Ti-плазмиды в генетической инженерий растений.

Ti-плазмиды в генетической инженерий растений. 71%!!!! ...

Содержание
Введение....................................................................................................3
1 Применеие Ti-плазмид агробактерий в генетической инженерии.4
1.1 Характеристика Agrobacterium tumefaciens.....................................4
1.2 Cоздание векторов на основе Ti-плазмид.....................................6
1.3 Процессинг тДНК в бактериальной клетке и ее перенос в клетки растений.............................................................................................................7
1.4 Разработка система трансформаций растений с помощью Agrobacterium tumefaciens.................................................................................12
1.5 Проблема сохранения чужеродных генов, перенесенных в растение...........................................................................................................15
1.6 Анализ экспрессии чужеродных генов в трансформированных растениях.........................................................................................................16
2. Практическое применение генетической инженерии растений с использованием Ti-плазмид...........................................................................18
2.1 Краткая характеристика..............................................................18
2.2 Сигнальные молекулы, их способность индуцировать процессинг тДНК.................................................................................................................22
3 Материалы и методы...................................................................23
3.1 Материалы...................................................................................23
3.2 Методы..........................................................................................26
Вывод.....................................................................................................28
Список литературы...............................................................................30

Актуальность работы. Свойство бактерии вида Agrobacterium tumefaciens порождать у растений корончато-галловую болезнь связывают с нахождением в их клетке крупной (96-157 мДа) конъюгированной Ti-плазмиды. В ходе идентифицирования растения небольшая часть генетического материала Ti-плазмид – тДНК переходит в растительные клетки и интегрируется в хромосомы, при этом она остаётся частью родового материала. Ген тДНК экспрессируется в трансформарованной растительной клетке, нарушает её фитогормональный баланс и определяет синтез специфического соединения.
Агробактерии – это природный "генный инженер", который осуществляет удивительный, по филогенетической дальности, переход генетической информации. На основе агробактерий сконструирована эффективная векторная система для генетической инженерии р астений.

Второй пункт достижим при помощи транспозонного мутагенеза. В итоге транспозона в Т-ДНК можно выключать ген, который приводит к опухолеобразованию, что не воздействует на механизм передачи Т-ДНК. Обычно применяют бактериальную транспозону (Tn5, Tn7). При этом снимается блок с процесса регенерации. 1.3Процессинг тДНК в бактериальной клетке и ее перенос в клетки растений При культивировании Agrobacterium tumefaciens с механическим поврежденной частью растения, регенерирующей протопластом или в наличии из клетки бактерии можно определить разную молекулярную форму процессированной тДНК – одноцепочечную линейную, двуцепочечную линейную и двуцепочечную кольцевую, которая может быть посредником переноса генетических материалов в растительные клетки. При этом кольцевые формы, которые образуются за счет гомологичных рекомбинаций между правыми и левыми границами тДНК с созданием одной гибридной границы, встречаются очень редко. При их создании не произойдет репликативный синтез ДНК, в то время как в случае создания 2-х других форм, прохождение репликации тДНК в бактериях возможно, в ходе ее транспорта в растения. Репликация нужна для обеспечения сохранение тДНК в исходных Ti-плазмидах, если только не допускать вероятность образования физических вырезаний материала тДНК из Ti-плазмиды в ходе образований двухцепочечного разрыва в границы. Исключение тДНК из Ti-плазмиды - это главный недостаток, отошедший на второстепенный план, как "эксцезионная модель". Тем не менее, создание двуцепочечного разрыва в границе и возникновение детектируемого количества линейных двуцепочечных форм тДНК, при культивировании бактериальной клетки, в при исследователе, замечали уже через тридцать минут, после присоединения этих индукторов в среду. Так же в условии индукции vir-гена в клетке агробактерии обнаруживаются линейные одноцепочечные формы процессированной тДНК. Создание этого интермедиата выясняется через 8 часов после присоединения индуктора, и он накапливается на течении 40 часов больше, чем в 2 раза, а затем идет на спад, изображая, что процесс лимитирован.