Генетические маркеры репродуктивного здоровья крупного рогатого скота

Молекулярно-генетические маркеры – это гены или последовательности ДНК с известной локализацией на хромосоме. Различают маркеры двух типов для ядерной ДНК, а также маркеры митохондриальной ДНК. Маркеры всех типов могут быть использованы в маркер-зависимой селекции домашних животных, в том числе крупного рогатого скота.
Признаки репродуктивного здоровья крупного рогатого скота обладают низкой наследуемостью, вследствие чего данные признаки сложно улучшить путем традиционной селекции по фенотипу. Использование ДНК-маркеров позволяет увеличить скорость генетического улучшения фертильности животных. Комбинация диагностики генетических маркеров и использования репродуктивных технологий, таких как искусственное оплодотворение, забор спермы и ооцитов, интраплазматическая инъекция спермы и многих ...

Введение 4
1 Аналитический обзор 6
1.1 Типы генетических маркеров 6
1.2 Современное состояние репродуктивного здоровья крупного рогатого скота 10
1.3 Генетические маркеры мужской фертильности 13
1.4 Генетические маркеры женской фертильности 19
2 Методы исследования 24
2.1 Общий обзор методов 24
2.2 Метод ПЦР-ПДРФ анализа в детекции маркеров репродуктивного здоровья 32
Заключение 35
Библиографический список 37

В течение многих лет селекция крупного рогатого скота велась в двух основных направлениях – улучшение продуктивности молочных пород животных и улучшение продуктивности мясного скотоводства. Традиционная селекция велась по фенотипическим признакам, таким как качественные показатели молока (жирность, удой, содержание белков). Однако при оценке коров молочных и мясных пород большое значение имеет не только высокий уровень молочной и мясной продуктивности, но и признаки репродуктивного здоровья крупного рогатого скота. Известно, что отбор на молочную продуктивность привел к снижению фертильности крупного рогатого скота и повышению уровня абортов, снижению качества спермы.Традиционная селекция по репродуктивным признакам малоэффективна вследствие того, что фертильность в большой степени зависи т от условий среды и обладает низким коэффициентом наследуемости. В связи с этим развиваются новые методы селекции в животноводстве.
Активное развитие методов молекулярной генетики и генодиагностики позволяют определять гены и локусы, контролирующие или ассоциированные с полезными хозяйственно-значимыми признаками. Все большее распространение получают методы генодиагностики при установлении родословной животных, с целью активного влияния на селекцию необходимых признаков. Селекция на уровне генотипа (маркер-зависимая селекция) имеет ряд существенных преимуществ перед традиционной селекцией по фенотипам. Во-первых, маркер-зависимая селекция не учитывает изменчивость, обусловленную случайными средовыми факторами и делает возможной селекцию на ранних этапах развития организма. Селекция по генотипу может вестись по признакам, которые ограничены полом. Все это в целом повышает эффективность и скорость селекции. От одной коровы можно получить в лучшем случае одного теленка в год, в то время, как в её яичнике содержатся сотни тысяч незрелых половых клеток (ооцитов), представляющих огромный генетический резерв. Кардинальное решение проблемы ускоренного воспроизводства скота состоит в том, чтобы перейти к нетрадиционным способам увеличения плодовитости. Для этого применяется целый ряд биотехнических методов, разработанных на основе углубленных исследований репродуктивной функции, её регуляции, а также на совершенствование приемов манипуляции с эмбрионами, половыми и соматическими клетками. В перспективе биотехнология рассматривается как основа ускоренного воспроизводства высокопродуктивных животных и целых популяций.
Целью данной работы является обзор генетических маркеров репродуктивного здоровья крупного рогатого скота. Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие задачи: 1) рассмотреть различные типы генетических маркеров, которые могут использоваться в животноводстве; 2) сделать обзор современного состояния репродуктивного здоровья крупного рогатого скота; 3) выявить молекулярно-генетические маркеры женской и мужской фертильности; 4) сделать обзор методов диагностики полиморфизма генетических маркеров.

