анализ профилей генови поиск генов-кандидатов количественных признаков.

Молекулярная характеристика может играть важную роль в раскрытии истории, оценке разнообразия, самобытности и популяционной структуры ДНК. Она так же может помочь избежать избыточного инбридинга при генетическом управлении маленькими популяциями. Многие исследования описывают внутри- и межпопуляционное разнообразие - некоторые в весьма крупном масштабе. Однако эти исследования фрагментарны, их тр удно сравнивать и обобщать. Более того, не проведены всесторонние международные обследования соответствующих видов. По этой причине стратегическое значение имеет разработка методов объединения существующих, частично перекрывающихся наборов данных, и обес печение стандартизации образцов и маркеров для будущего использования в качестве стандартов для исследований во всех странах. Сеть лабораторий, с ...

Оглавление
Введение
1. Определение уровня экспрессии множества генов
3.Методы, использующие ДНК-маркеры для оценки генетического разнообразия
3.Биочипы и функции генов
Заключение
Список литературы

Гены, задающие программу развития любого организма, — это фрагменты молекулы ДНК. С них синтезируются матричные РНК (мРНК), или информационные РНК (иРНК), с которых, в свою очередь, — белки. Процесс перезаписи информации с генов на белок называ ется экспрессией генов. Он регулируется работой других генов и сигналами, приходящимих в клетку извне, и благодаря такой регуляции с одного и того же гена может считываться больше или меньше белка, а иногда разные белки.
Определив структуру всех генов ор ганизма, набор и количество его белков, способы регуляции их количества в зависимости от внешних условий, мы узнаем об организме очень многое.
Изменения структуры генов называются мутациями и нередко приводят к тяжелым последствиям. Так, ген под названи ем MYH7 отвечает за построение белка, обеспечи вающего сокращение сердечной мышцы. Его мутации приводят к возникновению кардиомиопатии заболевания, которое может вызывать неожиданные сердечные приступы у людей всех возрастов, без всяких предварительных с имптомов. Раннее выявление мутаций в этом гене позволило бы предотвратить множество несчастных случаев, однако сейчас такая диагностика стоит слишком дорого, чтобы ее можно было использовать для всеобщего обследования населения.
Информация об изменениях экспрессии генов в организмах нужна в разных областях фундаментальной науки, медицины, фармацевтики, сельского хозяйства, биотехнологии. Но ее невозможно получить без метода, помогающего определить уровень экспрессии: с какой скоростью и в каком колич естве синтезируется белок. Задача усложняется тем, что все процессы в организме определяются работой не одного, а многих генов — нескольких десятков, сотен или даже тысяч, экспрессирующихся одновременно или в определенной последовательности. Определя ть уровень их экспрессии немыслимо без прибора, умеющего делать это автоматически, ведь вручную трудно или невозможно провести столько измерений. Нужно еще учесть, что количество биологического материала для подобных экспериментов нередко весьма невелик о. Если прибор не сможет работать с исключительно малыми объемами проб, он не найдет широкого применения.
Точно судить об уровне экспрессии следует по количеству белка, кодируемого данным геном. Однако этот показатель не всегда удается измерить, посколь ку некоторых белков синтезируется крайне мало, а кроме того, не всегда известно, какой белок какому гену соответствует.
Поэтому о степени экспрессии гена судят косвенно, по количеству образуемой с него мРНК — оно в целом отражает активность гена. Измерит ь количество информационных РНК тоже непросто. Сначала эти молекулы выделяют из клеток, затем с ними проводят реакцию обратной транскрипции. В ней образуются фрагменты ДНК с такой же последовательностью нуклеотидов, что и гены, с которых были синтезир ованы определяемые мРНК. Количество этих фрагментов ДНК пропорционально количеству исходных молекул мРНК.
Цель исследования: теоретически рассмотреть анализ профилей генов и поиск генов-кандидатов количественных признаков.
Объект исследования: профилии генов.
Предмет исследования: поиск генов-кандидатов количественных признаков
Задачи исследования:
Рассмотреть определение уровня экспрессии множества генов.
Выделить методы, использующие ДНК-маркеры для оценки генетического разнообразия.
Изучить биочипы и функции генов.
Методы исследования: теоретический анализ литературы по проблеме исследования.

