Бактериоскопия в клинической лабораторной диагностике

Оглавление

ВВЕДЕНИЕ
1.СТРОЕНИЕ БАКТЕРИАЛЬНОЙ КЛЕТКИ. ФОРМЫ БАКТЕРИЙ
2.ОРГАНИЗАЦИЯ РАБОТЫ БАКТЕРИОСКОПИЧЕСКОЙ ЛАБОРАТОРИИ И ОБОРУДОВАНИЕ
3.МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ ПРЕПАРАТОВ
4.ОБЩИЕ БАКТЕРИОСКОПИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
5.БАКТЕРИОСКОПИЯ РАЗНЫХ ТИПОВ БИОЛОГИЧЕСКИХ ОБРАЗЦОВ
6.ДИФФЕРЕНЦИАЦИЯ ПРИ БАКТЕРИОСКОПИИ МИКРООРГАНИЗМОВ РАЗНЫХ ВИДОВ
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Бактериоскопия в клинической лабораторной диагностике

Техника бактериоскопии
Для получения отличного качества при бактериоскопическом исследовании необходимо иметь хороший микроскоп и удобное рабочее место. Просмотр препаратов должен быть систематизирован и стандартизован, что обеспечит исследование достаточно большой (репрезентативной) части препарата. Чтобы не исследовать одни и те же участки по несколько раз, необходимо просматривать препарат в определенном порядке. Для этого рекомендуется следующая методика.
•При исследовании препаратов, окрашенных карболфуксином, всегда используйте масляный иммерсионный объектив с увеличением 100х.
•Так как со временем флуоресцентная окраска может поблекнуть, исследуйте препараты в течение 24 часов после окраски. Если препараты невозможно микроскопировать непосредственно после окрашивания, их можнохранить в темном месте, желательно в холодильнике, но не более 24 часов.
•По мере возможности, ежедневно просматривайте достоверно положительные и достоверно отрицательные препараты. Положительный контроль используется для контроля качества красителей и методики окраски. Отрицательный контроль подтверждает, что краски и растворы красителей не контаминированы кислотоустойчивыми микроорганизмами.
•Методично просматривайте препарат вдоль предметного стекла. После осмотра одного поля зрения передвиньте препарат по продольной оси, чтобы исследовать соседнее поле зрения, находящееся справа. Тщательно просматривайте каждое поле зрения.
•Прежде чем дать отрицательный ответ, необходимо просмотреть не менее 100 полей зрения. У опытного микроскописта эта процедура займет около 5 минут. В объекте размером 1,5 см на 1,5 см количество полей зрения по длине стекла составляет около ста. Если в препарате содержится среднее или большое количество кислотоустойчивых микобактерий, то положительный результат можно выдать после исследования меньшего количества полей зрения.
•После окончания исследования уберите препарат с предметного столика, погрузите его в ксилол, чтобы удалить иммерсионное масло, а затем положите в коробку с просмотренными препаратами.
•Перед исследованием следующего препарата протрите иммерсионный объектив.
•При микроскопировании могут быть обнаружены неожиданные объекты. Если эти объекты сдвигаются при перемещении предметного стекла, то это могут быть частицы, случайно оказавшиеся в исследуемом материале или преципитаты фиксаторов или красителей; это могут быть и загрязнения из красителей или иммерсионного масла.
•Объекты, которые сдвигаются при повороте окуляра, находятся в самом окуляре или на его линзах. Артефакты могут быть также обусловлены частицами, которые находятся на линзах конденсора, зеркале или источнике света.
•Сохраняйте все препараты в соответствии с установленными правилами, так как они могут потребоваться для проведения внешнего контроля качества
•Анализируйте результаты своих исследований еженедельно или ежемесячно, чтобы иметь представление о частоте получения положительных результатов. Если при этом обнаружите значительные отклонения от нормы, постарайтесь определить причину этого.
4. Общие бактериоскопические методы исследования
Окраска препаратов
Окраска метиленовым синим
Реактивы. 1% раствор метиленового синего (1 г метиленового синего растворяют в 100 мл холодной дистиллированной воды, фильтруют через бумажный фильтр).