Какая из формы транслоцируется через бактериальные мембраны в бактериальные клетки до сих пор не выяснено из-за сложности нахождения числа каждой из формы и обнаружения динамик их превращений. Возможно, процессинг и транспорт тДНК не разделен во времени и идет вместе, как конъюгационный перенос плазмиды, происходящий в месте контактов мембраны конъюгирующей клетки. Тогда все нахожденные интермедиаты являются аберрантной формой, разорванного, на каком-то из этапов, неделимых процессов. В эпизоде индуцированный экспрессий vir-генов -- отсутствуют главные элементы взаимодействий – контакты бактериальных клеток и растительных клеток, и, поэтому, все нахожденные, в таком случае, формы могут быть посредниками только с определенным допущением. Доподлинно ясно, что в растительные клетки попадает лишь одна цепь тДНК и конвертируется в двуцепочечную уже в растительных клетках. В ходе прохождения в клетке Agrobacterium tumefaciens - полуконсервативных репликаций тДНК, вторая цепь может гидролизоваться в ходе перехода, освобождая энергию для транспортировки переносимой цепи.1.4Разработка система трансформаций растений с помощью Agrobacterium tumefaciensМного из первых экспериментов по генетическим трансформациям растения было предпринято при помощи задержки пораненной растительной клетки с использованием агробактери с немодифицированной Ti-плазмидой. Для того, что бы сохранить стерильность, часто инфицировали эксплантат in vitro за место целого растения. Бактерии после этого, подлежали удалению, прибавляли в среду цефотоксин или карбенициллин. Трансформант выбирали на безгормональных средах.По ходу образования обезоруженного вектора и новой селективной маркеровки, разработали более действенный метод, который дает больше числа трансформантов: кокультивирование агробактерии с растительным протопластом либо с эксплантантом листа. Было изображено, что кокультивирование протопласта с агробактерией, либо с бактериальной, влечет образование опухоли.После этого похожие подходы были успешно применены для трансформации растительной клети агробактериями, которые несут в составе тДНК химерный селективный маркер.Этот метод в дальнейшем улучшили применением фидерной культуры. Однако, все сказанные методы можно использовать только для трансформации растения, которое можно легко регенерировать из протопласта. Эта проблема легко преодолеваема кокультивированием агробактерий с листовым диском за место протопласта. Стерильный листовый диск с агробактериями, несет в составе обезоруженного вектора, какие-либо селективные маркеры устойчивости к антибиотикам. После этого куски листа культивируют 2 дня на фидерной чашке со средой, для получения побега. В дальнейшем их выносят на среду с цефотоксином для того, что бы уничтожить бактерию и с какими-либо антибиотиками. Регенерировавший побег даёт корень, после этого растение переносят в почву для осуществления следующего эксперимента.Так методика трансформации листового диска является идеальным сочетанием высоких частот трансформации с легкими и быстрыми и регенерации трансформантов, такой подход стали применять во многих лабораториях в мире. Кроме того, была предложена некоторая модификация метода. Для увеличения частоты трансформации листового диска Arabiodopsis была предложена обработка агробактерии, которая является индуктором генов vir. Однако метод трансформации листового диска используем для трансформации только того вида растения, который может регенерировать побег из недифференцированной клети в месте поранения.Наряду с методами трансформации листового диска обширно применяется конъюгированная агробактерия со стеблевым сегментом, клеткой суспензированных культур, микрокаллусом и прорастающим семенем. Метод трансформации семени агробактерии был впервые использован для арабидопсиса и заслужил особенного внимания, так как ему не требуется работа с культурой тканей.1.5Проблема сохранения чужеродных генов, перенесенных в растениеЧужеродные ДНК, которые переместились в растительную клетку при помощи разных способов, обычно входят в ядерный геном и идут в наследстве по закону Менделя. Область интеграции, по-видимому, распределена случайным образом по геному. Встраивание гена по определенному сайту было раньше показано в системе животной клетки и не так давно такой подход успешно применили для трансформации растения.Во множестве случаев последовательность чужеродной ДНК встраивается в один локус, или в одну копию, или в образе кластера тандемной вставки, что было изучено при помощи гибридизации in situ Часто просматриваются множество вставок в 2 или больше участков на разной хромосоме. В связи с этим во многих экспериментах получили контрансформацию физически несцепленного гена.Чужеродный ген обычно передаётся потомству с большой стабильности при мейозе. Но, порой наблюдается случайная потеря трансформированных фенотипов после мейоза.Возмножно, это происходит из-за активности чужеродных генов. Интеграция чужеродной ДНК во внеядеряемые геномы, так же протекает по неменделевскому типу наследования – по материнским линиям.