного сходства аминокислотных последовательностей этих белков. Семейства, к которым относятся гликозидазы, имеющие или предположительно имеющие родственные третичные структуры, было предложено объединять в суперсемейства [61]. Число суперсемейств постепенно возрастало. Это было обусловлено тремя причинами. Во-первых, постоянно увеличивается число гликозидаз с известными пространственными структурами. Во-вторых, в базах данных появляются новые последовательности, обладающие статистически достоверным сходством с представителями сразу двух семейств (тут действует правило «друзья моих друзей – мои друзья» [61]). В-третьих, вследствие повышения чувствительности методов компьютерного анализа последовательностей выявляются сходства между гликозидазами разных семейств.Общепринятая классификация гликозилгидролаз (CAZy), основанная на гомологии последовательностей, принимает во внимание сходство между белками только тех семейств, которые характеризуются одинаковым механизмом гидролиза гликозидной связи [11, 46, 58, 66]. По аналогии с классификацией протеаз [1, 67] такие семейства объединены в кланы, которых к настоящему времени известно четырнадцать (GH-A–GH-N, табл. 2). Полагают, что все гликозидазы, относящиеся к семействам одного клана, имеют общее эволюционное происхождение, сходную трехмерную структуру, консервативное расположение каталитических остатков (т.е. в гомологичных положениях) и одинаковый механизм гидролиза гликозидных связей [42, 46, 47, 58–60, 63, 66].Хотя в пределах одного семейства гликозидаз, как правило, не бывает ферментов, обладающих разными механизмами гидролиза гликозидной связи (кроме семейств GH23 и GH97), экспериментально было показано, что механизм гидролиза может быть изменен на обратный путем замены лишь одного аминокислотного остатка.Таблица 1. Развитие классификации гликозил-гидролазГод (ссылка)Число белковЧисло семейств (в т.ч. в составе кланов)Число кланов1989 [55]216 (0)–1991 [56]32236 (0)–1993 [57]48245 (0)–1995 [41, 61]…52 (17)51996 [58]~95057 (17)51997 [46, 60]~150062 (19)51998 [11]~220070 (26)81999 [11]>280077 (…)102000 [11]…82 (33)102001 [11]…85 (37)112002 [11]~800087 (40)122003 [11]…91 (43)132004 [11]…95 (46)142005 [11]>20 000101 (46)142006 [11]~30 000106 (46)142007 [11]>30 000110 (46)142008 [11]>40 000114 (49)142009 [11]>59 000115 (50)142010 [11]~82 000118 (50)142011 [11]~86 000123 (50)14Таблица 2. Кланы гликозил-гидролазКланСемейства (GH)Аномерная конфигурацияТрехмерная структураСсылкаGH-A1, 2, 5, 10, 17, 26, 30,сохраняется (экв.)(β/α)8-бочонок7, 10, 11, 25, 40, 46, 48, 57,35, 39, 42, 50, 51, 53,59, 66, 88, 94, 95, 96, 99,59, 72, 79, 86, 113150, 151GH-B7, 16сохраняется (экв.)β-сэндвич152GH-C11, 12сохраняется (экв.)β-сэндвич19, 153GH-D27, 31, 36сохраняется (акс.)(β/α)8-бочонок16, 56, 61, 75, 79, 103–106,154, 155GH-E33, 34, 83, 93сохраняется (экв.)6-лопастной β-пропеллер11, 156GH-F43, 62меняется (экв.)5-лопастной β-пропеллер78, 130–132GH-G37, 63меняется (акс.)(α/α)6-бочонок99GH-H13, 70, 77сохраняется (акс.)(β/α)8-бочонок79, 108, 111, 157–162GH-I24, 46, 80меняется (экв.)α + β-лизоцим11, 140-142GH-J32, 68сохраняется (β-фуранозид)5-лопастной β-пропеллер57, 78, 104, 129–132, 163,164GH-K18, 20, 85сохраняется (экв.)(β/α)8-бочонок11, 48, 88, 95GH-L15, 65, 125меняется (акс.)(α/α)6-бочонок11, 49, 99GH-M8, 48меняется (экв.)(α/α)6-бочонок99GH-N28, 49меняется (акс.)(β)3-соленоид95, 99, 144, 145Замена у гликозидаз, гидролизующих субстрат с сохранением его аномерной конфигурации, нуклеофильного карбоксилсодержащего остатка (Asp/Glu) активного центра на ненуклеофильный (Ala или Gly) приводит к инактивации фермента.