Ход исследования. Материал наносят на чистые обезжиренные предметные стекла, растирают его тонким равномерным слоем по поверхности стекла, или на обезжиренное стекло наносят каплю воды, в которой суспендируют культуру. Препарат высушивают на воздухе и фиксируют погружением на 3 мин. в 96% этиловый спирт.
Фиксированный препарат высушивают, затем наносят 1% раствор метиленового синего на 1-10 мин. (в зависимости от материала).
Тщательно смывают оставшийся краситель струей холодной воды, высушивают. Смотрят с иммерсией: объектив х90 иммерсионный, окуляр х7 или х10.
Оценка результатов. Препарат синего цвета. Ядра клеток окрашены в синий цвет, протоплазма - в голубой цвет разной интенсивности. Бактериальная флора прокрашивается в синий цвет разной интенсивности.
Окраска по Граму
Принцип. В зависимости от химической структуры бактерии обладают способностью удерживать краситель кристаллический фиолетовый или обесцвечиваться в спирте.
Реактивы.
1. Карболовый раствор кристаллического фиолетового. Растирают в ступке 1 г кристаллического фиолетового с 2 г фенола (карболовой кислоты) до кашицеобразной консистенции, прибавляют небольшими порциями 10 мл спирта и окончательно разводят 100 мл дистиллированной воды, сливают во флаконы, оставляют на сутки, затем фильтруют.
2. Раствор Люголя: йодистого калия 2 г растворяют в 300 мл дистиллированной воды, в полученном растворе растворяют 1 г кристаллического йода, фильтруют через бумажный фильтр.
3. Разведенный фуксин Циля. Растирают в ступке 1 г фуксина, прибавляют, растирая, 5 г фенола (карболовой кислоты) и 10 мл спирта 96%, затем при постоянном помешивании небольшими порциями доливают 100 мл дистиллированной воды. Раствор краски фильтруют через влажный бумажный фильтр. Фуксин Циля очень стойкий и может храниться долгое время во флаконе темного стекла с притертой пробкой. К 1 мл фуксина Циля добавляют 9 мл дистиллированной воды. Раствор очень нестойкий, поэтому его готовят непосредственно перед употреблением в необходимых количествах.
Ход исследования. На обезжиренное стекло наносят каплю воды, в которой суспендируют культуру. Препарат высушивают и фиксируют над пламенем горелки. На фиксированный мазок накладывают кусочек фильтровальной бумаги и на нее наливают карболовый раствор кристаллического фиолетового на 1/2-1 мин. Сливают краситель и, не смывая, наливают раствор Люголя на ў 1 мин. до почернения мазка. Сливают раствор Люголя и прополаскивают препарат в спирте 96% в течение 1/2-1 мин., пока не перестанут стекать фиолетовые струйки красителя. Затем препарат промывают струей водопроводной воды и дополнительно докрашивают в течение 1/2-1 мин. водным раствором фуксина Циля. Краситель сливают, препарат промывают и высушивают. Микроскопируют с иммерсией: объектив х90 иммерсионный, окуляр х7 или х10. Грамположительные микробы окрашиваются в сине-фиолетовый цвет, грамотрицательные - в розовый и красный. При правильной окраске препарат оранжево-красного цвета на тонких участках, лилово-фиолетового на толстых. Высокое качество окраски обеспечивается своевременным прекращением обесцвечивания мазков. При недообесцвечивании мазков грамотрицательные бактерии могут сохранять фиолетовую окраску, а в переобесцвеченных мазках грамположительные микробы могут быть окрашены в оранжево-красный цвет.
Окраска по Цилю-Нильсену
Принцип. Метод основан на способности микобактерий туберкулеза после окрашивания их фуксином удерживать краситель даже после длительного обесцвечивания в серной кислоте.
Реактивы.
1. 1% раствор основного фуксина. 1 г основного фуксина растирают с 2-3 каплями глицерина, добавляют по капле 10 мл 96% этилового спирта и 90 мл 5% раствора фенола. Раствор оставляют на сутки, затем фильтруют через бумажный фильтр. Хранят в темном месте при комнатной температуре в хорошо закрытой посуде.