Применяя методику гибридизации по Саузерну для того, что бы проанализировать трансформанты и их потомство, много исследователей показало, что часто имеется встраивание укороченной, тандемной или перестроенной копии чужеродного гена, особенно после прямого перехода ДНК в протопласт. Возникновение тандемов, часто от 6 до 22 копий, объясняется рядом рекомбинаций перед интеграцией в геноме. Создание инвертированного повтора является главным из типов перестройки чужеродной ДНК при использовании вектора, содержащего тДНК Ti-плазмиды.Итак, после опыта по трансформации растения, нужно обратить внимание на тот факт, что чужеродная ДНК подвергается разным изменениями перед встраиванием в геномы хозяина. Однако, и после интеграции может происходить различная ее перестройка, обычно во время мейоза. В этом случае только перекрестные опыления хорошо отобранного трансформанта с самым нужным генотипом и фенотипом даст потомство с предсказуемым признаком.1.6Анализ экспрессии чужеродных генов в трансформированных растенияхДля анализа экспрессии чужеродного гена в растении применяют много методов, в том числе Нозери-анализ РНК и Вестери-анализ продукта трансдукции. Кроме того, необходимо изучение фенотипических. Для того, что бы проанализировать экспрессию такого репортернного гена, как cat, npt II, ген октопин, и разработана чувствительная методика. Этот анализ имеет огромное значение, так как возможна комбинация кодирующих последовательностей репортернного гена с имеющимися регуляторными последовательностями растительного гена, либо создания двойного гена, экспрессирующегося с одного и того же промотора. Активность генов и промотора можно найти или при помощи ферментативных анализов, либо гибридизации растительных РНК с зондом, комплементарным репортерным генам.Показанные и разнообразные методы можно удачно использовать для того, что бы проанализировать экспрессию чужеродного гена в трансгенном растении, в частности, гена устойчивости к гербициду, насекомому, облучению, антибиотику и др.2Практическое применение генетической инженерии растений с использованием Ti-плазмид2.1 Краткая характеристикаНесколько лет назад ученые задавались вопросом, можно ли создать сорт, сбалансированный по составу аминокислоты, устойчивый к морозу, засухе, не поражаемый вредителям. На сегодняшний день можно с уверенностью сказать, что такие трансгенные растения уже появились в полях. После удачного эксперимента появляются опасения о возможных негативных последствиях генетической инженерии на природу и человека. Однако уже более чем за 25 лет своего существования генетическая инженерия не приносит ущерб ни природе, ни людям. Главное, в любом эксперименте по генной инженерии необходимо соблюдение разработанных правил. Очень остро поставили вопросы о приобретении растения, устойчивого к вредителю продуктов сельского хозяйства, так как болезнь растения стала основным лимитирующим фактором для сбора урожая. В запасе генной инженерии растений имеется множество приемов, которые позволяют получать трансгенных растений, устойчивых к насекомому. Обычно применяют ген bt, продуктом которого является бактериальный токсин Bacillus thuringiensis. Эта тюрингская бактерия продуцирует большой белок (протоксин), который контролируется геном bt, и при поступлении в кишечник личинок насекомых, разрушается под воздействием ферментов, а его фрагмент (эндотоксин) приведёт к их гибели. На рис.2 показана схема конструирования вектора и производства трансгенных растений хлопка, приобретающих признак устойчивости к насекомым.Рис. 2. Получение трансгенных растений хлопка с геном bt, несущим устойчивость к насекомым.В наше время уже синтезировали искусственный ген bt, конструкция с которым более эффективна, а сами трансгенные растения имеют широкий спектр устойчивости к насекомым. Трансгенные картофель, хлопок, кукуруза с геном bt уже изготавливаются фирмами “Monsanto”, “Ciba Seeds” и реализуются на рынках мира, хотя обсуждение их использования еще не закончено [6]. Известно, что растение, так же как и животное, способно вырабатывать иммунитет. Такое необыкновенное свойство имеют только устойчивые растения, у которых при атаке патогенов значительно изменяется метаболизм. Например, у устойчивого растения накапливается такое химическое соединение, как перекись водорода (Н2О2), салициловая кислота (SA), фитоалексины. Увеличенное содержание таких соединений содействует противостоянию растений в борьбе с патогенами. Одним из примеров, доказывающий роль салициловой кислоты в иммунном ответе растений, является - трансгенное растение табака, которое содержит бактериальный ген, контролирующий синтез салицилат гидролазы, был неспособен к иммунным ответам. Поэтому перемена генноинженерными путями уровня салициловой кислоты или вырабатывания в растениях в ответ на патоген H2O2 может быть перспективной для образования устойчивого трансгенного растения. В последние годы ученые применяют новые подходы для приобретения трансгенного растения с “antisense RNA”, которое позволит распоряжаться работой необходимого нам гена. В таком случае, при построении вектора копии ДНК (к-ДНК), встраиваемого гена, перевертывают