Ингибин регулирует секрецию ФСГ вместе с эстрогеном и тестостероном. Гены, кодирующие альфа и бета типы ингибина являются потенциальными кандидатами для анализа фертильности. Они локализованы на второй и четвертой хромосомах соответственно. Ингбин бета ассоциирован с объемом спермы в каждом эякуляте и подвижностью. Ингибин альфа связан с акросомной реакцией.Ген пролактина находится на хромосоме 23 и состоит из пяти экзонов, кодирующих 199 аминокислотных остатка. Ген, кодирующий рецептор к пролактину, находится на 20 хромосоме. Идентифицировано две формы пролаткинового рецептора – короткая и длинная, которые появляются в результате альтернативного сплайсинга. Короткая форма рецептора не способна обеспечивать транскрипционную активацию через JAK-STAT путь. Более того, короткая форма ингибирует действие длинной формы рецептора и передачу сигнала из-за образования гетеродимеров [Candidate gene markers ... , 2013]. Идентифицированы белки семенной жидкости, ассоциированные с фертильностью быков: BSP-белки, альфа-L-фукозидаза, остеопонтин, фосфолипаза А, простагландин-Д-синтаза, спермадгезин 2, кластерин, убиквитин. BSP-белки – это белки семенной жидкости быков. Гены, кодирующие белки BSP1, BSP3, BSP4, BSP5, BSPH1, BSPH2 локализованы на 11 хромосоме. Функции различных видов BSP белков похожи, что и следовало ожидать из схожести их трехмерных структур. Белки связываются с фосфатидилхолином, плазмогеном и сфингомиелином на поверхности сперматозоидов, взаимодействуют с гепарином и липопротеинами высокой плотности, факторами капацитации. Альфа-L-фукозидаза узнает и отщепляет терминальные остатки фукозы на поверхности клеток, таким образом играя большую роль в связывании и пенетрации сперматозоидами оболочки яйцеклетки «zona pellucida», слиянии мембран половых клеток и последующих событий. Ген альфа-L-фукозидазы находится на второй хромосоме.Остеопонтин – компонент секрета половых желез. Этот кислый фосфорилированный гликопротеин является маркером фертильности быков, так как оказывает влияние на связывание сперматозоидов и ооцитов и развитие эмбриона. Ген остеопонтина локализован на шестой хромосоме.Фосфолипаза А2 – это секретируемый белок, имеющий две изоформы (одна состоит из субъединиц в 15 и 16 кДа, вторая состоит из субъединиц в 16 и 60 кДа). Предполагается, что белок играет роль в капацитации сперматозоидов и акросомной реакции. Ген фосфолипазы PLA2 локализован на 16 хромосоме и его транскрипция активируется в ответ на прогестерон и кальций. Показано, что самцы мышей, у которых не экспрессируется PLA2, производят сперматозоиды с малой подвижностью и имеют значительно сниженную фертильность [Sato, 2010]. Синтаза простагландина D (PGD) - это белок, ассоциированный с фертильностью. Ген PGD локализован на шестой хромосоме. Белок вовлечен в связывание, защиту и облегчение поглощения ретиноидов в мужских половых органах. Ретиноиды необходимы для нормального протекания сперматогенеза, клеточного роста, дифференцировки и поддержания целостности эпителия.Спермадгезин 2, также известный как спермадгезин Z13, оказывает неблагоприятное воздействие на подвижность сперматозоидов. Повышенное его содержание выявлено у быков с низкой фертильностью [Moura. Kos, Chapman, Killian, 2006]. Ген, кодирующий данный белок, находится на 26 хромосоме.Кластерин находится на восьмой хромосоме. Белок продуцируется клетками Сертоли и ассоциирован с такими физиологическими процессами, как связывание и агглютинация аномальных сперматозоидов, предотвращение окислительного стресса в сперматозоидах.