Химико-токсикологическое определение фенобарбитала.

СОДЕРЖАНИЕ
ВВЕДЕНИЕ
1 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА КСЕНОБИОТИКА
1.1 Название ксенобиотика
1.2 Химическая природа
1.3 Физико-химические свойства
1.4 Применение фенобарбитала
1.5 Класс токсичности
1.6 Токсикометрические параметры
1.7 Клинические признаки при отравлении
1.8 Стадии отравления
1.9 Методы детоксикации
1.10 Обоснование применения антидотной терапии
2 ТОКСИКОДИНАМИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ КСЕНОБИОТИКА
2.1 Молекулярные механизмы формирования токсического эффекта
2.2 Влияние на токсичность физико-химических свойств токсиканта и параметров среды
2.3 Количественная корреляция структура — активность. Зависимости доза – ответ
2.4 Сочетанные воздействия с физическими факторами среды
3 ТОКСИКОКИНЕТИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ
3.1 Токсикокинетические модели при оценке токсичности
3.2 Кривые концентрация-время, AUC для ксенобиотика
3.3 Период полувыведения, объем распределения и клиренс
3.4 Механизмы биотрансформации
4 ВОПРОСЫ АНАЛИТИЧЕСКОЙ ТОКСИКОЛОГИИ
4.1 .Методология проведения клинико-токсикологического анализа
4.1.1 Отбор проб биоматериала у живых лиц или извлечение органов и тканей из трупа
4.1.2 Изолирование ксенобиотика
4.2 Методы идентификации
4.3.Методы количественного определения
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

Химико-токсикологическое определение фенобарбитала.

Для ускоренного выведения из организма уже всосавшихся барбитуратов почками больному дают обильное питье (обычную воду) и мочегонные средства. Если больной еще в сознании, то жидкость принимается внутрь, а при тяжелом отравлении внутривенно вводится 5% раствор глюкозы, либо изотонический раствор хлорида натрия (до 2-3 л в сутки) [11, 13]. Для связывания фенобарбитала в желудке используется активированный уголь, водная эмульсия с 20-50 г которого вводится в желудок. Через 10 минут прореагировавший уголь необходимо удалить из желудка промыванием, так как адсорбция фенобарбитала является обратимым процессом. Часть яда, прошедшая в желудок, удаляется с помощью слабительных. Предпочтение отдается 30-50 г глауберовой соли (сульфату натрия), так как при нарушении функции почек сульфат магния (горькая соль) может оказать угнетающее воздействие на ЦНС.1.10 Обоснование применения антидотной терапииОтравление фенобарбиталом крайне опасно и требует неотложной медицинской помощи. Применение указанных выше мер обосновано, во-первых, отсутствием специфического антидота для фенобарбитала, во-вторых, достаточно высокой скоростью всасывания препарата человеческим организмом и, в-третьих, достаточно высокой токсической опасностью фенобарбитала.Практически все последствия передозировки фенобарбиталом можно устранить при помощи тщательной коррекции состояния пострадавшего и названных процедур, однако при крайне тяжелой степени отравления могут потребоваться гемодиализ и гемоперфузия. Показаниями к их применению являются тяжелое отравление с сопутствующим развитием сердечной и почечной недостаточности, нарушение кислотно-основного равновесия и электролитного баланса в организме, неусточвая сердечная деятельность и дыхание, безрезультатность стандартных детоксицирующих процедур. Отметим, что посредством гемоперфузии и гемодиализа обычно не удастся удалить из организма значительные количества препаратов короткого и промежуточного действия, так как они прочно связываются с белками крови лучше распределяясь в тканях [11, c. 55].2 ТОКСИКОДИНАМИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ КСЕНОБИОТИКА 2.1 Молекулярные механизмы формирования токсического эффектаМеханизм действия фенобарбиталов заключается в следующем:Вещество проникает в клетку, растворяя её мембрану, не производя возбуждение;В результате блокируется эффект ацетилхолина – нет проводимости;стимулируется синтез основного тормозного вещества ГАМК.После приема внутрь фенобарбитал полностью, но достаточно медленно всасывается в тонком кишечнике. Биодоступность составляет 80%. Связывание фенобарбитала с альбумином в плазме составляет 20-45%.