на 180°. В итоге в трансгенных растениях получается нормальная молекула мРНК и перевернутая, которая, в силу комплементарности нормальной мРНК, образовывает с ней комплекс и закодированный белок не синтезируется [3]. Этот подход применяется для приобретения трансгенного растения томата с хорошим качеством плода. Вектор включает к-ДНК ген PG, кон- тролирущий синтез полигалактуроназы (polygalacturonase) – фермента, который участвует в разрушении пектина, основного из компонентов межклеточного пространства растительной ткани. Продукт гена PG синтезируется в период формирования плода томата, а повышение его количества приведет к тому, что томат становится более мягкими, что сильно сократит срок его хранения. Выключение такого гена в трансгенах позволяет получать растение томата с новым свойствам плода, которой не только значительно дольше сохранялся, но и само растение было более устойчивым к грибному заболеванию. Этот же подход применяют для регулирования срока созревания томатов, а в качестве мишени в этом случае используют ген EFE (ethylene-forming enzyme), продуктом которого является фермент, участвующий в биосинтезе этилена. Этилен – это газообразный гормон, одной из функций которого является контроль за процессом созревания плодов. Таким образом, стратегия антисмысловых конструкций широко применима для модификации экспрессии генов. Эта стратегия используется не только для получения растений с новыми качествами, но и для фундаментальных исследований в генетике растений. Следует упомянуть еще об одном направлении в генной инженерии растений, которое до недавнего времени в основном использовали в фундаментальных исследованиях – для изучения роли гормонов в развитии растений. Суть экспериментов заключалась в bt-Токсин убивает в листьях личинки Контрольный лист Bacillus thuringiensis Клонированный ген токсина (кодирует 1178 аминокислот) Фрагмент гена, кодирующий 454-615 аминокислот Т-ДНК бинарный вектор CAMV промотор Терминатор LB RB CAMV промотор Трансгенные растения хлопка экспрессируют высокий уровень bt-токсина Перенос в агробактерию Заражение проростков Рис. 2. Получение трансгенных растений хлопка с геном bt, несущим устойчивость к насекомым. Ген bt (Bacillus thuringiensis) кодирует 1178 аминокислот и локализован в бактерии на плазмиде. Показано получение фрагмента гена bt, достаточного для устойчивости растений к насекомым. Дана схема встраивания этого фрагмента в Т-ДНК вектор между LB (левой) и RB (правой) его границами. В векторе был использован также удвоенный промотор CAMV, который увеличивал экспрессию bt-гена в пять раз. Растения хлопка были трансформированы этим вектором через агробактериальную инфекцию. Трансгенные растения оказались устойчивыми к личинкам большого числа видов насекомых получении трансгенных растений с комбинацией определенных бактериальных гормональных генов, напри- мер только iaaM или ipt и т.д. Эти эксперименты внесли существенный вклад в доказательство роли ауксинов и цитокининов в дифференцировке растений. В последние годы этот подход стали использовать в практической селекции. Оказалось, что плоды трансгенных растений с геном iaaM, находящимся под про- мотором гена Def (ген, который экспрессируется только в плодах), являются партенокарпическими, то есть сформировавшимися без опыления. Партенокарпические плоды характеризуются либо полным отсутствием семян, либо очень небольшим их количеством, что позволяет решить проблему “лишних косточек”, например в арбузе, цитрусовых и т.д. Уже получены трансгенные растения кабачков, которые в целом не отличаются от контрольных, но практически не содержат семян. Остается добавить несколько слов еще об одном аспекте возможностей использования Ti-плазмиды аг- робактерии. Обезоруженную, лишенную онкогенов Ti- плазмиду ученые активно используют для получения мутаций. Этот метод носит название Т-ДНК-инсерци- онного мутагенеза. Т-ДНК, встраиваясь в геном растения, выключает ген, в который она встроилась, а по утрате функции можно легко отбирать мутанты. Этот метод замечателен также тем, что позволяет сразу обнаружить и клонировать соответствующий ген. В на- стоящее время таким способом получено множество новых мутаций растений и соответствующие гены клонированы. В нашей лаборатории М.А. Раменской на основе Т-ДНК мутагенеза получены растения томатов с неспецифической устойчивостью к фитофторозу. Областей применения трансгенных растений так много, что все имеющиеся сведения невозможно изложить в рамках одной статьи. На уровне лабораторных экспериментов ведутся работы по получению растений, устойчивых к холоду, тяжелым металлам, повышенному содержанию солей и др. Трансгенные растения, устойчивые к гербицидам (химическим соединениям, кото- рые используют для борьбы с сорняками), к вирусам, растения с повышенным содержанием масел и незаменимых аминокислот уже выращивают на миллионах гектаров. Не менее интересен и другой аспект работ – получены трансгенные растения с измененными декоративными свойствами. Один из примеров – это получение растений петунии с разноцветными цветками.