Убиквитин – это белок с массой 8,5 кДа, который участвует в деградации ненужных белков. В репродуктивных путях быков белок секретируется и ковалентно связывается с поверхностью дефектных сперматозоидов. Таким образом, высокий уровень секреции убиквитина в сперме быков свидетельствует о ее низком качестве и низкой фертильности быков. Среди специфических белков спермы важны фосфолипаза С, зонадгезин, кальмегин, фертилин, серин/треониновая фосфатаза, лактатдегидрогеназа С, ангиотензин-конвертирующий белок, тестикулоспецифичный белов на Y хромосоме, убиквитин-специфичная пептидаза 9. Фосфолипаза С (PLCZ1) – белковый фактор спермы, который вызывает продукцию инозитол-1,4,5-трифосфата и высвобождение ионов кальция. Данные события служат триггером для запуска активации ооцита, во время которой ооцит выходит из состояния ареста во второй метафазе мейоза и заканчивает мейоз. Ген, кодирующий фосфолипазу С, находится на пятой хромосоме. Показано, что генетический вариации промоторного региона гена связаны с качественными признаками спермы [Pan., 2013].Зонадгезин – это пептид, локализованный в апикальной части головки сперматозоида. Белок видоспецифично связывается с оболочкой яйцеклетки. Ген локализован на 25 хромосоме.Кальмегин – это белок, который первый экспрессируется в профазе мейоза в первичных сперматоцитах. Кальмегин выполняет функцию шаперона при транспорте белков от эндоплазматического ретикулума до поверхности сперматид. Ген кальмегина локализован на 17 хромосоме. Потеря гена ведет к мужской стерильности.Фертилин, ранее известный как белок PH-30, это гетеродимер, который играет активную роль в связывании и слиянии мембран половых клеток. Гены субъединиц фертилина относятся к новому семейству генов ADAM (белки с дисинтегриновым и металлопротеазным доменами). Альфа субъединица кодируется геном Adam1 на 17 хромосоме, бета-субъединица кодируется геном Adam2 на 27 хромосоме. Предполагается, что дисинтегриновый домен фертилина взаимодействует с интегриновыми рецепторами, которые присутствуют на поверхности яйцеклетки.Лактатдегидрогеназа С, возможно, первый специфичный гликолитический фермент яичек, который был открыт в мужских половых клетках. Три различных формы лактатдегидрогеназы кодируются тремя генами: LDHA, LDHB, LDHC. У нокаутных по данным генам мышей наблюдается нарушение фертильности, которое связано с уменьшением потребления глюкозы сперматозоидами, продукции АТФ и подвижности [Glycolysis and mitochondrial respiration … , 2013].Ангиотензин-конвертирующий белок (ACE) существует в двух изоформах. Соматический АСЕ, экспрессирующийся в эндотелиальных клетках, содержит двойной домен, образовавшийся в результате дупликации гена. Вторая форма АСЕ продуцируется в мужской репродуктивной системе и содержит одиночный домен. Обе изоформы структурно схожи, поскольку кодируются одним геном и получаются в результате альтернативного начала транскрипции и посттранскрипционного сплайсинга. Белок АСЕ главным образом конвертирует ангиотензин 1 в ангиотензин 2. Но в целом белок АСЕ является неспецифической пептидазой, которая способна разрезать широкий круг субстратов, таким образом влияя на многие физиологические процессы: контроль кровяного давления, гематопоэз, воспроизводство, иммунные функции [Candidate gene markers … , 2013]. Таким образом, идентифицировано множество потенциальных генов-кандидатов репродуктивного здоровья самцов. Молекулярные маркеры мужской фертильности могут быть полезными в селекции для улучшения репродуктивных возможностей породы. Определение генетических маркеров открывает возможность для детекции фертильных и субфертильных самцов в одной селектируемой линии, и обеспечения эффективной селекции.1.4 Генетические маркеры женской фертильностиМолекулярные маркеры женской фертильности представляют собой гены, продукты которых задействованы в таких процессах, как регуляция овулярного цикла, фолликулогенез, оогенез, овуляция, цикл эструса, беременность, роды, анэструм [Mahmoud, Nawito, 2013].Фолликулостимулирующий гормон играет центральную роль в регуляции функционирования яичников у млекопитающих. Действие гормона опосредованно рецепторами, находящимися на поверхности зернистых клеток яичника. Исследования показывают, что свободный белок IGF-1 увеличивает чувствительность зернистых клеток к фолликулостимулирующему гормону в яичнике. То есть IGF-1 играет важную роль в процессе развития фолликулов и овуляции у крупного рогатого скота [Monget, Bondy, 2000]. Генетические маркеры фолликулогенеза, оогенеза и овуляции следующие: фактор роста и дифференцировки-9, BMP-15, Per-1, Ptx3, сурвивин, фолликулостимулирующий гормон.