2. 5% раствор фенола (карболовой кислоты).
3. 20% серная кислота.
4. Этиловый спирт 96%.
5. Соляная кислота, концентрированная.
6. 0,025% раствор метиленового синего, 0,25 г метиленового синего на 1 л дистиллированной воды.
7. 3% солянокислый спирт. 3 мл концентрированной соляной кислоты доводят до 100 мл этиловым спиртом.
8. Глицерин.
Ход исследования. Материал готовят путем растирания его между двумя стеклами или на обезжиренное стекло наносят осадок исследуемого материала. Препарат высушивают и фиксируют над пламенем горелки.
Окрашивание мазка. На фиксированный препарат накладывают полоску фильтровальной бумаги размером немного меньше предметного стекла, но так, чтобы она закрывала мазок полностью. Наливают на нее раствор карболового фуксина, и нагревают препарат над пламенем горелки до появления паров. Остудив препарат, снимают пинцетом бумажку и смывают остатки краски водой. Мазок обесцвечивают в 20% серной кислоте или в 3% солянокислом спирте до слегка розовато-сероватого цвета и тщательно промывают водой. Обесцвеченный мазок подкрашивают в течение 30 секунд 0,025% раствором метиленового синего. Микроскопируют с иммерсией. Микобактерии туберкулеза окрашиваются в красный цвет, а другие микробы и клеточные элементы - в голубой.
Окраска по Романовскому
Принцип. Окраска позволяет выявить ядерные элементы и волютиновые гранулы бактериальной клетки за счет сродства к основным краскам.
Реактивы.
1. Краситель Гимзы (готовый реактив).
2. Метиловый спирт или смесь Никифорова (смесь равных объемов этилового спирта и эфира этилового).
3. Дистиллированная вода, рН 7,2.
Ход исследования. Препарат фиксируют метиловым спиртом (смесью Никифорова) 5 мин. Высушивают на воздухе и окрашивают рабочим раствором красителя Гимзы (2 капли на 1 мл дистиллированной воды, имеющей рН 7,2), 20 мин. Промывают дистиллированной водой и после просушивания микроскопируют. При микроскопировании ядерные элементы имеют красно-фиолетовый цвет, цитоплазма - слабо-розовый. В более молодых культурах цитоплазма окашивается в сине-фиолетовый цвет. У бактерийных палочек ядра окрашены в темный красно-фиолетовый цвет, волютин - в вишнево-красный.
5. Бактериоскопия разных типов биологических образцов
Микробиологические методы исследования спинномозговой жидкости
Спинномозговую жидкость исследуют во всех случаях предполагаемого менингита как первичного процесса, так и осложнения после черепно-мозговой травмы, нейрохирургической операции или наличия инфекционного очага в организме. Наиболее частыми возбудителями менингита у новорожденных являются: Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Proteus mirabilis, Serratia marcescens, Enterobacter, Pseudomonas aeruginosa, Streptococcus (гр. В, D), Listeria monocitogenes. У детей раннего возраста: Neisseria meningitidis, Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae, Mycobacterium tuberculosis. У лиц пожилого возраста и ослабленного контингента больных возникновение менингита может быть как результатом заражения N. meningitidis, S. pneumoniae, так и проявлением внутригоспитальной инфекции, вызванной H. influenzae, S. pneumoniae, Salmonella. Этиологическим фактором менингитов, развившихся после черепно-мозговой травмы или как осложнение после нейрохирургических операций, чаще всего являются Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, S. pyogenes, P. aeruginsa, E. coli, K. pneumoniae, S. marcescens. Как правило, менингит вызывается только одним микроорганизмом.
Микроскопия исследуемого материала
Спинномозговую жидкость центрифугируют 5 минут при 3500 об/мин и из осадка делают мазки. Если присланная жидкость мутная, мазки готовят без центрифугирования.
1. При исследовании ликвора с неопределенным возбудителем или на менингококк мазки после высушивания фиксируют на пламени и окрашивают метиленовым синим или по Граму в модификации Калины.
