Фармацевтический анализ аминокислот

Заключение
В работе проведен анализ и систематизация известных в настоящее время методов определения АК в различных объектах. Титриметрические методы (продолжающие оставаться самыми доступными и точными) рекомендованы нормативной документацией и широко используются для количественного определения АК в фармацевтических субстанциях или однокомпонентных ЛП АК.
УФ-спектрофотометрия, ИК-спектроскопия, спектроскопия ЯМР (высокоинформативные методы, используемые в основном для анализа АК в субстанциях или монопрепаратах) не могут быть использованы в анализе многокомпонентных смесей АК без предварительного разделения. Кроме того, ЯМР-спектрометры попрежнему остаются труднодоступными для региональных контрольноаналитических лабораторий. Спектрофотометрия в видимой области и фотоэлектроколориметрия, ...

Оглавление

Введение 3
Фармацевтический анализ аминокислот 5
Заключение 32
Список литературы 35

Введение
Современная практика фармацевтического анализа представляет все более четкие требования к методам и методикам, используемым при оценке качества лекарственных средств (ЛС). Немаловажная роль в совершенствовании фармацевтического анализа наряду с использованием современного оборудования и реактивов отводится внедрению стандартных образцов качества ЛС.
Существовали и существуют различные подходы к определению стандартных образцов, однако, их роль в развитии системы стандартизации ЛС однозначна.
Согласно определениям, приводимым в наиболее известной системе обеспечения качества ИСО (Международной организации по стандартизации), которая издала несколько руководств, касающихся практики работы и требований, предъявляемых к стандартным образцам[2]:
- стандартный образец – это вещество, до статочно однородное и стабильное в отношении некоторых специфических свойств, которое признано подходящим к применению при проведении измерений или испытаний указанных свойств;
- аттестованный стандартный образец – это стандартный образец, к которому прилагается документация, выданная официальным уполномоченным органом, в котором представлены одно или несколько значений специфических свойств с указанием соответствующей неопределенности и прослеживаемости, полученных валидированными (аттестованными) методами [1]. При этом, в случае обоих определений особое значение придается понятию «прослеживаемости», которое определяется как свойство результата измерения или значения эталона, заключающееся в возможности соотнесения с принятыми эталонами, национальными или международными, посредством неразрывной цепи сравнений, каждое из которых вносит вклад в общую неопределенность.
Аминокислоты (АК) – это гетерофункциональные органические соединения, в состав молекулы которых входят карбоксильная и аминогруппы. Чаще всего под этим названием подразумевают αАК вследствие их исключительного значения как составляющей части биополимеров – белков. В природе встречается более 70 АК, почти все они, за исключением пролина и оксипролина, имеют структуру типа RCH(NH2)CO2H [1].
АК являются весьма сложным объектом для химического анализа. Это обусловлено, во-первых, наличием в молекулах гидрофобных (неполярные углеводородные фрагменты) и гидрофильных (карбокси-, амино-, гидрокси- и меркапто-) группировок. Вовторых, амфотерный характер АК за счет наличия в структуре основных и кислотных функций приводит к возникновению в нейтральных растворах АК цвиттериона [3]. Поэтому при анализе АК необходимо учитывать величину изоэлектрической точки (рН растворов). И наконец, все природные АК, кроме глицина, ввиду своего хирального строения могут существовать в виде различныхэнантиомеров.
Целью настоящей работы является изучение фармацевтического анализа аминокислот.

