Газовая хроматография в современной микробиологии.

СОДЕРЖАНИЕ
Стр.
Введение
1. Оборудование для газовой хроматографии
2. Анализ жирных кислот и микроорганизмов
3. Пиролиз микроорганизмов
4. Гидролиз и экстракция компонентов микробных клеток
5. Применение газовой хроматографии для диагностики заболеваний человека
Заключение
Литература

Газовая хроматография в современной микробиологии.

Рисунок 2. Принципиальная схема газового хроматографа [2]: 1 — баллон с инертным газом; 2 — устройство для ввода пробы в хроматографическую колонку; 3 — хроматографическая колонка; 4 — термостат; 5 — детектор; 6 — преобразователь сигналов; 7 — регистратор.
Газовые хроматографы поставляются только в составе хроматографических комплексов, позволяющие оптимально выполнять требуемые задачи. В состав комплексов входит основное оборудование (хроматограф, хроматографические колонки, устройства ввода и пробоподготовки, программное обеспечение) и доп. оборудование (газовая арматура, блоки фильтров, компрессор воздуха, генератор водорода, ЭВМ).
Газовые хроматографы комплектуются различными детекторами, позволяющими расширить круг исследуемых объектов. Пламенно-ионизационный детектор позволяет определять почти все органические соединения. Термоионный детектор селективен к фосфор- и азотсодержащими соединениям. Электронозахватный детектор селективен к галойд- и кислородсодержащим соединениям. Детектор по теплопроводности обычно применяют для анализа газовых смесей и летучих неорганических соединений. Пламено-фотометрический детектор селективен к фосфор- и серосодержащим соединениям. Фотоионизационный детектор применяют для анализа газовых смесей и летучих органических соединений.
В качестве подвижной фазы используют водород, гелий, азот, аргон, углекислый газ. Газ-носитель не реагирует с неподвижной фазой и разделяемыми веществами. Газовый хроматограф оборудован регулятором расхода газа, который контролирует расхода газа в системе, а также поддерживает необходимое давление газа на входе в систему. Обычно в качестве регулятора расхода газа используются редуктор или дроссель.
Устройство ввода пробы - редназначено для подачи пробы анализируемой смеси в хроматографическую колонку. В том случае, если хроматограф предназначен для анализа жидких проб, устройство ввода проб совмещается с испарителем. Проба вводится в испаритель при помощи микрошприца путём прокалывания эластичной прокладки. Испаритель обычно нагрет до температуры, превышающей температуру самой колонки на 50 °C. Объём вводимой пробы — несколько микролитров.
Хроматографические колонки. Под колонкой подразумевается сосуд, длина которого значительно больше диаметра. Для газовой хроматографии обычно используют U-образные или спиральные колонки. Внутренний диаметр колонок — 2-15 мм, а длина — 1-20 м. Материалом для изготовления колонок служит стекло, нержавеющая сталь, медь, иногда фторопласт. В последнее время наибольшее распространение получили капиллярные колонки изготовленные из плавленного кварца, с нанесенной внутри неподвижной фазой. Длина подобных колонок может достигать сотен и даже тысяч метров, хотя чаще используются колонки длиной 30-50 м. Крайне важно плотное наполнение колонок неподвижной фазой, а также обеспечение постоянства температуры колонки в течение всего процесса хроматографирования. Точность поддержания температуры должна составлять 0,05-1°C. Для точного регулирования и поддержания температуры используют термостаты.
Важное значение в газовой хроматографии имеет температура. Ее роль прежде всего заключается в изменении сорбционного равновесия в системе газ - твердое тело. От правильного подбора температуры колонки зависит, и степень разделения компонентов смеси, и эффективность колонки, и общая скорость анализа. Существует некоторый температурный интервал колонки, в котором хроматографический анализ оптимален. Обычно этот температурный интервал находится в области, близкой к температуре кипения определяемого химического соединения. Когда температуры кипения компонентов смеси сильно различаются между собой, применяют программирование температуры колонки.
2. Анализ жирных кислот и микроорганизмов
В анализе липидов, в особенности жирных кислот, газовая хроматография произвела настоящий фурор и по сей день не имеет достойной альтернативы. Газохроматографический анализ карбоновых кислот, выполненный Джеймсом и Мартином стал первым анализом, осуществленным при помощи газовой хроматографии [3]. В процессе метаболизма микробные клетки создают ряд низших карбоновых кислот, причем этот набор кислот представляет собой как бы визитную карточку того или иного микроорганизма.
Газовая хроматография применяется для анализа компонентов микробных клеток и их метаболических продуктов. Использовавшиеся ранее стандартные методы идентификации микроорганизмов, которые являлись возбудителями инфекционных заболеваний или гнойно-воспалительных процессов включали в себя несколько этапов: посев на питательные среды биологического материала; получение чистых культур, состоящих из одинаковых микробов, в особо стерильных условиях, выращивание их на средах обогащения в течение некоторого времени и лишь далее их идентификацию по типу характера разрушения тех или иных субстратов. Даже микроорганизмы, которые обладают способностью к быстрому росту давали следующий этап для исследования не менее через двое суток. При помощи же газовой хроматографии стало возможно проводить ускоренную (менее 2-х часов) идентификацию микроорганизмов по спектру специфических компонентов их мембран или специфическим продуктам пиролиза и гидролиза клеточных препаратов.
3. Пиролиз микроорганизмов