Ооциты млекопитающих регулируют фолликулогенез, овуляцию, оплодотворение через продукцию различных факторов, например, фактор роста и дифференцировки 9, костный морфогенетический белок 15 (BMP-15). Эти белки контролируют пролиферацию и экспрессию генов в гранулярных клетках. Другие ооцит-специфические факторы, такие как Mater и Zar1, необходимы для раннего развития эмбриона [Zygote arrest 1 (Zar1) is a novel maternaleffect gene … , 2003]. Белок Per1 вовлечен в действие циркадных ритмов, но точная его функция не известна. Возможно, Per1 играет роль в фолликулогенезе и оогенезе. Ген локализован на хромосоме 19, где также находится локус количественных признаков для определения скорости овуляции [Kirkpatrick, Byla , Gregory, 2000]. Белок GDF-9 индуцирует экспрессию белка пентраксина 3 (Ptx3). Показано, что инактивация Ptx3 ведет к уменьшению скорости оплодотворения ооцитов. Сурвивин – это белок-ингибитор апоптотических протеинов. Предполагается, что он защищает эмбрион от апоптоза через ингибирование апоптотических путей, включающих активацию каспаз. Сурвивин может рассматриваться как возможный маркер качества эмбрионов.Некоторыми исследователями рассматривался фолликуло-стимулирующий гормон как возможный маркер репродуктивных качеств, так как он функционирует при созревании фолликулов и овуляции. Исследователи изучали полиморфизм 5’ региона гена и выявили три варианта генотипа, один из которых значительно преобладает в подавляющем большинстве ооциотов [Mannaertz, Uilenbrock, Schot, De Leeuw, 1994].Половое созревание характеризуется экспрессией следующих генов-маркеров: гены гонадотропин-рилизинг гормонов, GPR54, SRC-3.Половое созревание является кульминацией в фенотипе взрослого животного. Оно сопровождается изменениями в циркулирующих гонадотропинах и увеличением уровня половых стероидных гормонов. Гонадотропин-рилизинг гормоны индуцируют секрецию лютеинизирующего гормона и фолликулостимулирующего гормона, которые необходимы для полового созревания и поддержания репродуктивных функций.Рецептор GPR54 – это ключевой белок, который участвует в активации гипоталамо-гипофизарной оси, мыши и люди с мутациями в этом гене стерильны [Two novel missense mutations ... , 2005].Генетические нарушения в коактиваторе стероидных рецепторов 3(SRC-3) ведут к множественным нарушениям, в том числе к репродуктивной дисфункции. Гормональный анализ показывает, что этот белок играет роль как в гормональной регуляции, так и в продукции эстрогенов [The steroid receptor coactivator … , 2000].Важными маркерами беременности и возможной пренатальной смертности являются пролактин-подобный белок 1 PRP-1, катепсин L, гликопротеин ITIH4, ингибирующий лейкемию фактор (LIF), SERPINA 14, остеопонтин и многие другие.Плацента коров секретирует множество молекул во время развития плода. Например, продуцируется пролактин-подобный белок 1 PRP-1 во время имплантации эмбриона. Показано, что этот белок может играть роль перед имплантацией и являться замечательным маркером для дифференцировки клеток трофобласта, а также маркером беременности [Expression of prolactin-related protein 1 … , 2002].Нарушения в процессе развития во время эмбриогенеза могут быть связаны с пренатальной смертностью. Одним из идентифицированных белков-кандидатов явлется белок катепсин L (СTSL). Его высокая аффиность к коллагену и эластину позволяет предположить, что он играет роль в прикреплении эмбриона к плаценте [Mahmoud, Nawito, 2013]. Гликопротеин ITIH4 играет роль в взаимодействиях зародыша и матки во время установления беременности, возможно, как белок острой фазы для защиты матки от восплительной реакции, индуцированной прикреплением зародыша к клеткам эпителия матки [Geisert and Yelich, 1997]. Ингибирующий лейкемию фактор (LIF) оказывает эффект на многие физиологические системные процессы, такие как пролиферация, дифференцировка, выживаемость клеток. Эти биологические эффекты обусловлены связыванием белка со специфическим рецептором. Предполагается, что LIF/LIFR система играет важную роль и в развитии зародыша и имплантации.