Фенобарбитал взаимодействует с барбитуратным участком ГАМКА- бензодиазепинбарбитуратного рецепторного комплекса и повышает чувствительность ГАМК-рецепторов к медиатору (ГАМК), в результате повышается длительность периода раскрытия нейрональных каналов для входящих токов ионов хлора и увеличивается поступление ионов хлора в клетку. Увеличение содержания ионов хлора в нейроне предопределяет гиперполяризацию клеточной мембраны, понижая ее возбудимость. В итоге тормозное влияние ГАМК усиливается и в различных отделах центральной нервной системы происходит угнетение межнейронной передачи.В терапевтических концентрациях препарат усиливает ГАМКергическую передачу, тормозит глутаматергическую нейротрансмиссию, особенно опосредованную глутаматными альфа-амино−5-метилизоксазол−4-пропионат (AMPA)-рецепторами. При высоких концентрациях влияет на ток ионов натрия, блокируя ток ионов кальция через клеточные мембраны (каналы L- и N-типов).Противосудорожное действие фенобарбитала обуславливается активацией ГАМКергической системы, влиянием на потенциалзависимые натриевые каналы, а также подавлением активности глутамата и пр. Фенобарбитал снижает возбудимость нейронов эпилептогенного очага, препятствуя возникновению и распространению импульсов. Препарат блокирует высокочастотные повторные разряды нейронов (за счет влияния ионов натрия на ток). Также барбитураты повышают порог электростимуляции двигательных зон коры головного мозга.2.2 Влияние на токсичность физико-химических свойств токсиканта и параметров средыВ человеческом организме барбитураты подвергаются различным процессам метаболизма. Барбитал, бутобарбитал и фенобарбитал метаболизируют на 15%, этаминал и барбамил - на 90%. Остальная часть выводится почками в неизмененном виде. На ЦНС барбитураты оказывают неселективное угнетающее действие. Так, фенобарбитал подавляет сенсорные зоны коры головного мозга, снижает двигательную активность, вызывая сонливость, сон и седативный эффект.Проявляемое фенобарбиталом седативно-снотворное действие обусловлено, в основном, угнетением активности клеток восходящей активирующей ретикулярной формации ствола мозга, ядер таламуса, торможением взаимодействия этих структур с корой головного мозга [8, 13].2.3 Количественная корреляция структура — активность. Зависимости доза – ответФенобарбитал, как и барбитал, представляет собой двузамещенную в положении 5- барбитуровую кислоту. Кислотные свойства фенобарбитала обусловлены наличием двух атомов водорода в — NH-группах, находящихся рядом с карбонильной группой —СО—. Замещение атомов водорода в положении C5 различными радикалами (этиловым и фенильным) влияет на гипнотическую мощность и противосудорожное действие, так как длинная разветвленная цепь обеспечивает большую мощность препарата, чем короткая неразветвленная.Этим обусловлена способность фенобарбитала образовывать водородные связи при взаимодействии с белками и, соответственно, активность препарата и длительность его воздействия (8-12 часов). Как уже было сказано в данной работе, фенобарбитал обладает кумулятивным эффектом. В результате, чем большая концентрация фенобарбитала воздействует на организм, тем тяжелее последствия такого воздействия. Так, при сравнительно легких отравлениях фенобарбиталом артериальное давление снизиться до 100—90/60—50 мм рт.ст. (рис.4), а при более тяжелых отравлениях - до 80—60/60—40 мм рт. ст. и ниже. Сопровождается снижение артериального давления тахикардией (до 100—120 ударов в минуту), в какой-то степени компенсирующей нарушения гемодинамики [7]. Рис.4. Зависимость доза-ответ для фенобарбиталаПри частичном сохранении регуляторных у больных механизмов, наблюдаемых при отравлениях средней тяжести, компенсаторно может повыситься периферическое сопротивление сосудов, препятствующее дальнейшему падению артериального давления. Однако при тяжелых формах отравления фенобарбиталом эти компенсаторные механизмы нарушаются, а периферическое сопротивление сосудов остается низким, еще больше нарушая гемодинамику [11, c.55]. 