Микроорганизмы, так же как и другие клетки, при пиролизе с использованием тщательно контролируемых параметров нагрева дают газообразные продукты термической деградации. Эти фрагменты можно непосредственно анализировать, используя газовую хроматографию, с целью получения легко распознаваемых хроматограмм различных микробных родов, видов внутри родов или даже различных штаммов внутри видов.
В литературе существует ряд примеров, когда исследователи микроорганизмов получили с помощью пиролитической газо-жидкостной хроматографии (ПГЖХ) результаты, характеризующиеся превосходной качественной и количественной воспроизводимостью [4].
4. Гидролиз и экстракция компонентов микробных клеток
Микроорганизмы содержат большой набор химических соединений в материале капсулы, клеточных стенках, цитоплазме, которые можно экстрагировать различными растворителями, гидролизовать кислотой или основанием и превратить в летучие производные. Классификация микроорганизмов по их химическому составу предложена в работе [4]. Эти исследователи экстрагировали и переэтерифицировали липиды отдельных видов различных бактериальных семейств и получили характерные для каждого из этих видов хроматограммы.
Методом газовой хроматографии могут быть качественно и количественно определены различные компоненты – жирные кислоты, липиды, углеводы, аминокислоты, аминосахара, компоненты нуклеиновых кислот и другие макромолекулы микроорганизмов. Газохроматографический анализ применим не только для идентификации организмов, но и для диагностики заболевания.
С помощью газовой хроматографии удалось разработать методику диагностики болезней, вызванных анаэробными инфекциями, в частности, газовой гангрены.
А.Г. Витенбергом с соавт. [1] разработан парофазный анализ летучих жирных кислот для быстрого обнаружения анаэробов при инфекциях. Метод может быть использован для идентификации отдельных видов анаэробных бактерий. Сущность парофазного анализа (ПФА) состоит в том, что газохроматографический анализ проводят, исследуя не сам образец, а находящуюся с ним в контакте газовую фазу, насыщенную летучими компонентами анализируемого образца. Отличительной особенностью метода является предельно простая процедура подготовки биологического материала к исследованию и автоматическое введение пробы в хроматограф. Методика предусматривает использование отечественного оборудования и включает несколько несложных операций. Исследуемый образец помещается в стеклянный флакон (типа пенициллинового), к нему добавляется минеральная соль – бисульфат калия, создающая в анализируемом растворе кислую среду. Далее флакон герметизируется стандартной резиновой пробкой и выдерживается 15–20 мин при температуре 90 °С. После этого насыщенный летучими веществами газ из флакона с помощью специального пневматического дозатора вводится в хроматограф. Расшифровка результатов анализа производится по наличию или отсутствию на хроматограмме пиков летучих жирных кислот.
Определение химического состава жирных кислот тех или иных липидов является чрезвычайно мощным инструментом в познании структуры и функций биологических мембран, а также процессов внутриклеточного метаболизма. Энергетическое обеспечение клетки осуществляется в так называемом цикле трикарбоновых кислот – цикле Кребса.
Проблема определения спектров карбоновых кислот цикла Кребса газохроматографическим методам поспособствовало внесению существенного вклада в понимание процессов внутриклеточного метаболизма при разного рода патологических состояниях [2].
5. Применение газовой хроматографии для диагностики заболеваний человека
С развитием биологии и медицины произошло понимание того, что человеческий организм является своеобразным микрокосмом, так зародилась новая наука – микробная экология человека. Человеческий организм - это особая система сложных локальных экосистем. С нарушением экологического равновесия в любой из этих систем происходят весьма серьезные последствия. Наиболее ярким примером является кишечный дисбактериоз. При нарушении равновесия в системе микробы кишечника – организм-хозяин изменяется сам характер пищеварения. В стандартной норме у человека белки и углеводы перевариваются и всасываются в тонкой кишке, которая в физиологических условиях почти стерильна (от 105 до 108 микробов на 1 г содержимого), а грубая растительная клетчатка попадает в толстую кишку, где подвергается воздействию ферментных систем анаэробных микроорганизмов. Количество микробных тел в толстой кишке на два порядка превышает общее число клеток человеческого организма. Образовавшиеся в процессе переваривания клетчатки карбоновые кислоты выполняют важные для организма функции: питание клеток эпителия толстой кишки, угнетение канцерогенеза (то есть ракового перерождения) в клетках кишечного эпителия, регуляцию микробного биоценоза. При наличии дисбактериоза происходит то, что анаэробные микроорганизмы заселяют тонкую кишку, утилизируют питательные компоненты и лишают организм питания, при этом повреждая нежную слизистую оболочку тонкой кишки своими мощными ферментными системами. Осуществление контроля дисбактериоза традиционными бактериологическими средствами не представляется возможным. Даже на выполнение одного тщательного обследования на дисбактериоз потребуется свыше года трудозатрат в человекочасах. Альтернатива этому исследованию – установление спектра карбоновых кислот в кишечном содержимом методом газовой хроматографии как интегрального показателя микробного состояния кишечника [2].
Газохроматографический анализ жирных кислот позволяет также проводить быструю диагностику так называемых пероксисомных заболеваний, которые были открыты сравнительно недавно и представляют собой семейство наследственных патологий. Пероксисомы – мельчайшие органеллы (части тела клеток), обнаруженные более четверти века назад.