Сравнительное изучение различных методов окраски спор бактерий.

СОДЕРЖАНИЕ
ВВЕДЕНИЕ
1.ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ
1.1.Споры и их функция в жизненном цикле микроорганизмов
1.2. Эндоспоры
1.3.Экзоспоры
2. ПРАКТИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ
2.1.Изготовление мазка
2.2.Окраска эндоспор
2.2.1.Окрашивание эндоспор по методу Вайсера—Хьюппе
2.2.2.Окрашивание эндоспор по методу Меллера
2.2.3. Окрашивание эндоспор малахитовым зеленым по методу Шеффера-Фултона
2.2.4.Окрашивание эндоспор по методу Ожешки (Ауески)
2.2.5. Окрашивание эндоспор по методу Битгера
2.3.Окраска экзоспор по Шеффер-Фултону
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Сравнительное изучение различных методов окраски спор бактерий.

Экзоспоры актиномицетов являются покоящимися клетками и одновременно репродуктивными структурами. Стенка споры обычно значительно толще, чем стенка гифы, и в ней можно различить несколько слоев разной электронной плотности. Часто клеточная стенка окружена дополнительными наружными покровами. Экзоспоры большинства актиномицетов не содержат каких-либо дополнительных внутренних структур помимо тех, которые наблюдаются в вегетативной клетке.
Экзоспора гидрофобна, термоустойчива, не проявляет дыхательной активности. Смачивающаяся активированная спора проявляет активность ферментов, при этом начинается дыхание и синтез РНК. Спора разбухает
Выход 1-3 (реже 4) ростовых трубок, начинается синтез ДНК. Эта стадия необратима, остальные три – обратимы. 14
2. Практическая часть
2.1.Изготовление мазка
Поскольку окрашивание спор проводится только в мазках, прежде чем приступать к работе следует изготовить препарат такого типа. 15
Работу проводили, соблюдая правила стерильности.
Необходимое оборудование:
1. Спиртовка
2. Микробиологическая петля
3. Пробирка с культурой
4. Обезжиренное предметное стекло.
Перед работой необходимо простерилизовать петлю. Для этого её вертикально внесли в верхнюю (наиболее горячую) часть пламени спиртовки и держали, пока она не раскалилась докрасна. После этого её вынесли из пламени и охладили на воздухе в вертикальном положении. Процедуру повторили 3 раза.
Пробирку следует держать в левой руке, пробку открывать в радиусе 10 сантиметров от пламени спиртовки. Все манипуляции с открытой пробиркой могут производиться только в этом пространстве. Микробиологическую петлю вводили в пробирку правой рукой. Чтобы достаточно охладить петлю после стерилизации в пламени можно прикоснуться ею к стенке пробирки. После этого из культуры взяли каплю материала. Петлю вынесли из пробирки, пробирку закрыли в пламени спиртовки и поместили в штатив.
Взятый из культуры материал нанесли на обезжиренное предметное стекло и распределили по нему. Обезжиривание стекла производили непосредственно перед работой. Для этого участок стекла, на который впоследствии был нанесён препарат, обработали мылом и протерли марлей. Для полного обезжиривания можно так же прожигать стёкла в пламени горелки. После нанесения препарата на стекло оставшиеся на микробиологической петле организмы были уничтожены. Это было произведено путём однократной стерилизации петли в пламени спиртовки.
2.2.Окраска эндоспор
2.2.1.Окрашивание эндоспор по методу Вайсера—Хьюппе
Необходимое оборудование и реактивы:
1. Мазок культуры B. subtillus в стационарной фазе роста
2. Раствор карболового фуксина
3. Для приготовления 1 г основного фуксина растворить в 2 мл глицерина и долить до 100 мл 5 % раствором фенола.
4. Так же можно применить следующую пропись: в 50 мл спирта растворить 25 г фенола, а затем 5 г основного фуксина и долить дистиллированной водой до 500 мл.
5. 2,5% раствор серной кислоты
6. 96° раствор этилового спирта
7. Раствор метиленового синего
8. Вода
9. Термостат 37 °С
Ход работы:
1. Был приготовлен мазок препарата, как описано выше.
2. На мазок было нанесено несколько капель раствора карболового фуксина (можно использовать фуксин на анилиновой воде), окрашивание проводилось в термостате при 37 °С в закрытой посуде в течение нескольких часов.
3. Препарат обесцвечивали 2,5 % раствором серной кислоты в течение 3 — 5 с и сполоснули 96 % спиртом, до тех пор, пока в раствор не перестали переходить облачка красителя.
4. Препарат был докрашен метиленовым синим в течение 3 — 5 мин.
5. После докрашивания препарат ополоснули в проточной воде и высушили на воздухе. Микроскопию проводили при масляной иммерсии.