Данная реакция впервые была открыта Руманом. Позднее установлено, что нингидрин специфичен к алифатическим или алициклическим первичным аминогруппам. Вторичные, третичные и четвертичные амины, амиды и аминозамещенные ароматические соединения дают слабую реакцию или не дают вовсе. Исключение – пролин, который образует с нингидрином окраску желтого цвета, как считают некоторые исследователи, благодаря раскрытию цикла [1].Спектральные характеристики продуктов реакции АК с нингидрином представлены в таблице 3.Таблица 3Характеристика спектров поглощения продуктов реакции α-АК с 0,2% раствором нингидрина в ацетоне [2]№ п/пАКМаксимумы поглощения, нмУФ-областьВидимая область1Аланин231, 251401, 5672Аргинин232, 256400, 5613Аспарагин231, 256400, 5684Аспарагиновая кислота230, 256400, 5645Валин230, 257400, 5606Гистидин229, 255401, 5687Глицин231, 256401, 5688Глутамин230, 256401, 5669Глутаминовая кислота230, 256400, 56810Изолейцин230, 257399, 56511Лейцин237, 258400, 56512Лизин230, 255400, 56513Метионин230, 254401, 56614Серии230, 256401, 56715Треонин230, 256402, 56716Тирозин228, 258400, 56717Триптофан229, 263401, 56818Цистеин230, 257401, 56619Фенилаланин230, 255401, 56420Пролин299, 343416ИК-спектроскопияВ ИК-спектрах АК отсутствуют полосы нормальных валентных колебаний в области 3300-3500 см-1, наблюдается поглощение при 30-70 см -1, которое можно отнести к H3N+-группе (рисунок 4). Эта полоса наблюдается также в спектрах гидрохлоридов АК. Рисунок 4. ИК-спектр L-аланина [1]ЯМР-спектроскопия 1Н-ЯМР-спектроскопические исследования АК показали, что химический сдвиг протонов АК, а также константы протонпротонного взаимодействия зависят от заряженного состояния молекулы. В графическом изображении зависимость химического сдвига от pH имеет вид типичной кривой титрования. В качестве растворителей для ЯМР-спектроскопии АК, пептидов и белков служит обычно вода или D2O, а в качестве внутреннего стандарта применяют тетраметилсилан, гексаметилдисилоксан и 2,2-диметил-2-силапентан-5-сульфонат (ДСС).В случае 13С-ЯМР-спектроскопии, которая применяется для выяснения строения неизвестных соединений и для аналитической характеристики простых производных АК и пептидов, резонансные пики свободных АК лежат для карбоксильных групп между –168 и –183 м.д., для αуглеродного атома – между –40 и –65 м.д., для βуглеродного атома – между –17 и –70 м.д. и для γ и δ-углеродных атомов – между –17 и –50 м.д. Сигналы атомов углерода ароматических и гетероароматических колец находятся между –110 и –140 м.д. На рисунке 5 приведен 13С-ЯМР-спектр аспарагиновой кислоты [1]. Рисунок 5. 13С-ЯМР-спектр аспарагиновой кислоты [1] Масс-спектрометрический анализ АК Для α-АК характерно разложение на стабилизированные мезомерией иминиевые ионы и относительно устойчивый радикал СООН и радикал боковой цепи (рисунок 6). Дальнейшее фрагментирование зависит от строения боковой цепи. В связи с трудной летучестью АК проба вносится в ионный источник массспектрометра при 104-105 Па и 100150 °С. Благоприятно введение летучих производных АК, которые применяются и для газовой хроматографии. Рисунок 6. Масс-спектр треонина (70 эВ) [1] Массспектроскопия приобрела особое значение при анализе аминокислотных последовательностей белков. Можно легко определять отдельные АК, так как благодаря высокой интенсивности молекулярных пиков изза малого фрагментирования и относительно слабого межмолекулярного взаимодействия получают спектры высокого разрешения [3].Хроматографические методыОсновными достижениями ГХ являются получение стабильных сорбентов с химически привитыми (иммобилизованными) фазами для насадочных и капиллярных колонок, а также разработка и внедрение капиллярных колонок относительно большого диаметра (0.32 и 0.53 мм) и большой емкости с толщиной привитой пленки жидкой фазы до 5 мкм (и даже до 16 мкм), а также капиллярных колонок PoraPLOT с закрепленным адсорбционным слоем (оксида кремния или алюминия, цеолита, углеродных адсорбентов и пористых полимеров).На таких стабильных колонках можно создавать банки (библиотеки) параметров удерживания для идентификации неизвестных компонентов смесей. Весьма информативным считается сочетание банков параметров удерживания с банками масс-спектров. В целом создание стабильных хроматографических колонок привело к большей надежности и точности хроматографических определений. Для определения микропримесей на капиллярных колонках разработаны методы дозирования больших проб в колонки (наколоночный ввод, криофокусировка, ввод пробы с отдувкой растворителя и др.). Стабильности работы хроматографов способствовало внедрение электронного контроля расхода газа-носителя и давления. Электронно-управляемый режим регулирования расхода газа-носителя позволил создать программу автоматического поддержания времени удерживания при смене колонок.