2.4 Сочетанные воздействия с физическими факторами средыРаспределение в организме рассматриваемого ксенобиотика происходит несколько медленнее, чем прочих веществ, относящихся к барбитуратам. Это происходит вследствие наименьшей липофильности фенобарбитала (за счет добавленного в структуру фенильного заместителя). Связывание молекул препарата с белками плазмы варьируется от низкого до умеренного. Метаболизм главным образом протекает в печени при участии микросомальных ферментов. Являясь слабой кислотой, фенобарбитал очень быстро всасывается в желудке и тонкой кишке. При этом натриевая соль всасывается быстрее, чем свободный фенобарбитал. Фенобарбитал достаточно долго сохраняется в крови, поэтому с течением времени концентрация ксенобиотика в крови и мозге уравновешивается, после чего происходит дальнейшее его достаточно интенсивное перераспределение в другие ткани, поэтому концентрация фенобарбитала в ЦНС снижается и нервная система начинает восстанавливаться первой.В фенобарбитале, как уже было сказано, боковые цепи в позиции 5-го атома углерода подвергаются окислению. Образующиеся при этом спирты, кетоны и кислоты, как правило, малоактивны, не взаимодействуют с белками и выводятся из организма. Однако окисление протекает намного медленнее, чем перераспределение фенобарбитала в ткани.3 ТОКСИКОКИНЕТИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ3.1 Токсикокинетические модели при оценке токсичностиФенобарбитал – препарат, среднерастворимый в жирах, поэтому для описания токсического действия данного препарата хорошо применима следующая модель. Длительность действия препарата определяется в первую очередь перераспределением, а не метаболизмом, либо элиминацией. Так, несмотря на большую связанность фенобарбитала с белками (40-50 %), поглощение его головным мозгом в силу высокой жирорастворимости и большого количества неионизированной фракции (~60 %) достигает максимальных значений уже через 30 минут после введения. Если объем центральной камеры несколько уменьшен (к примеру, при гиповолемическом шоке), либо в сыворотке снижена концентрация альбумина (при тяжелой болезни печени), либо увеличена неионизированная фракция (к примеру, при ацидозе), то при той же дозе концентрация препарата в сердце и головном мозге возрастает. Перераспределение препарата в периферическую камеру (главным образом в мышечную группу) приводит к уменьшению концентрации препарата, которая через 20-30 мин после введения составляет 10 % от пиковой (рис. 5). Доза фенобарбитала зависит от возраста и массы тела. Дозу в преклонном возрасте следует снизить, так как является отражением более высокой пиковой концентрации вследствие замедленного распределения. Период полусуществования фенобарбитала в фазе элиминации довольно длителен, поэтому отравление им носит тяжелый характер. Повторное введение фенобарбитала способствует насыщению периферических камер, перераспределение отсутствует и продолжительность действия в свою очередь становится более зависима от элиминации [7, 8].3.2 Кривые концентрация-время, AUC для ксенобиотикаПосле приема внутрь фенобарбитал полностью, но медленно всасывается в тонком кишечнике. Общая биодоступность составляет 80%. Связывание с белками плазмы (преимущественно с альбумином) составляет 20-45%. Терапевтическая концентрация в сыворотке крови, оптимальная для проявления противосудорожного эффекта, составляет 10-40 мкг/мл. T1/2 из плазмы у взрослых — 53-118 ч (в среднем 79 ч), у детей и новорожденных (возраст менее 48 ч) — 60-180 ч, в среднем 110 ч. Распределяется по органам и тканям, проходит через гематоэнцефалический барьер (ГЭБ). При приеме беременными, фенобарбитал хорошо проходит через плаценту (с повышением концентрации эффект усиливается) и распределяется по всем тканям плода (наивысшие концентрации обнаруживаются в плаценте, печени и головном мозге плода), проникает в грудное молоко. Метаболизируется фенобарбитал в печени при участии микросомальных ферментов с образованием фармакологически неактивных метаболитов. T1/2 — 2-4 дня (у новорожденных до 7 дней). Экскретируется почками в виде глюкуронидов метаболитов и в неизмененном виде (25-50%). Выведение препарата почками зависит от pH мочи: при подщелачивании мочи увеличивается выведение в неизмененном виде и быстрее снижается концентрация в крови, при подкислении — наоборот. Для фенобарбитала характерна выраженная кумуляция. При полной или частичной дисфункции почек токсиканта действие заметно пролонгируется [7].Рис.6. Зависимость концентрация-время для фенобарбитала3.3 Период полувыведения, объем распределения и клиренс ксенобиотикаРаспределение фенобарбитала у детей происходит быстро и в большом объеме. Это, скорее всего, обусловлено липофильными свойствами вещества. В литературе описан объем распределения, по одним источникам равный 0,6-1,2 л/кг, а по другим - 0,9-1,0 л/кг. Корреляция между гестационным возрастом и объемом распределения не наблюдается. Объем распределения у четырехмесячных младенцев существенно не отличается от значения для новорожденных, но с 4 до 12 месяцев этот показатель составляет 0,57 л/кг, а у детей старше 12 мес. — 0,67 л/кг при значении 0,6-0,75 л/кг у взрослых. Клиренс фенобарбитала у взрослых составляет 0,062±0,013 мл/(мин.кг).Период полураспределения фенобарбитала у младенцев составляет приблизительно 1,3 ч после внутривенного введения. Концентрация в тканях мозга находится в линейной зависимости от концентрации в сыворотке: соотношение концентраций фенобарбитала в мозге и плазме равно 0,71±0,21, что примерно одинаково и у младенцев, и у взрослых. Соотношение несколько повышается с повышением гестационного возраста, но здесь возможны варианты. Описаны одинаковые концентрации фенобарбитала в сером и белом веществе мозга [7, 8].У младенцев в возрасте от 1 до 8 дней фенобарбитал связывается с белком на 10-30% (у взрослых — на 45-50%). В результате в мозг новорожденного поступают более высокие концентрации свободного фенобарбитала в сравнении с мозгом взрослого. Соотношение концентраций общего фенобарбитала в тканях мозга и в плазме крови равно 0,67±0,2, а соотношение концентраций свободной фракции фенобарбитала в тех же средах равно 0,82±0,002, следовательно, основная масса свободного фенобарбитала у младенцев проникает через ГЭБ [7].Фенобарбитал гидроксилируется микросомальной системой Р-450 до неактивного метаболита β-гидроксифенобарбитала. У новорожденных и взрослых 16-17% дозы экскретируется в неизмененном виде и 9-10% в виде β -гидроксиметаболита. Однако существенные различия все же имеются. Так, у взрослых с мочой экскретировалось 15% конъюгированного с глюкуронидами метаболита, а у новорожденных отмечается недостаточная способность к гидроксилированию фенобарбитала. Экскреция с мочой неизмененного фенобарбитала зависит от pH и может повышаться в щелочной моче, экскретируемой новорожденными.У недоношенных новорожденных значение печеночного клиренса фенобарбитала и его периода полувыведения равно соответственно 4,7 мл/кг.ч и 141 ч соответственно. В литературе отмечают обратную зависимость T1/2 от постнатального возраста. Так, T1/2 равен 115 ч у детей в возрасте 1 недель и 67 ч у младенцев в возрасте 4 недель. У новорожденных с асфиксией период полувыведения может быть удлинен до 148±55 ч.3.4 Механизмы биотрансформацииПрактически все барбитураты, в том числе и фенобарбитал, биотрансформируются до неактивных метаболитов, которые затем выводятся с мочой. Известно 4 основные пути метаболизма этих веществ (рис.7):• окисление заместителей при атоме углерода с образованием спиртов, «реполов, кетонов и карбоновых кислот с последующим частичным преобразованием их в глюкуронилы:• деалкилирование N-алкильных групп;• раскрытие барбитурового кольца между N1- и С6-атомами [6, c.622].Рис.7. Схема биотрансфомаций фенобарбитала 4 ВОПРОСЫ АНАЛИТИЧЕСКОЙ ТОКСИКОЛОГИИ4.1 .Методология проведения клинико-токсикологического анализа4.1.1 Отбор проб биоматериала у живых лиц или извлечение органов и тканей из трупаУ живых лиц практикуется анализ крови и мочи на фенобарбитал. Выделение барбитуратов из биологических жидкостей таких, как моча и кровь, обычно проводятся в несколько этапов: разрушение конъюгатов анализируемых веществ если это необходимо, выделение аналита и его метаболитов из образна, проведение лернватизаини, если это необходимо. Материалом для исследования является сыворотка крови [5, c. 121]. Для исследования отбирается образец венозной крови перед получением очередной дозы препарата. Первое измерение концентрации препарата проводится через 2 часа после внутривенного (начального) введения препарата, а в дальнейшем - через 3-4 недели после начала лечения. Также контрольные исследования препарата в крови выполняются при:изменении дозы фенобарбитала;введении другого антиэпилептического препарата в курс лечения;проявления признаков интоксикации;возобновлении эпилептических припадков;при беременности через каждые 2-4 недели.