Возможна модификация процесса на стадии окрашивания фуксином, позволяющая ускорить процесс приготовления препарата. В этом случае окрашивание производится только карболовым фуксином. Мазок, покрытый красителем, следует подогревать на огне до появления паров в течение 5 — 8 мин. При использовании данного подхода обесцвечивание проводится 10 – 20 секунд в 2,5 % серной кислоте.
Результат окрашивания:
Эндоспоры окрасились в красный цвет, бактерии – в синий.
2.2.2.Окрашивание эндоспор по методу Меллера
Необходимое оборудование и реактивы:
1. Мазок культуры B. subtillus в стационарной фазе роста
2. 5% водный раствор хромовой кислоты
3. Раствор карболового фуксина
4. 5% раствор серной кислоты
5. Раствор метиленового синего
6. Вода
7. Газовая горелка
Ход работы:
1. Зафиксированные мазки были помещены на 2 минуты в хлороформ.
2. Обработанные таким образом мазки были перенесены в 5 % водный раствор хромовой кислоты на 2 — 10 минуты.
3. Препарат был промыт в проточной воде и окрасить карболовым фуксином. Для этого на стекло нанесли несколько капель красителя. Окрашивание проводили в течение 1 минуты (стекло при этом подогревали на горелке до появления паров).
4. Препарат был обесцвечен в 5 % растворе серной кислоте в течение 5 с.
5. Препарат тщательно промыли в проточной воде и подкрасили водным раствором метиленового синего в течение 3 минут.
6. Препарат промыли в проточной воде ещё раз и высушли на воздухе
7. Микроскопию препарата проводили при масляной иммерсии.
Результат окрашивания:
Эндоспоры приобрели красный цвет, вегетативные клетки бактерий окрасились в синий.
2.2.3. Окрашивание эндоспор малахитовым зеленым по методу Шеффера-Фултона
Необходимое оборудование и реактивы:
1. Мазок культуры B. subtillus в стационарной фазе роста
2. 1% водный раствор сафранина
3. 5% раствор малахитового зелёного
4. Вода
5. Спиртовка
Ход работы:
1. Мазки культуры были зафиксированы над огнем.
2. Препарат был окрашен 5 % водным раствором малахитового зеленого в течение 5—10 мин.
3. Препарат промывали в проточной воде.
4. Было произведено докрашивание препарата 1 % водным раствором сафранина в течение 30 с.
5. Стекло промыли водой, и высушили на воздухе
6. Препарат изучали под микроскопом с использованием масляной иммерсии.
Результат окрашивания:
Эндоспоры окрасились в зелёный цвет, клетки бактерий – в красный (препарат окрашенный по этой методике представлен на рис 3).
Рисунок 3. Bacillus subtillus, окраска по Шефферу-Фултону
2.2.4.Окрашивание эндоспор по методу Ожешки (Ауески)
Необходимое оборудование и реактивы:
1. Мазок культуры B. subtillus в стационарной фазе роста
2. 0,5 % раствор соляной кислоты
3. Фильтровальная бумага
4. Раствор карболового фуксина
5. 1% солянокислый спирт
6. Метиленовым синий Лефлера
7. Вода
8. Спиртовка
Ход работы:
1. Для работы был приготовлен мазок культуры. Для дальнейшей работы использовался нефиксированный мазок.
2. На мазок налили 0,5 % раствор соляной кислоты и подогрели стекло над огнем 1 — 2 минуты. Затем слили с препарата кислоту и тщательно промыть проточной водой, высушить на воздухе.
3. После высыхания мазок был зафиксирован в пламени. Фиксированный препарат окрашивали по методу Циля — Нильсена, описанному ниже.
4. Этот метод применяется для окраски кислотоустойчивых бактерий, в том числе микобактерий туберкулёза.
5. Налили на фиксированный мазок карболового фуксина (окрашивание производилось через фильтровальную бумагу) и подогрели стекло над пламенем спиртовки до появления паров. Эту температуру поддерживали в течение 1—2 минут, не доводя до кипения.
6. Слили краску со стекла, удалили фильтровальную бумагу и тщательно промыли препарат в водопроводной воде.
7. Обесцветили препарат 1% солянокислым спиртом (раствором соляной кислоты в 70° спирте) до тех пор, пока мазок не принял бледно-розовый тон (примерно 30—60 секунд).
8. Препарат промывали в воде 15-30 секунд.
9. Докрашивание препарата производили метиленовым синим Лефлера 15-30 секунд. Затем мазки ополоснули 70° спиртом.
10. Сполоснули препарат в воде и высушили фильтровальной бумагой.
11. Препарат изучали под микроскопом с использованием масляной иммерсии.
Результат окрашивания:
Вегетативные клетки бактерий приобрели красную окраску, эндоспоры – синюю.
2.2.5. Окрашивание эндоспор по методу Битгера
Необходимое оборудование и реактивы: