Значение микроскопического и микробиологического методов исследования пиогенных кокков для диагностики гнойно-септических заболеваний

ВЫВОДЫ

1. В результате проведенного исследования клинического материала от 115 женщин репродуктивного возраста с неспецифическими бактериальными вагинозами и вагинитами, вызванные условно-патогенной аэробной и факультативно-анаэробной микрофлорой, выделено 296 штаммов УПМ, развитие которых вызвало возникновение воспалительных заболеваний урогенитального тракта и привело к появлению его дисбиотических нарушений. Весь спектр выделенных микроорганизмов был представлен кокками родов Staphylococcus, Streptococcus, Enterococcus, палочковидными бактериями семейства Enterobacteriaceae и грибами рода Сandida.
2. Показано, что ведущая роль в возникновении бактериальных вагинозов, вызванных развитием УПМ, принадлежит кокковой микрофлоре, которая выделялась в 65,5% случаев, а именно стафилококкам. Ч ...

СОДЕРЖАНИЕ

ВВЕДЕНИЕ 3
ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР 5
ГЛАВА 1 БИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ПИОГЕННЫХ КОККОВ. КРАТКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ГНОЙНО-СЕПТИЧЕСКИХ ЗАБОЛЕВАНИЙ, ВЫЗВАННЫХ ПИОГЕННЫМИ КОККАМИ 5
1.1 Морфология, культуральные и биохимические свойства гноеродных кокков 5
1.2 Антигенная структура и факторы патогенности 8
1.3 Патогенетические аспекты гнойно-септических заболеваний, вызванных пиогенными кокками 13
ГЛАВА 2 НОРМОЦЕНОЗ И ДИСБИОЗ УРОГЕНИТАЛЬНОГО ТРАКТА ЖЕНЩИН 16
2.1 Количественный и качественный состав микрофлоры влагалища при нормоценозе 16
2.2 Дисбиоз урогенитального тракта женщин и его классификация 17
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 22
ГЛАВА 3 МИКРОБИОЛОГИЧЕСКАЯ ДИАГНОСТИКА КОККОВОЙ МИКРОФЛОРЫ ПРИ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ВАГИНОЗАХ 22
3.1 Материалы и методы исследований 22
3.2 Результаты и их обсуждение 23
ВЫВОДЫ 28
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ 29
ПРИЛОЖЕНИЯ………………………………………………………………….31

ВВЕДЕНИЕ

Стафилококки и стрептококки, обладая сродством к различным тканям, вызывают воспалительные процессы кожи, подкожной клетчатки и слизистых оболочек (фурункулы, карбункулы, абсцессы, панариции, маститы, конъюнктивиты, блефариты), костной системы (остеомиелиты), внутренних органов (пневмонии, аппендициты, пиелонефриты, холециститы), воспаление твердой мозговой оболочки (менингиты), брюшины (перитониты), а также сепсис. Они осложняют течение гриппа, кори и других инфекционных заболеваний, вызывают послеоперационные и послеродовые нагноения. Кроме того, пиогенные кокки могут стать главным этиологическим агентом бактериального вагиноза – наиболее широко распространенного дисбалансного состояния микробоценоза влагалища у женщин детородного возраста [5].
С одной стороны стафилококки и с трептококки входят в состав нормальной микрофлоры влагалища. В случае серьезных нарушений микроэкологии генитального тракта может произойти внедрение пиогенных кокков в слизистую оболочку стенки влагалища с дальнейшей транслокацией в мочевыводящие пути, цервикальный канал и другие органы и ткани, что может привести к возникновению инфекционно-воспалительных заболеваний женских половых органов, и, как следствие, оказать негативное влияние на репродуктивную функцию женщины [2, 13].
В связи с этим целью работы было выделение и изучение биологических свойств пиогенных кокков из урогенитального тракта женщин при дисбиотических нарушениях и определение их роли в возникновении бактериальных вагинозов.
Для реализации цели были поставлены следующие задачи:
1) выделить и определить состав УПМ из урогенитального тракта пациенток с дисбиотическими нарушениями;
2) провести видовую идентификацию пиогенных кокков с помощью бактериоскопического и бактериологического методов исследования;
3) установить роль пиогенных кокков в возникновении бактериальных вагинозов.
Объект исследования – клинический материал от пациенток гинекологического отделения ГКБ 5 г. Нижнего Новгорода.
Предмет исследования – биологические свойства пиогенных кокков, выделенных из урогенитального тракта женщин при дисбиотических нарушениях и их роль в возникновении бактериальных вагинозов.

Энтеротоксины являются низкомолекулярными белками с М. м. от 26 до 34 кД со свойствами суперантигенов. С синтезом энтеротоксинов связанная способность стафилококков вызывать пищевые отравления типа интоксикации [4]. Существует несколько классификаций стрептококков. По классификации Брауна (1919), которая основана на особенностях роста в агаре с кровью барана, выделяют: α-стрептококки (Streptococcus viridians), которые на кровяном агаре образуют зеленовато-серые колонии с зоной гемолиза зеленого цвета; гемолитические β-стрептококки (Streptococcus haemolyticus), которые на кровяном агаре образуют колонии с прозрачной зоной гемолиза; негемолитические γ-стрептококки (Streptococcus ahaemilyticus), которые не изменяют кровяного агара [1].Более распространенной является классификация Ленсфильда(1933) и Гриффитса (1935), основанная на антигенный структуре стрептококков, согласно которой все стрептококки распределяются по групповому антигену на 17 групп – от А к S. Наибольшее значение имеют группы А, В, С, D. Из 53 типов стрептококков у человека, 49 входят в группу А, 3 – к группе С и 1 тип – к группе G. Принадлежность культур к одной из серологических групп определяют с помощью реакции преципитации с групповыми стрептококковыми сыворотками, а к серологическому типу – с помощью реакций агглютинации с типоспецифическими сыворотками. Антигенная структура стрептококков группы А представлена: С-карбогидратами, липотейхоевой кислотой, М-белками. Стрептококки группы В имеют капсулу полисахаридной природы, на основе состава которой выделяют 5 антигенных серотипов.Представители серогруппы С содержат полисахарид С, синтезируют экстрацелюллярные антигены (токсины), О-стрептолизин (белок) и S-стрептолизин (комплекс липидного протеина). Все они способны вызывать разрушение эритроцитов [5].К основным ферментам инвазии стрептококков относится гиалуронидаза. Нейроминидаза вызывает гемолиз эритроцитов, лизис других клеток крови, снижает вязкость муцина слюны, чем способствует проникновению инфекции (патогенных стрептококков) через слизистые оболочки верхних дыхательных путей. Гемолизин, О-, S-стрептолизины стрептококка разрушают строму эритроцитов и приводят к реакции «лаковой крови». Способность образовывать гемолизины у стрептококков обусловлена наличием плазмид.У патогенных стрептококков встречаются лейкоцидины – ферменты, разрушающие лейкоциты. Протеолитические ферменты – коллагеназы, расщепляющие коллагеновые волокна, что способствует проникновению микробов внутрь ткани.Фибринолизины вызывают разрушение фибриновых сгустков, которые образовались в процессе воспаления, и тем же, способствуют распространению инфекции в крови. Наиболее изученным микробным фибринолизином является стрептокиназа Streptococcus pyogenes, которая гидролизует плазминоген с образованием плазмина [4].Стрептококки также способны к синтезу токсинов. Мембранотоксинами являются гемолизин Streptococcus pneumoniaе и О-стрептолизин, которые разрушают эритроциты и лейкоциты. Эритрогенные токсины Streptococcus pyogenes синтезируются штаммами, которые вызывают скарлатину. Они оказывают пирогенный эффект и приводят к появлению высыпаний на коже. Эритрогенины стрептококка также проявляют суперантигенные свойства, оказывающие митогенное действие на Т-лимфоциты, стимулируют секрецию макрофагами интерлейкина-1 и фактора некроза опухолей, которые являются медиаторами септического шока.Большинство штаммов стрептококков группы А синтезирует ДНК-азу (стрептодорназу), которая накапливается в гное в результате дезинтеграции полиморфноядерных лейкоцитов и способствуют распространению стрептококков из локальных ячеек.Потенциальными факторами патогенности у энтерококков являются факторы агрегации, адгезин, цитолизины-бактериоцины, протеиназы, желатиназы и казеиназы, внеклеточные металлопептидазы, коллагеназы и др. Адгезинами E. faecalis и E. faecium являются агрегирующие вещества, поверхностные полисахариды и поверхностные белки.Наличие слизистого слоя, который встречается у E. faecalis, тормозит фагоцитоз и внутриклеточную гибель энтерококков, вызывая повышение времени их существования в фагоцитах.Липоевая кислота энтерококков является сильным модулятором иммунологической реакции: стимулирует образование человеческими моноцитами интерлейкина-1β и -6, и TNF-α; является также индуктором интерферона. Поверхностный белок Esp позволяет энтерококкам избегать влияния эффекторов иммунологического ответа [4].1.3 Патогенетические аспекты гнойно-септических заболеваний, вызванных пиогенными коккамиПоскольку стафилококки являются постоянными обитателями кожи и слизистых оболочек, заболевания, вызываемые ими, могут иметь характер либо аутоинфекции (при различных повреждениях кожи и слизистых оболочек, в том числе и при микротравмах), либо экзогенной инфекции, обусловленной контактно-бытовым, воздушно-капельным, воздушно-пылевым или алиментарным (при пищевых отравлениях) способами заражения.Особое значение имеет носительство патогенных стафилококков, так как носители, особенно в медицинских учреждениях (различные хирургические клиники, родильные дома и т. п.) и в закрытых коллективах, могут стать причиной стафилококковых инфекций. Носительство патогенных стафилококков может иметь временный или перемежающийся характер, но особую опасность для окружающих представляют лица, у которых оно является постоянным (резидентные носители). У таких людей стафилококки длительное время и в большом количестве персистируют на слизистых оболочках носа и зева [5]. Стафилококки легко проникают в организм через мельчайшие повреждения кожи и слизистых оболочек и могут вызвать самые различные заболевания — от юношеских угрей (acne) до тяжелейшего перитонита, эндокардита, сепсиса или септикопиемии, при которых летальность достигает 80%. Стафилококки вызывают фурункулы, гидрадениты, абсцессы, флегмоны, остеомиелиты; в военное время они являются частой причиной гнойных осложнений ран; стафилококки играют ведущую роль в гнойной хирургии. Обладая аллергенными свойствами, они могут стать причиной псориаза, геморрагического васкулита, рожистого воспаления, неспецифического полиартрита. Инфицирование стафилококками пищевых продуктов – частая причина пищевых отравлений. Стафилококки являются главными этиологическими агентами сепсиса, в том числе у новорожденных. В отличие от бактериемии, которая является симптомом заболевания и наблюдается при многих бактериальных инфекциях, сепсис представляет собой самостоятельную болезнь с определенной клинической картиной, в основе которой лежит поражение органов ретикулоэндотелиальной системы (системы мононуклеарных фагоцитов — СМФ). При сепсисе имеется гнойный очаг, из которого в кровь периодически поступает возбудитель, разносится по организму и поражает ретикулоэндотелиальную систему (СМФ), в клетках которой он размножается, выделяя токсины и аллергены. При этом клиническая картина сепсиса слабо зависит от вида возбудителя, а определяется поражением тех или иных органов. Септикопиемия — форма сепсиса, при котором возбудитель вызывает гнойные очаги в различных органах и тканях, т. е. это сепсис, осложненный гнойными метастазами [5].Заболевания, вызываемые стрептококками, распределены по 11 классам. Основные группы этих заболеваний следующие: а) различные нагноительные процессы — абсцессы, флегмоны, отиты, перитониты, плевриты, остеомиелиты и др.; б) рожистое воспаление — раневая инфекция (воспаление лимфатических сосудов кожи и подкожной клетчатки); в) гнойные осложнения ран (особенно в военное время) — абсцессы, флегмоны, сепсис и др.; г) ангины — острые и хронические; д)сепсисы: острый сепсис (острый эндокардит); хронический сепсис (хронический эндокардит); послеродовый (пуэрперальный) сепсис; е) ревматизм; ж) пневмонии, менингиты, ползучая язва роговицы (пневмококк); з)скарлатина; и) кариес зубов — возбудителем его чаще всего является S. mutatis. Хотя большая часть патогенных для человека стрептококков относится к серогруппе А, важную роль в патологии человека играют и стрептококки серогрупп D и В. Стрептококки серогруппы D (энтерококки) признаны возбудителями раневых инфекций, различных гнойных хирургических заболеваний, гнойных осложнений у беременных, рожениц и гинекологических больных, инфицируют почки, мочевой пузырь, вызывают сепсис, эндокардит, пневмонии, пищевые токсикоинфекции (протеолитические варианты энтерококков). Стрептококки серогруппы В (S. agalactiae) часто вызывают заболевания новорожденных — инфекции дыхательных путей, менингит, септицемию. Эпидемиологически они связаны с носительством этого вида стрептококков у матери и персонала родильных домов.Анаэробные стрептококки (Peptostreptococcus), которые обнаруживаются у здоровых людей в составе микрофлоры дыхательных путей, рта, носоглотки, кишечника и влагалища, также могут быть виновниками гнойно-септических заболеваний – аппендицита, послеродового сепсиса и др.Стрептококки встречаются на коже и слизистых оболочках. Для некоторых характерная способность вызывать специфические заболевания (бешиха, скарлатина, ревматоидный артрит). Пневмококки (Streptococcus pneumoniaе) являются возбудителями крупозной пневмонии, воспаления среднего уха, патологических процессов легких [5].ГЛАВА 2 НОРМОЦЕНОЗ И ДИСБИОЗ УРОГЕНИТАЛЬНОГО ТРАКТА ЖЕНЩИН2.1 Количественный и качественный состав микрофлоры влагалища при нормоценозеВлагалищная микрофлора индивидуальна и может даже в состоянии нормы зависеть и меняться от фазы менструального цикла. Кроме того, понятие нормы может быть разным для разных возрастных, этнических групп и даже географических зон. Нормоценоз влагалища – это такое состояние микробиоценоза, которое характеризуется абсолютным доминированием лактобактерий, низким титром условно-патогенных микроорганизмов (менее 104 КОЕ/мл при общем количестве микробов 106-108 КОЕ/мл в выделениях влагалища) [6].Микробиоценоз состоит из постоянных жителей (индигенная, или автохтонная, микрофлора) и транзиторных микроорганизмов (случайная, или аллохтонная, микрофлора). Индигенная микрофлора представлена большим количеством клеток бактерий определенных родов, в первую очередь это микроорганизмы родов Lactobacillus (виды L. acidofilus, L. plantarum, L. casei, L. brevis, L. salivarius и некоторые другие) и Bifidobacterium. Количество этих микроорганизмов может достигать 107-109 КОЕ/мл (табл. 1.1) [11]. Транзиторные микроорганизмы представлены значительно более широким спектром родов и видов (около 40), но количество их преимущественно достигает не более чем 104 КОЕ/мл, по некоторым данным – не более 3-5 % от общего содержания бактерий в выделениях. Для оценки наличия нормоценоза/дисбиотичних нарушений влагалища женщин используют следующие показатели: общую бактериальную массу (ОБМ), оценку нормобиоты, оценку аэробной и анаэробной условно-патогенной микрофлоры [10]. Таблица 1.1Критерии количественного и качественного состава биоты влагалища женщинПоказателиАбсолютный показатель, КОЕ/млОтносительный показатель Оценка показателяКонтроль взятия материала>105нетКол-во, оптимальное для получения достоверного результата104-105допустимое кол-во<104необходимо повторное взятие материалаОбщая бактериальная масса (ОБМ)106-108нетнормальный уровень >108повышенный уровень<105 сниженный уровеньMycoplasma hominis<104нетдиагностически незначимый уровень>104диагностически значимый уровеньUreaplasma (urealyticum parvum)<104нетдиагностически незначимый уровень>104диагностически значимый уровеньCandida spp.<103нетдиагностически незначимый уровень>103диагностически значимый уровеньНОРМОФЛОРА - Lg10 ОБМ - Lg10 ЛБLactobacillus spp. (ЛБ)>1050-0,5нормальный уровень0,5-1умеренно сниженный уровень<105>1значительно сниженный уровеньУСЛОВНО-ПАТОГЕННЫЕ МИКРООРГАНИЗМЫ - Lg10 ЛБ - Lg10 УПМEnterobacteriaceae Streptococcus spp.Staphylococcus spp.Gardnerella vaginalis/Prevotella bivia/Porphyromonas spp.Eubacterium spp.Sneathia spp./Leptotrihia spp./Fusobacterium spp. Megasphaera spp./Veilonella spp./Dialister spp.Lachnobacterium spp./ Clostridium spp.Mobiluncus spp./Corynebacterium spp.Peptostreptococcus spp.0-104>3нормальный уровень2-3слабо повышенныйуровень>1041-2умеренно повышенный уровеньОбщая бактериальная масса – это показатель, по которому можно судить об общем количестве бактерий. Оценивается в абсолютных значениях. Обычно эта величина составляет 106-108.Величина ОБМ большая, чем 108, свидетельствует о чрезмерном микробном обсеменении биоматериала. Чем больше величина ОБМ, тем больше величина микробной массы в образце. Величина показателя ОБМ меньшая, чем 105 отвечает сниженному количеству микроорганизмов в образце, который может быть следствием атрофических процессов или антибиотикотерапии.Оценка нормобиоты делается как в абсолютных значениях, так и относительно общей бактериальной массы. В норме абсолютное количество лактобацилл практически не отличается от общего количества бактерий, то есть составляет 106-108. Относительное количество лактобацилл – разница между Lg10 общей бактериальной массы (ОБМ) и Lg10 лактобацилл (ЛБ). Относительное количество того или другого микроорганизма вычисляется по отношению к количеству Lactobacillus spp., по разнице между Lg10 лактобацилл и Lg10 конкретного микроорганизма аналогично тому, как вычисляется относительное количество самих лактобацилл по отношению к общему количеству бактерий (ОБМ) [9]. 