, 2001; Luikart и др., 2003). Подход популяционной геномики для картирования QTL основан на трех главных принципах:на нейтральные локусы по всему геному будут действовать сходным образом генетический дрейф, демография и эволюционная история популяций;локусы, находящиеся под действием отбора, будут отличаться по своему поведению и, следовательно, характер их изменчивости будет резко отличаться: будут обнаруживаться утрата изменчивости (рост изменчивости, если локусы находятся под давлением балансирующего отбора), неравновесие по сцеплению, и увеличение/уменьшение показателей Gst/Fst; через эффекты «путешествия на попутках» отбор будет влиять на сцепленные маркеры, что позволит обнаруживать «следы отбора» (выбросы из общей картины), которые могут быть выявлены путем генотипирования большогоколичества маркеров вдоль хромосомы и идентификации кластеров, изменчивость которых «выпадает» из общей картины. Такой подход использует фенотипические данные на уровне породы (или субпопуляции внутри породы), а не на индивидуальном уровне, таким образом, хорошо дополняя классический подход по картированию QTL в пределах родословных. Подход популяционной геномики позволяет также идентифицировать гены, подвергающиеся сильному давлению отбора и в конечном счете фиксирующиеся геном миостатина, функция которого была впервые установлена у мышей, а потом оказалось, что он локализуется у крупного рогатого скота в том районе хромосомы, где ранее был картирован ген синдрома двойной мускулатуры (McPherron, Lee, 1997).[2]Исследование характера генной экспрессииВ прошлом проявление специфических признаков, таких как адаптация и устойчивость, можно было оценить только на фенотипическом уровне. В настоящее время транскриптом (совокупность всех транскриптов в клетке или ткани) и протеом (совокупность всех белков) могут быть прямо исследованы с использованием высокоточных технологий, таких как дифференциальное проявление (differential display - DD) (Liang, Pardee, 1992), кДНК-AFLP (Bachem и др., 1996), серийный анализ генной экспрессии (SAGE) (Velculescu и др., 1995; 2000), масс- спектрометрия, белковые и ДНК-микроматрицы. Эти методы обусловили прорыв в анализе РНК и белков, позволяя параллельно анализировать фактически все экспрессирующиеся в данное время гены в ткани. Таким образом, эти методы вносят свой вклад в расшифровку генных сетей, лежащих в основе большинства комплексных признаков.Омик технологии часто сравнивают с включением света перед фреской Микеланджело вместо использования для ее освещения факела, который позволяет видеть только часть целого. Полный вид позволяет понять представленное и оценить его красоту. В реальности, возможности этих методик в настоящее время соответствуют трудностям и стоимости их применения и анализа получаемых данных. Очень трудным является выделение гомогенной клеточной популяции, что является важных исходным требованием для большинства исследований профилей генной экспрессии. Большое количество параллельных анализов приводит к снижению стоимости одного анализа, но к высокой суммарной стоимости эксперимента. На всех этапах экспериментальных исследований требуется дорогое оборудование и высокий технический профессионализм. К этому прибавляются общие трудности работы с РНК, по сравнению с ДНК. РНК очень чувствительна к разрушению, этому приходится уделять особенно много внимания при экстрагировании из тканей с высокой метаболической активностью. Консервация образцов и манипуляции с ними, несомненно, являются ключевыми условиями успеха экспериментов по анализу РНК. Применение нанотехнологий для анализа биологических молекул открывает многообещающие перспективы в решении этих проблем (Sauer и др., 2005).[22]Следующая проблема - обработка данных. Молекулярная база данных, такая, как профили генной экспрессии, могут создаваться в относительно короткое время. Однако стандартизация данных, полученных в разных лабораториях, требует согласованного анализа различных наборов биологических данных. Существенным для эффективного анализа молекулярных сетей являются именно соглашения по стандартизации, также как и по созданию взаимосвязанных баз данных.Профили транскрипцииВ этом разделе представлено короткое описание методов SAGE и микроматриц. Описания других методов можно найти в ряде современных обзоров (напр., Donson и др., 2002). SAGE создает полный профиль экспрессии ткани или клеточной линии. Метод включает создание полной библиотеки мРНК, позволяющей выполнять количественный анализ целых транскриптов, экспрессирующихся или инак- тивированных на определенных стадиях клеточной активности. Метод основан на трех принципах: (i) необходимо иметь короткие мишени - последовательности (9-14 пар оснований), полученные из определенного района внутри каждого мРНК- транскрипта, содержащего достаточно информации для уникальной идентификации одного специфического транскрипта; (ii) последовательности-мишени должны быть сцеплены вместе для формирования длинных ДНК-молекул (конкатемеры), которые могут быть клонированы и секвенированы - секвени- рование клонов конкатемеров приводит к быстрой идентификации множества индивидуальных мишеней; (iii) уровень экспрессии оценивается по количеству мишеней в сумме транскриптов.[19]Микроматрицы используются для сравнения в одном эксперименте уровней экспрессии мРНК нескольких тысяч генов в двух биологических системах, например, у животных в нормальной среде и у животных в экстремальной среде. Технология микроматриц обеспечивает также понимание временного и пространственного порядков экспрессии генов в ответ на действие широкого спектра факторов, которому подвергается организм.Очень маленькие объемы раствора ДНК печатаются на подложках, сделанных из непористых материалов, например, стекло, формируя небольшие пятна (споты), диаметром от 100 до 150 рк. В настоящее время с использованием робототехники на предметном стекле для микроскопа можно распечатать около 50 000 комплементарных ДНК (кДНК). ДНК-микроматрицы содержат несколько тысяч известных и несколько тысяч неизвестных генов. На микроматрице могут быть распечатаны фрагменты кДНК или заранее подготовленные олигонуклеотиды. В последнем случае достигается высокий уровень специфичности и воспроизводимости, однако их разработка возможна только тогда, когда известна последовательность таких олигонуклеотидов. Использование микроматрицы основано на принципе «гибридизации», то есть экспонировании двух одноцепочечных последовательностей ДНК, или одной ДНК и одной РНК, с последующим измерением количества образовавшихся двуцепочечных молекул. Экспрессия мРНК может быть измерена качественно и количественно. Наличие мРНК указывает на активность гена в ткани и обычно прямо связано с наработкой белка, транслируемого с этой мРНК.Профили генной экспрессии вносят вклад в понимание биологических механизмов и, следовательно, облегчение идентификации генов-кандидатов. Например, пул генов, участвующих в проявлении трипанотоле- рантности у крупного рогатого скота, был охарактеризован с использованием метода SAGE (Berthier и др., 2003), и анализа кДНК-микроматриц (Hill и др., 2005). Параллельное исследование многих генов может позволить идентифицировать гены-«господа», отвечающие за фенотипические характеристики, неопределяемые в анализе дифференциальной экспрессии генов. Такие гены-«господа», например, могут быть представлены разными аллелями, которые все экспресси- руются на одном и том же уровне, однако, с разной эффективностью обеспечивают экспрессию подчиненных генов. В этом случае ген-«господин» можно найти путем использования знаний о метаболических путях или через подход по проявлению QTL (expression QTL- eQTL) (Lan и др., 2006). При таком подходе в сегрегирующей популяции измеряется уровень экспрессии подчиненных генов. Количество транскрипта каждого гена обрабатывается как фенотипическая характеристика, и QTL, который влияет на генную экспрессию, можно обнаружить с использованием методологии, описанной выше. Следует отметить, что анализ данных для обнаружения QTL является все еще весьма трудным для исполнения. Это верно и для методики профилирования транскриптов из-за возникновения большого количества ложных сигналов.[19]Профилирование белковСистематическое изучение структуры белков, посттрансляционных модификаций, белковых профилей, взаимодействий белок-белок, белок-нуклеиновая кислота, белок-малые молекулы, и пространственной и временной экспрессии белков в эукариоти- ческих клетках важно для понимания комплексных биологических явлений. Белки необходимы для структуры живых клеток и их функций.Структура белка может быть выявлена дифракцией рентгеновских лучей или ядерно-магнито- резонансной спектроскопией. Первое требует большого количества кристаллического белка, что является существенным ограничением. Для того, чтобы понять функцию белка и взаимодействия белок-белок на молекулярном уровне, было бы полезно определить структуру всех белков в клетке или организме. К настоящему времени, однако, этого еще не достигли. Интересно, что количество вариантов различных белков, появляющихся в процессе белкового синтеза (в частности, в результате альтернативного сплайсинга и/или пост-трансляционной модификации), существенно больше, чем количество генов в геноме.Масс-спектрометрия (аналитический метод для определения молекулярных масс) в комбинации с хроматографией или техникой электрофоретического разделения является в настоящее время предпочтительным методом для иденгификацииэндогенных белков в клетках, характеристики пост-трансляционных модификаций и определения относительного содержания белков (Zhu и др., 2003). Двумерный гель-электрофорез уникален в отношении большого числа белков (>10 ООО), которые можно разделить и визуализировать в одном эксперименте. Белковые пятна вырезаются из геля, затем подвергаются про- теолитическому перевариванию, и затем белки идентифицируются с использованием масс-спектрометрии (Aebersold, Mann, 2003). Однако стандартизация и автоматизация двумерного гель-электрофореза достигается с трудом, и использование получающегося белкового рисунка, отражающего карту протеомы, оказывается успешным только в некоторых случаях. Дополняющая методика, жидкостная хроматография, автоматизируется легко и может быть прямо объединена с масс-спектрометрией. Основанные на аффи- ности методы протеомики, которые основываются на микроматрицах, являются альтернативным подходом к белковому профилированию (Lueking и др., 2003), они могут использоваться и для выявления взаимодействий белок-белок. Такая информация существенна для алгоритмического моделирования биологических путей. Однако специфичность связывания остается проблемой в применении белковых микроматриц, поскольку невозможно точно предсказать перекрестную реактивность. Существуют альтернативные подходы для выявления взаимодействий белок-белок, такие, как система двух гибридов (Fields, Song, 1989). Однако ни один из современных методов не позволяет количественно определить связывающиеся белки, и остается неясным.[2]Многие методы предсказания функции белка основываются на их гомологии с другими белками и их локализации внутри клетки. Предсказание функций белка достаточно сложны, и также требуют методов выявления взаимодействия белок- белок и выявления связывания белков с другими молекулами, поскольку именно в этих процессах связывания белки реализуют свою функцию.3. Методы, использующие ДНК-маркеры для оценки генетического разнообразияВ настоящее время для определения полиморфизма ядерной ДНК в распоряжении имеется рядПервый шаг в анализе ДНК, РНК и белка - их выделение из биологического образца и очистка. Для этого имеется целый ряд протоколов и готовых реакционных смесей (китов). Применяемая стратегия определяется источником материала и выделяемыми молекулами. Например, экстракция ДНК из цельной крови или лейкоцитов относительно легка, в то время как ее экстракция из обработанных пищевых продуктов много труднее. Экстракция РНК из поджелудочной железы очень трудна из-за высокой скорости процессов посмертной деградации в этом органе. Очистка ДНК, РНК и белков является ключевым фактором, от которого зависит надежность конечного результата.Микросателлиты, или SSR (Simple Sequence Repeats), или STR (Simple Tandem Repeats) состоят из участков ДНК длиной в 2 - 6 п.о. (пар оснований) - тандемно повторенных много раз (например, CACACACACACACACA). Они распространены по всему эукариотическому геному. Микросателлиты имеют относительно малые размеры и могут, следовательно, легко амплифицироваться при использовании ПЦР на ДНК, экстрагируемой из различных источников, например, кровь, корни волос, кожа или даже фекалии. Полиморфизмы могут быть визуализированы на секвенирующем геле, и при наличии автоматического ДНК-секвенатора можно анализировать большое количество образцов (Goldstein, Schlotterer, 1999; Jarne, Lagoda, 1996). Микросателлиты гипервариабельны; они часто имеют десятки аллелей по одному локусу, отличающихся один от другого по числу повторов. Их все еще предпочитают использовать для изучения разнообразия, а также для анализа отцовства и картирования локусов количественных признаков (QTL), хотя в ближайшем будущем от них могут отказаться в результате развития методов микроматриц (или чипов) разных маркеров. Для изучения разнообразия наиболее часто используются микросателлиты.[21]Минисателлиты обладают теми же характеристиками, что и микросателлиты, но длина повторов составляет от десяти до нескольких сотен пар оснований (п.о.). Микро и минисателлиты известны также как VNTR- полиморфизмы (Варьирующее количество тан- демных повторов - Variable Number of Tandem Repeats).Полиморфизм длин амплифицируемых фрагментов (Amplified fragment length polymorphisms - AFLP) является методом ДНК-фингерпринта (отпечатки пальцев), который выявляет фрагменты рестрикции ДНК способом их амплификации в ПЦР.STS маркер (Меченный сайт последовательности - Sequence Tagged Site) является ДНК последовательностью, которая встречается в геноме только раз в известном месте. Они необязательно бывают полиморфными и используются для построения физических карт.SNP являются вариантами по одному нуклеотиду, которые не меняют общую длину последовательности ДНК в этом регионе. SNP встречаются по всему геному. Они широко распространены и встречаются в геноме человека с частотой один SNP на каждую 1000 пар оснований (Sachinandam и др., 2001). Большинство SNP локализуется в некодирующих областях и не имеет прямого влияния на фенотип индивидуума. Однако некоторые введенные мутации в экспрессирующиеся последовательности или области, влияющие на экспрессию генов (промоторы, энхансеры), могут вызывать изменения в структуре белка или регуляции. Такие SNP предоставляют определенные возможности для выявления функциональных генетических вариантов.