Окраска по Граму в модификации Калины препаратов из ликвора и культур
Приготовление растворов
А. 0,5% спиртовой раствор бриллиантового зеленого:
бриллиантового зеленого 0,05 г;
спирта этилового чистого 10,0 мл.
Хранить во флаконе с резиновой пробкой.
Б. Основной реактив: 0,5% спиртовой раствор йодистого калия - 96 мл; 5% спиртовой раствор основного фуксина - 2 мл; 5% спиртовой раствор йода - 2 мл.
0,5% спиртовой раствор йодистого калия готовят при подогревании в водяной бане. После полного растворения навески йодистого калия в спирте раствор соединяют с раствором фуксина и йода. Полученную смесь хранят во флаконе из темного стекла с притертой или резиновой пробкой.
В. Раствор спирта: спирта этилового 96% - 30 мл; дистиллированной воды - 70 мл.
Г. Водный раствор фуксина: основной фуксин Циля - 1 мл; дистиллированной воды - 9 мл. Раствор готовят ежедневно.
Окраска мазка
На обезжиренное стекло наносят каплю воды. В ней суспендируют культуру и туда же вносят петлей каплю раствора бриллиантовой зелени. После высыхания препарат фиксируют над пламенем. Затем на препарат наливают основной реактив на 1,5-2 минуты, после чего краску сливают и стекло в наклонном положении промывают водой. Далее препарат в наклонном положении промывают в спирте до отхождения облачков краски и немедленно отмывают водой. Затем производят докрашивание препарата водным раствором фуксина в течение 2 минут, окончательную промывку водой и подсушивание. При микроскопировании грамотрицательные бактерии выглядят ярко-розовыми, грамположительные - зеленовато-черными или ярко-розовыми, грамположительные - зеленовато-черными или темно-фиолетовыми. Желательно для контроля на каждом стекле делать мазок культур стафилококков или кишечной палочки.
2. Для обнаружения микобактерий туберкулеза мазки готовят из фибринозной пленки или осадка после центрифугирования. Препарат из фибринозной пленки следует готовить тонким, осторожно растягивая ее слегка подогретой бактериологической петлей или растирая между двумя предметными стеклами. Мазки красят по Цилю-Нильсену.
Результаты микроскопии окрашенного мазка спинномозговой жидкости в ряде случаев позволяют установить наличие туберкулезных бацилл, менингококков или условно-патогенных бактерий, вызвавших гнойный менингит. В соответствии с этими результатами вносят коррективы в ход бактериологического исследования. Результаты микробиологического исследования сообщаются лечащему врачу как предварительные данные. Окончательный ответ при бактериоскопическом исследовании выдается только при обнаружении Mycobacterium tuberculosis.
Микробиологические методы исследования отделяемого дыхательных путей
Возбудителями гнойно-воспалительных процессов дыхательных путей чаще всего являются условно-патогенные микроорганизмы следующих родов и видов: Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes, Staphylococcus aureus, Haemophilus influenzae, Pseudomonas aeruginosa, Neisseria, Corynebacterium, Klebsiella, Citrobacter, Proteus, Candida, Actinomyces и др. При направленном исследовании могут быть выделены Mycobacterium tuberculosis и другие микобактерии, Mycoplasma, Bacteroides. Особенностью микробиологического исследования при инфекциях дыхательных путей является почти обязательное наличие в исследуемом материале нескольких видов микроорганизмов. В отделяемом зева, трахеи, бронхов, носа в норме обнаруживаются следующие микроорганизмы: Staphylococcus epidermidis, Streptococcus viridans, Neisseria, Corynebacterium, Lactobacillus, Candida и некоторые другие. При носительстве могут быть обнаружены S. aureus, S. pneumonia, S. pyogenes. Мокрота, проходя через верхние дыхательные пути и полость рта, может контаминироваться вегетирующей в них микрофлорой.
Микроскопия исследуемого материала
Из мокроты или материала, взятого стерильным ватным тампоном, одновременно с посевом приготавливают мазки, окрашивают их по Граму и микроскопируют с иммерсионным объективом. При обнаружении микроорганизмов отмечают их морфологические и тинкториальные свойства (кокки, палочки, отношение к окраске по Граму).