Белок SERPINA14 может играть большую роль во время беременности у сельскохозяйственных животных. SERPINA14 – представитель большого суперсемейства серпинов - ингибиторов сериновых протеаз. Белок выделется эндометрием матки главным образом под действием прогестерона. Было изучено содержание и локализация мРНК SERPINA14 в матке на ранних сроках беременности. Дифференциальная пространственно-временная экспрессия белка в эндометрии матки позволяет сделать вывод о его важной роли в воспроизводстве [Molecular characterization and expression profile ... , 2010].Важную роль играет белок остеопонтин, в промоторе его гена обнаружены участки для связывания эстрогена и глюкокортикоидов. Показана также роль белков ФСГ, амфирегулина (AREG), STAT-белков в репродукции.Во время родов существенно увеличивается транскрипция гена окситоцина в нейронах супраоптического ядра, и остается на высоком уровне во время лактации. Экспрессия гена окситоцина может регулироваться механизмами, лежащими в основе возбуждения нейронов. Показано, что экспрессия FosB совместно с Fos участвует в активации нейронов во время родов и лактации у крыс. Показано также, что ген рецептора окситоцина содержит сайт АР-1 в промоторе. Таким образом, FosB и Fos может активировать транскрипцию гена рецептора окситоцина через этот сайт во время родов и лактации. Кроме того предполагается, что кортизол играет решающую иммуномодулирующую роль во время родов [Blood COX-2 and PGES gene transcription ... , 2008].В послеродовой период задействованы гены, связанные с анэтсрумом, и гены, регулирующие интервал отелов.Одной из самых распространенных причин бесплодия является анэструм, который развивается вследствие низкого уровня эстрогенов яичника. Ключевым ферментом в синтезе эстрогена является цитохром-Р450-ароматаза, которая кодируется геном CYP19. Полиморфизм гена ассоциирован с различным уровнем фертильности [Kumar et al., 2009].Интервал отелов – это промежуток времени между двумя последовательными отелами. Это один из наиболее важных показателей репродуктивного здоровья крупного рогатого скота. В случае длительного интервала отела происходят экономические потери из-за потери молока, чрезмерного потребления дополнительного корма, низкой скорости обновления стада.Генами-кандидатами являются гены рецептора фолликулостимулирующего гормона ( FSHR ) , инсулиноподобного фактора роста- I ( IGF-I) рецептора инсулиноподобного фактора роста-1 ( IGF-IR ) , ингибина бета A ( INHBA ) и сигнальных преобразователей и активаторов транскрипции 5А ( STAT5A ). Исследователи Шенау и его коллеги [Two novel missense mutations … , 2005] изучали связь между вариантами гена рецептора инсулиноподобного фактора роста-1 и продуктивными и репродуктивными признаками коров породы Гольштейн. Частоты генотипов в популяции составляли 82,1 % и 17,9%, для АА и АВ генотипов соответственно. Исследователи сообщили об отсутствии связи между идентифицированными полиморфизмами и возрастом первого отела , интервалом отела и надоями. Продолжительность лактации была связана с отсутствием B аллеля. Животные с генотипом АА имели более длительный период лактации.