[19]Формирование выборки генетического материалаСоставление выборки является первым и наиболее важным этапом при любом изучении изменчивое В идеале выборки должны быть репрезентативными и включать неродственных животаых. Как правило, выборка объема 30 - 50 хорошо подобранных индивидуумов на породу считается достаточной для обеспечения предварительной оценки различий между породами и внутрипородного разнообразия, если оценивается достаточное количество независимых маркеров (например, 20-30 микросателлитов; Nei, Roychoudhury, 1974; Nei, 1978). Однако фактический объем выборки может варьировать в разных случаях и даже может быть меньше в случае высоко инбредных локальных популяций. В случае широко распространенной популяции, подразделенной на различные экотапы, объем выборки должен быть больше.Выбор неродственных образцов достаточно прост в случае однозначного определения породы, когда он основан на племенной книге или записях родословных. Напротив, в полудиких популяциях при отсутствии письменной регистрации такой выбор может оказаться много труднее. В таких случаях рекомендуется использование географического критерия, т.е. выбирать одного- нескольких (неродственных) животаых на стадо в разных стадах, распространенных в широкой географической облаете. Запись географических координат, фотодокументация мест сбора, животаых и стад очень ценны - для проверки кроссбридинга в случае неожиданных выбросов, или для выявления интересной географической картоны генетического разнообразия. Тщательно подобранный набор образцов - ценный ресурс, который может долгое время использоваться для получения значимых результатов даже при плохой технологии. Наоборот, смещенная выборка приведет к искаженным или трудно интерпретируемым результатам, даже если использованы самые передовые молекулярные методы.[17]В анализе микросателлитных данных определенные противоречия связаны с выбором модели их мутирования - неограниченная (неограниченное появление аллелей, случайно отличающихся по длине - количеству повторов) или пошаговая (последовательное изменение количества повторов) модель мутирования (Goldstein и др, 1995). Однако имитационные исследования показали, что неограниченная модель мутирования, в общем, соответствует оценкам внутривидовой изменчивости (Takezaki, Nei, 1996).Среднее число аллелей в расчете на один локус в популяции, наблюдаемая и ожидаемая гетерозигот- ность (Но и Не) являются наиболее общими параметрами для оценки внутрипородной изменчивости. Наиболее простым параметром для оценки расхождения между популяциями является генетическая дифференциация, или индекс фиксации. Предложено много вариантов оценок (напр., FST и GST), причем наиболее широко используется FST (Weir, Basten, 1990), которая оценивает степень генетической дифференциации субпопуляций на основании расчета стандартизированных варианс частот аллелей между популяциями. Для значений FST между парами популяций может быть оценена статистическая достоверность (Weir, Cockerham, 1984) нулевой гипотезы об отсутствии генетической дифференциации между популяциями и, следовательно, различий между генетическими структурами популяций (напр., Mburu и др., 2003). Может быть выполнен иерархический анализ молекулярной дисперсии (пакет программ AMOVA) (Excoffier и др., 1992) для оценки распределения разнообразия внутри и между группами пород.[13]Микросателлигные данные также широко используются для оценки генетических взаимоотношений между популяциями и индивидуумами путем оценки генетических расстояний (например, Beja-Pereira и др., 2003; Ibeagha-Awemu и др., 2004; Joshi и др., 2004; Sodhi и др., 2005; Tapio и др., 2005). Наиболее широко используемая мера генетического расстояния - стандартное генетическое расстояние Нея (DS) (Nei, 1972). Однако для близко родственных популяций, в которых основным фактором генетической дифференциации является генетический дрейф, что часто происходит в случае пород домашнего скота, особенно в развивающихся странах, рекомендуется использование модифицированных расстояний Кавалли-Сфорца (DA) (Nei и др., 1983). Генетические взаимоотношения между породами могут быть выявлены через реконструкцию их филогении, причем наиболее часто используется метод ближайших соседей (neighbour-joining - N-J) (Saitou, Nei, 1987). Однако главный недостаток реконструкции филогенетического древа заключается в предположении, что эволюция его ветвей не может образовывать сеть, то есть, ветви могут расходиться, но не могут появляться за счет пересечения. Это предположение редко оказывается справедливым для домашнего скота, где новая порода часто возникает в результате скрещиваний между двумя или более предковыми породами. Таким образом, результаты визуализации эволюции пород, полученные путем реконструкции филогенетических дерев, следует воспринимать с осторожностью.[9]Для анализа смешения микросателлитных данных из разных популяций предлагаются методы многомерного анализа или недавно появившиеся методы кластеризации на основе подходов Байеса (Pritchard и др., 2000). Вероятно, примером самого всестороннего исследования такого типа у домашнего скота является изучение крупного рогатого скота на всем африканском континенте (Hanotte и др.