Микроскопическое исследование является важным ориентиром. При просмотре мазков из мокроты оценивают общую картину микрофлоры: наличие скоплений грамположительных кокков (Staphylococcus, Micrococcus); цепочек грамположительных кокков (Streptococcus); мелких ланцетовидных, окруженных зоной неокрасившейся капсулы (S. pneumoniae); грамотрицательных кокков (Neisseria); грамотрицательных палочек с закругленными концами, окруженных капсулой в виде светлого ореола (Klebsiella и др.); грамотрицательных палочек (E. coli, P. aeruginosa и др.); мелких грамотрицательных палочек в виде скоплений (Haemophylus); мицелия и бластоспор гриба.
Микробиологические методы исследования отделяемого открытых инфицированных ран
При появлении гнойно-воспалительного процесса в ране раневое отделяемое, гной, кусочки инфицированных тканей (грануляции, мышцы и т.п.) подвергают микробиологическому исследованию. Возбудителями гнойно-воспалительных процессов могут быть представители различных родов, подавляющее большинство которых относят к так называемой "условно-патогенной" микрофлоре (аэробной, микроаэрофильной и анаэробной). Среди них чаще встречаются виды родов: Staphylococcus, Streptococcus, Pseudomonas, Escherichia, Proteus, Citrobacter, Klebsiella, Enterobacter, Hafnia, Serratia, Aeromonas, Alcaligenes, Acetobacter, Haemophilus, Peptococcus, Bacillus, Clostridium, Corynebacterium, Propionobacterium, Bacteroides, Nocardia, Listeria, Fusobacterium, Neisseria, Mycrococcus, Mycoplasma. Реже - Yersinia, Ervinia, Salmonella, Acinetobacter, Moraxella, Brucella, Candida, Actinomyces. Микроорганизмы могут вызывать и поддерживать гнойный процесс как в монокультуре, так и в ассоциации.
Микроскопия исследуемого материала
Материал, взятый одним из стерильных ватных тампонов, "размазывают" по стерильному предметному стеклу, окрашивают по Граму и просматривают под микроскопом. При обнаружении микроорганизмов отмечают их морфологическую характеристику (грамположительные и грамотрицательные палочки, кокки и др.) и степень обсемененности. В соответствии с результатами микроскопии могут быть внесены коррективы в ход бактериологического исследования.
Микробиологические методы исследования отделяемого глаз
Микробиологическое исследование проводится при заболеваниях конъюнктивы, век, слезных мешков, роговицы. Следует учитывать, что в норме только с конъюнктивы и в небольшом количестве регулярно выделяются Staphylococcus epidermidis, Corynebacterium xerosis, Corynebacterium pseudodiphteriticum, непатогенные микроорганизмы семейства Neisseriaceae, Sarcina. У отдельных лиц временно могут выделяться Staphylococcus aureus, микроорганизмы семейства Streptococсaceaе (S. pneumoniae, S. feacalis, S. viridans), представители семейства Enterobacteriaceae, рода Haemophilus, микоплазмы. Причиной конъюнктивитов в преобладающем количестве случаев являются стафилококки (79,2%). Staphylococcus aureus чаще обнаруживается при остром (43,6%), а Staphylococcus epidermidis - хроническом конъюнктивите (83,5%). Другими возбудителями острых гнойных и хронических конъюнктивитов являются Neisseria gonorrhoeae, Moraxella lacunata, Branhamella catarrhalis, Corynebacterium diphteriae, Streptococcus pyogenes, Streptococcus viridans, Streptococcus faecalis, Haemophilus aegyptiсus, Haemophilus influenzae, Pseudomonas aeruginosa, микроорганизмы семейств Enterobacteriaceae, родов Proteus, Klebsiella, Escherichia. Реже встречаются Listeria monocytogenes, грибы рода Candida, Aspergillus.
Помимо вышеперечисленных микроорганизмов, являющихся возможными возбудителями воспалительных процессов не только глаз, но и других систем и органов человека, известны микроорганизмы, обуславливающие только конъюнктивиты. К ним относятся Haemophilus aegypticus, Moraxella lacunata, Branchamella catarrhalis.
Микроскопия исследуемого материала