Таким образом, существует множество маркеров женской фертильности, которые действуют на различных этапах жизненного цикла животных. Необходимо дальнейшее более тщательное изучение корреляций полиморфизмов генов и показателей воспроизводства для установления оптимального набора генетических маркеров, которые будут использоваться в животноводстве для маркер-зависимой селекции.2. Методы исследования2.1 Общий обзор методовДля выявления точковых мутаций (SNP) используют несколько методов, краткая характеристика которых представлена в таблице ниже [По Зиновьевой и др, 2008]. Большая часть методов основана на полимеразной цепной реакции (ПЦР). Метод полимеразной цепной реакции был изобретен в 1985 году, автоматизирован в 1988 году. ПЦР представляет собой специфическую амплификацию выбранного фрагмента ДНК в миллиарды раз. Для постановки ПЦР необходимы два синтетических олигонуклеотида (праймеры), которые будут комплиментарны двум различным цепям специфического участка ДНК. Праймеры конструируют таким образом, что своими 3’-концами они при посадке будут направлены друг к другу (внутрь специфического амплифицируемого участка). Термостабильная полимераза использует праймеры как затравки для достраивания новой цепи из дидезоксинуклеотидов в направлении 5’-3’. Для работы фермента необходимы ионы магния. Вся процедура состоит из 30-40 циклов, каждый из которых включает три шага: денатурацию, отжиг праймеров, элонгацию. Во время первого шага – денатурации – происходит расплетение двух цепей ДНК при температуре около 94С. Второй шаг – отжиг праймеров – сопровождается снижением температуры от 50 до 60С с целью гибридизации праймеров с комплиментарными им участками ДНК. Затем температура повышается до 72С (оптимальная температура для работы термостабильной полимеразы). Во время третьего шага происходит синтез новой цепи ферментом. Последовательность шагов повторяется от 30 до 40 раз, до тех пор, пока не будет получен специфический конечный продукт ПЦР. Таблица 1 – Основные методы детекции точковых мутацийНазвание методаСуть методаПДРФ Рестрикционное расщепление геномной ДНК ферментами с последующим разделением фрагментов в геле и гибридизацией по Саузерну.ПЦР-ПДРФАмплификация фрагмента, содержащего точечную замену, посредством ПЦР, затем проведение анализа ПДРФАС-ПЦРАмплификация фрагмента, содержащего точечную мутацию, методом ПЦР с использованием специфических для каждого аллеля праймеров.ЛЦРСпецифическое лигирование LCR- и аллелеспецифических праймеров, комплементарных матрице Гетеродуплексный анализДенатурация продуктов ПЦР с последующей ренатурацией и определением подвижности методом гель-электрофорезаСеквенированиеОпределение нуклеотидной последовательности локуса, содержащего точковую мутацию.SSCPРазделение методом электрофореза в неденатурирующем геле одноцепочечных продуктов ПЦР, содержащих замену.Масс-спектрометрияИонизация молекул ДНК с последующей разгонкой в электрическом поле и определением скорости движения.Анализ полиморфизма длины рестрикционных фрагментов (ПДРФ-анализ) широко применяется для выявления различных аллелей гена. Данный анализ может быть проведен как в сочетании с гибридизацией по Саузерну, так и в сочетании с ПЦР. Проведение ПДРФ-анализа в сочетании с Саузерн-блотом включает несколько стадий. Сначала хорошо очищенная высокомолекулярная ДНК обрабатывается ферментами, способными разрезать ДНК в специфических сайтах. Эти ферменты называются рестрикционными эндонуклеазами (рестриктазами). В настоящее время известно более 400 видов ферментов, выделенных из бактериальных штаммов, и имеющих специфические сайты узнавания и разрезания ДНК. Полученные в результате рестрикции фрагменты ДНК разделяют в агарозном геле, фрагментируют в результате депуринирования, после чего переносят на нитроцеллюлозный или капроновый фильтр. Перенос осуществляется следующим образом: на гель помещают фильтр и слой фильтровальной бумаги. Перенос осуществляется за счет капиллярной всасывающей силы фильтровальной бумаги, а кроме того перенос можно ускорить методом вакуумного блотинга или электроблотинга. Процедура переноса занимает до 10-15 часов. На следующей стадии ДНК фиксируют на фильтре одним из способов: облучением ультрафиолетовым светом, короткой экспозицией в растворе щелочи, выдерживанием при 80С в течение двух часов. Затем проводят гибридизацию фильтра в течение 1 или 2 часов с неспецифической ДНК (для блокировки неспецифических мест связывания). И наконец гибридизуют фильтр с меченной специфической ДНК.