В последние годы в аналитическую практику были внедрены поликапиллярные колонки, которые позволяют проводить экспрессное разделение смесей без режима программирования температуры колонки. Жидкостная хроматографияПоследние достижения в аналитической жидкостной хрома-тографии связаны с разработкой и внедрением методов высокоэффективной капиллярной электрохроматографии, которая сочетает хроматографические и электрофоретические способы разделения. Только благодаря сочетанию разнообразных методов жидкостной хроматографии и капиллярного электрофореза стали возможными расшифровка нуклеотидной последовательности ДНК и завершение работ по программе «Геном человека».Возможности жидкостной хроматографии значительно расширились с внедрением методов хиральной, иммуноаф-финной, высокотемпературной и перфузионной хроматографии. Представляет интерес экспрессная хроматография белков на непористых частицах.42Ведется интенсивная разработка новых высокостабиль-ных и селективных сорбентов на основе диоксидов циркония и титана, пористых полимеров и углеродных адсорбентов, устойчивых во всем диапазоне рН.43 Для ВЭЖХ разработан и выпускается широкий ассортимент сорбентов. Десятки фирм в мире производят более 300 типов сорбентов. Чаще всего в ВЭЖХ применяют чистые силикагели и силикагели с привитыми неполярными и полярными группами (их доля составляет 70%). Реже используют полимеры, например сополимеры стирола с дивинилбензолом, полиметакрилаты, целлюлозы и др. (20%); пористые углеродные сорбенты и пористые оксиды титана или циркония (4%); оксид алюминия (1%).В аналитической практике наибольшее применение находит обращенно-фазовый вариант ВЭЖХ (более 70% хроматографических анализов проводится с использованием этого варианта ЖХ), где в качестве сорбентов используется сили-кагель с привитыми алкильными группами (длина алкильных цепей колеблется от d до С34; чаще всего применяют С18 иС8).В зависимости от способа синтеза сорбенты С18 бывают мономерными или полимерными. Полимерные сорбенты С18 получают с использованием трифункциональных силанов в присутствии воды, а мономерные — с использованием монофункциональных силанов. В некоторых случаях, в частности при разделении сложной смеси изомеров полиядерных ароматических углеводородов, полимерные сорбенты Ci8 предпочтительнее. Удерживающая способность и селективность мономерных Ci8 к неполярным и слабополярным соединениям зависит от числа привитых алкильных цепей (или от общего содержания углерода на единицу веса сорбента, которое колеблется от 8 до 20%). Небольшая доля углерода приводит к малой емкости сорбента, быстрому разделению и быстрому установлению равновесия при градиентном элюи-ровании.Однако сорбенты на основе силикагеля с привитыми алкильными группами имеют много недостатков. Они не-устойчивы в кислых и щелочных средах: при рН < 3 происходит гидролиз связи Si —О —Si, а при рН > 10 — растворение силикагеля (особенно при высоких температурах). Эти сорбенты не селективны при разделении полярных соединений и изомеров, а характеристики соединений основного характера, определяемые с помощью этих сорбентов, существенно зависят от чистоты, геометрии и химической природы силикагеля, а также от способа прививки алкильных групп и пр.В последние годы ведется большая работа по устранению перечисленных недостатков. Прежде всего, усовершенствуется производство исходных силикагелей. Налажен выпуск силикагелей особой чистоты (с ничтожным содержанием тяжелых металлов) в виде сферических частиц, причем их состав и форма от партии к партии не меняются. К сожалению, добиться связывания всех гидроксильных групп в силикагеле никогда не удается. Остаточные гидроксильные группы могут участвовать в нежелательных взаимодействиях с небольшими полярными молекулами, что приводит к появлению несимметричных пиков. Предложено блокировать ОН-группы более объемными изопропильными или изобутильными группами (сорбент Zorbax Stable Bond). Заблокировать остаточные гидроксильные группы можно, прививая на силикагель бидентатные реагенты, в которых две соседние алкильные цепи связаны между собой мостиком из 3-4-х метиленовых групп. Эти мостики закрывают ОН-группы, в результате чего такие сорбенты намного стабильнее и работают даже при повышенных рН (Zorbax Extend-Ci8). Для повышения селективности сорбентов на основе силикагеля, содержащего привитые алкильные группы, к полярным соединениям алкильные цепи модифицируют полярными группами, в частности карбамидными.Силикагели со средними размерами пор 80, 100 и 120 А применяют для разделения низкомолекулярных соединений, а силикагели с порами 5= 300 А — для разделения высокомолекулярных соединений и биополимеров. Так, силикагель, модифицированный С30-алкильными группами, был использован для разделения полиядерных ароматических соединений, олигонуклеотидов, фуллеренов и алкилбензолов.Среди других сорбентов, применяемых в обращенно-фазовой хроматографии (ОФХ), следует выделить сорбенты на основе полиэтиленгликолей, которые используются для разделения фенольных соединений, а также перфторированные сорбенты для анализа галогенсодержащих соединений.Предложены полимерные сорбенты на основе поли(ди-винилбензола) с порами 500 и 1000 А (фирма «Jordi»),В настоящее время выпускаются сотни типов сорбентов. Для правильного выбора сорбентов для ОФХ разработаны разные системы оценок.К достижениям последних лет следует отнести разработку колонок для турбулентной хроматографии. В колонках диаметром 1 мм, заполненных частицами размером 50 мкм, используются большие скорости потока, при этом крупные молекулы белков не удерживаются, а небольшие молекулы успевают диффундировать в поры и удерживаются.В последнее десятилетие достигнут значительный прогресс в технологии получения новых типов сорбентов и колонок для ВЭЖХ. В частности, разработаны сорбенты для перфузионной хроматографии (ПХ); созданы монолитные колонки с единым пористым блоком полимерного материала или силикагеля.Перфузионая хроматография впервые была применена в 1990 г., а позднее была разработана ее теория. Перфузион-ную хроматографию чаще всего используют для препаративного выделения веществ (в частности, белков) в чистом виде, и в меньшей степени — для целей анализа (например, для анализа пищевых белков). Перфузионные колонки считаются промежуточными между обычными насадочными колонками и монолитными. В перфузионных колонках микропотоки элюента проходят сквозь зерна сорбента, а не огибают их, как в обычных насадочных колонках. Обычно в качестве сорбентов в ПХ используют сополимеры стирола и дивинилбензола. Такие сорбенты представляют собой частицы диаметром ~20 мкм, содержащие два типа пор: большие поры (6000-8000 А), по которым элюент проходит через зерна, и диффузионные поры (800 -1500 А), по которым вещества легко проникают в поры сорбента. В связи с улучшением процесса массообмена в перфузионных колонках можно использовать большие скорости элюента, сокращая при этом время разделения. Это особенно важно для больших молекул. В настоящее время производятся перфузионные сорбенты для разных вариантов хроматографии: для ОФХ, нормально-фазовой, ионообменной, гидрофобной и аффинной.Ионная хроматография К основным достижениям ионной хроматографии следует отнести разработку экспрессных монолитных колонок для сверхбыстрого разделения веществ, в частности, неорганических анионов; колонок для одновременного разделения и детектирования анионов и катионов; создание сорбентов для микро-насадочных и капиллярных колонок; расширение набора используемых детектирующих систем для ионных хроматографов (до 10 типов), в частности, создание импульсного амперометрического детектора для определения углеводов, аминокислот, биогенных аминов и спиртов; разработку генератора элюента (система «добавь только воду») и 10-портового крана для анализа проб с сильно различающимися концентрациями; использование неметаллических материалов (керамики, пластика РЕЕК, сапфира, тефлона и др.) в насосах и трактах для жидкостей в ионных хромато¬графах; внедрение системы «heart-cut» для сброса части пробы с целью исключения ее попадания в колонку; повышение чувствительности и стабильности детектирующих систем в определении ионов до уровня.Тонкослойная хроматографияВ своем обычном исполнении тонкослойная хроматография (ТСХ) — массовый, простой и дешевый метод хроматографии, использующийся для обнаружения и определения веществ разных классов. В ТСХ разделение обычно проводят на пластинах из стекла, металла или пластмассы размером 100 х 100 мм, содержащих слой адсорбента толщиной 50-300 мкм с размером зерен от 3 до 15 мкм. В настояее время чаще всего применяют четыре типа пластин: классические, высокоэффективные, микропластины и препаративные.Основными адсорбентами, используемыми в ТСХ, являются силикагель, силикагель с привитыми алкильными группами, оксид алюминия, целлюлоза, циклодекстрины, флорисил (силикат магния), неорганические ионообменники и др. К основным преимуществам ТСХ относятся одновременное параллельное разделение нескольких проб (до 10 и более), высокая производительность, возможность двумерного разделения, быстрота и дешевизна определения. Положительным фактором является то, что процесс разделения можно наблюдать; в частности, на старте можно увидеть остатки нерастворимой пробы. К недостаткам ТСХ относится открытость разделительных пластин, из-за чего соединения, неустойчивые к действию кислорода и влаги, могут разлагаться.Для детектирования пятен на пластине используются различные методы, включая масс-спектрометрию, рамановскую спектрометрию, спектрофотометрию с диодной матрицей, пламенно-ионизационный детектор, флуоресцентные индикаторы. Применяют также электрохимическое детектирование.В последние годы методы ТСХ постоянно развивались и совершенствовались. Были предложены новые варианты ТСХ: полиамидная, тонкопленочная, высокоэффективная, ротационная, двухразмерная, мицеллярная, проточная и др/ для количественного определения веществ с помощью ТСХ разработаны денситометры. Для разделения оптических изомеров используют хиральные пластины.Стандартизация метода ТСХ — подготовка адсорбентов, создание пластинок, обработка результатов разделения — способствовала широкому внедрению ТСХ в аналитическую практику лабораторий многих отраслей промышленности.Лигандообменная хроматография В 1966 г. Сигель и Дедженс впервые продемонстрировали исключительные возможности лигандообменных систем в сорбции АК. Для селективного связывания свободных АК из морской воды эти исследователи использовали ионообменник хелекс100 на основе полистирола, содержащий остатки иминодиацетатных групп в форме комплексов с медью (II). Сорбированные на ионах меди АК затем вытесняли раствором аммиака и подвергали стандартному аминокислотному анализу. К середине 1960х годов относятся и первые попытки решить другую практически важную проблему – отделить АК от пептидов путем использования реакции комплексообразования. Сшитый декстрановый гель сефадекс G25 в щелочной среде заряжали ионами меди (II). При пропускании через данный сорбент смеси АК и пептидов пептиды первыми выходили из колонки. В щелочном элюенте пептиды снимают медь с сефадекса, образуя с ней стабильные комплексы, которые слабо удерживаются сорбентом. Пептиды координируют медь через концевую аминогруппу и соседнюю аминную группировку, теряющую свой амидный протон, поэтому в щелочной среде комплексы меди с пептидами заряжены отрицательно. Декстрановые гели при высоких значениях pH также заряжены отрицательно [21].Тонкослойная хроматография (ТСХ). Несмотря на широкое внедрение методов ГЖХ и ВЭЖХ, анализ АК с помощью ТСХ в настоящее время используется также довольно широко [1]. Наиболее часто для проявления хроматограмм используют свежеприготовленные спиртовые и ацетоновые 0,22% растворы нингидрина, однако в анализе отдельных АК нередко применяют более специфичные реагенты. Так, разработан хроматоденситометрический экспрессметод анализа в культуральных жидкостях триптофана, в котором используется 4диметиламинобензальдегид, избирательный к индольному кольцу, в виде 0,5% этанолового раствора с добавлением 5% кислоты серной концентрированной [1].Основной задачей при разработке новых методик анализа является выбор систем растворителей, обеспечивающих разделение всех исследуемых АК. При изучении аминокислотного состава различных объектов используются в основном подвижные фазы, представленные в таблице 7. Анализируя данные таблицы 7, можно сделать заключение о том, что наилучшее разделение зон АК на хроматограммах наблюдается при использовании подвижных фаз в диапазоне полярностей от 4,5 до 6,0.Таблица 4Элюенты, используемые в литературе для разделения и определения АК [1]№ п/пСостав растворителейСоотношениеПолярность по Снайдеру1н-пропанол – вода(70:30)5,572хлороформ – метанол – 10% раствор аммиака(40:40:20)–3н-бутанол – ледяная уксусная кислота – вода(40:10:5)4,784н-бутанол – ледяная уксусная кислота – вода(40:10:10)5,135н-бутанол – ледяная уксусная кислота – вода(40:10:20)5,696н-бутанол – диэтиловый эфир – ледяная уксусная кислота – вода(9:6:3:1)4,22796% этанол – концентрированный аммиак(16:4,5)–8пропанол-2 – 25% раствор аммония гидроксид(7:3)–9пропанол-1 – 25% раствор аммония гидроксид(55:45)–10пропанол-2 – ацетон – 25% раствор аммония гидроксид – вода(25:25:6:7)–11пропанол-2 – этилацетат – 25% раствор аммония гидроксид – вода(20:20:1,5:2,5)–12метанол – хлороформ – 17% раствор аммиака(40:40:20)–13н-пропанол – ледяная уксусная кислота – вода(80:20:20)5,2614Конц.