2.2 Дисбиоз урогенитального тракта женщин и его классификацияЛюбые качественные и количественные нарушения состава микрофлоры объединяют в понятие дисбактериоз. Дисбиотические явления, в свою очередь, поддерживают параллельные патологические процессы в организме, снижают естественную защитную функцию влагалища, создают угрозу воспалительных заболеваний [2]. На сегодняшний день описывают несколько проявлений дисбиоза влагалища : бактериальный вагиноз, мико- и уреаплазмоз, неспецифический вагинит. Нелечение этих состояний может привести к развитию воспалительных процессов, потенциально опасных возникновением и развитием бесплодия. Возникновение ассоциативных инфекций также является фактором развития передраковых заболеваний шейки матки.Согласно терминологии, принятой на Международной конференции в Стокгольме (1984 год), БВ – это есть инфекционный невоспалительный синдром, связанный с дисбиозом влагалища, которое характеризуется высоким количеством условно-патогенных микроорганизмов и резким снижением или отсутствием лактобацилл [6].Сейчас в медицинской практике существует несколько классификаций дисбиотических состояний. С учетом современных достижений клинической бактериологии и знаний инфекционной патологии женских половых органов Е. Ф. Кира в 1994 году была разработана оригинальная классификация микроскопической характеристики биоценоза влагалища, в котором представлены микроскопическая характеристика 4 типов биоценоза влагалища и отвечающие каждому типу нозологические формы:1. Нормоценоз – характеризуется доминированием лактобактерий, отсутствием грамотрицательной микрофлоры, спор и мицелия дрожжеподобных грибов, наличием единичных лейкоцитов и чистых эпителиальных клеток. Подобная картина отражает типичное состояние нормального биотопа влагалища.2. Промежуточный тип – умеренное или сниженное количество лактобактерий, наличие грамположительных кокков, грамотрицательных палочек. Обнаруживаются лейкоциты, моноциты, макрофаги, эпителиальные клетки. Является пограничным типом, часто наблюдается у здоровых женщин, редко сопровождается жалобами и клиническими проявлениями.3. Дисбиоз влагалища, который выражается в незначительном количестве или полном отсутствии лактобактерий, обильной полиморфной грамотрицательной и грамположительной палочковидной и кокковой микрофлорой, наличием ключевых клеток. Количество лейкоцитов вариабельно, отмечается отсутствие или незавершенность фагоцитоза. Отвечает микробиологической картине бактериального вагиноза.4. Вагинит (воспалительный тип мазка) – полимикробная картина мазка с большим количеством лейкоцитов, макрофагов, эпителиальных клеток; отмечается выраженный фагоцитоз [9, 12].Наиболее популярной является классификация Мавзютова А. Р. с соавт., которые предложили дифференцирование БВ по трем степеням: 1 степень – компенсированный, для которого характерно полное отсутствие в исследуемом материале микрофлоры при неизмененных эпителиоцитах. Указанное состояние слизистой оболочки влагалища не рассматривается в качестве патологического, но отсутствие лактобактериальной микрофлоры свидетельствует о принципиальной возможности заселения пустой экологической ниши микроорганизмами, которые попадают из внешних половых органов, и дальнейшим формированием БВ. Описанная форма может наблюдаться при микроскопии в результате "чрезмерной" подготовки пациентки к посещению врача или же после проведения интенсивной химиотерапии антибактериальными препаратами широкого спектра действия.степень – субкомпенсированный, который характеризуется количественным снижением лактобактерий, соизмеримым с ростом количества сопутствующей бактериальной микрофлоры, и появлением в поле зрения единичных (1-5) "ключевых" клеток при относительно умеренном лейкоцитозе (15-25 в поле зрения). "Ключевые" клетки могут быть представлены как покрытыми извне бактериальной микрофлорой эпитеолиоцитами, так и содержащими бактерии внутри в результате фагоцитоза. 3 степень – декомпенсированный, являющийся клинически выраженным в соответствии с симптоматикой БВ и микроскопически характеризуется полным отсутствием лактобактерий, когда все поле зрения заполнено "ключевыми" клетками. Бактериальная флора при этом может быть представлена самыми разнообразными, при отсутствии лактобактерий, микроорганизмами как в монокультуре, так и в разных морфо- и видовых сочетаниях.