Интерпретация результатов определения концентрации барбитуратов в плазме крови обычно проводится с осторожностью, так как их токсические эффекты зависят от большого числа факторов, включающих индивидуальные особенности организма, например, степень толерантности или наличие в организме других психоактивных вешеств, (таких как этанол, наркотики) и заболевания дыхательных систем. Эти факторы обычно повышают концентрацию барбитурата до токсической.Извлечение фенобарбитала также производится из мочи. Как вещества кислотного характера, производные барбитуровой кислоты извлекаются из биологических объектов при рН = 1 — 2 хлороформом, смесью хлороформ — изопропанол (9:1) или диэтиловым эфиром. Так как многие метаболиты выводятся из организма в виде глюкуронидов, в анализе следовых количеств барбитуратов рекомендуется для повышения предела обнаружения метаболитов проведение предварительного кислотного гидролиза биологических объектов с последующей жидкость-жидкостной экстракцией.Слюна, пот и волосы явлтяются атьтернативными объектами исследования по сравнению с традиционными объектами — мочой и кровью. Исследование таких объектов стало возможным после внедрения в практику современных высокочувствительных методов. Эти объекты по сравнению с кровью и мочой отличаются значительно меньшим количеством биоматериала. который можно отобрать у конкретною человека. Концентрация определяемых веществ в них гораздо ниже по сравнению с мочой, а интервал времени, в течение которого можно детектировать барбитураты в слюне и ноте, узок. Исследование слюны применяется при изучении токсикокинетики барбитуратов. Пот как объект исследования имеет ряд преимуществ при расследовании причин отравления, а также тестировании лиц на прием наркотиков. Волосы — это единственный объект, позволяющий проводить исследование динамики потребления вещества в течение длительного времени. Слюна может отбираться несколькими способами: на какой-либо носитель — вату, марлю, парафин, тефлон, жевательную резинку или с помощью специального устройства для отбора слюны. Образцы пота отбираются на марлевый или ватный тампон, смоченный спиртом, или с помощью специальных устройств. Далее эти объекты исследуются аналогично слюне [6, c. 626].Особенностью исследования волос на барбитураты, как и на другие вещества, является необходимость перед выделением из них аналитов промывки внешней поверхности. Она необходима для удаления потожировых выделений, а также остатков веществ, выделившихся с потом. Такую промывку осуществляют в несколько этапов с применением воды и органических растворителей, например ацетона, эфира, дихлорметана. толуола. Чаще всего промытые волосы гомогенизируют различными способами и проводят либо энзиматический с применением глюкуронидазы/арилфосфатазы, либо кислотный гидролиз. Экспериментальные исследования воздействия фенобарбитала на организм часто проводятся на беспородных белых крысах массой тела от 100 до 250 г и беспородных кошках массой от 2 до 6 кг. Животным через зонд перорально вводится фенобарбитал, в виде чистого порошкообразного вещества, разведенного водой до кашицеобразной массы. В цитируемой работе 160 крысам вводилось по 500 мг/кг фенобардитала в расчете на массу животного. Выживших животных забивали через 1, 4, 7, 10 суток. Кусочки головного мозга, сердца, печени, легких, почек брались для гистологического исследования. Непосредственно химическому исследованию подвергались сердце, головной мозг, почки, печень, легкие, мышцы, желудок с содержимым и кишечник [3].По поводу сохраняемости барбитуратов и, в частности, фенобарбитала, в трупном, загнившем материале, следует отметить, что соединения данной группы достаточно стабильны при низкой степени извлечения. Для исследования берутся сохранившиеся органы (печень, желудок, почки, сердце, кишечник), мышцу или жировоск. В таблице 1 приведены данные по нескольким барбитуратам и, как можно увидеть, фенобарбитал остается в трупном материале весьма длительное время [4, c.162].Таблица 1. Сохраняемость барбитуратовв гнилостном материале [4, c.162]4.1.2 Изолирование ксенобиотика 1) Изолирование барбитуратов водой, подкисленной щавелевой кислотой. Согласно этому способу, в коническую колбу или стакан вносят 100 г тщательно измельченных органов трупов, прибавляют 200 мл волы, подкисляют насыщенным водным раствором щавелевой кислоты до рН 2.0 (по универсальному индикатору) и оставляют на 2 ч при частом перемешивании.