Сравнительная характеристика наборов различных производителей для определения концентрации глюкозы в крови

ВЫВОДЫ
Таким образом, проведенный анализ, имеющихся наборов для определения концентрации глюкозы в крови, выявил, что наиболее удобными, максимально безопасными и эффективными в использовании, а также недорогими, являются наборы реагентов от российского производителя (что на сегодняшний день весьма важно при проводимой политике импортозамещения) ООО «АБРИС». Именно реагенты данной фирмы широко используются в деятельности отечественных КДЛ и дают весьма неплохие количественные и качественные результаты.


...

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ 4
ГЛАВА 1. НЕОБХОДИМОСТЬ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ НАБОРОВ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОНЦЕНТРАЦИИ ГЛЮКОЗЫ В КРОВИ В ДЕЯТЕЛЬНОСТИ ЛПУ 7
1.1. Определение уровня глюкозы в крови: основные понятия, определения, причинно-следственные связи, заболевания и методики определения 7
1.2. Методы определения глюкозы в биологических жидкостях 17
1.3. Методы определения глюкозы в сыворотке крови 37
1.4 Ведущие производители наборов для определения концентрации глюкозы в крови, используемых в деятельности ЛПУ 46
ГЛАВА 2. СРАВНИТЕЛЬНАЯ ОЦЕНКА НАБОРОВ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОНЦЕНТРАЦИИ ГЛЮКОЗЫ В КРОВИ, ИСПОЛЬЗУЕМЫХ В ДЕЯТЕЛЬНОСТИ ЛПУ 53
2.1. Основные показатели, по которым оценивается эффективность наборов для определения концентрации глюкозы в крови, используемых в деятельности ЛПУ 53
2.2. Сравнительная характеристика используемых в деятельности ЛПУ наборов для определения концентрации глюкозы в крови 53
ВЫВОДЫ 59
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 60

ВВЕДЕНИЕ
Концентрация глюкозы в крови измеряется при заболеваниях поджелудочной железы, щитовидной железы, гипофиза, надпочечников, почек, печени, кишечника, при травматическом, токсическом раздражении ЦНС и целом ряде других патологических состояний. Ежегодно в мире увеличивается число больных сахарным диабетом. Все это подчеркивает необходимость получения быстрых и надежных сведений о содержании глюкозы в крови, помогающих клиницисту поставить диагноз и осуществлять наблюдение за успешностью лечения.
Определение концентрации глюкозы в крови – одно из наиболее часто выполняемых биохимических исследований в клинико-диагностической лаборатории. Причина исключительной популярности теста связана с высокой заболеваемостью сахарным диабетом. Больные сахарным диабетом вынуждены исследовать уро вень глюкозы в крови так в условиях ЛПУ, так и в домашних условиях, поскольку без этой информации им трудно скорректировать свою диету, физические нагрузки, применение инсулина и других сахароснижающих препаратов. Исключительная важность теста и большие объемы выполняемых исследований стимулировали разработчиков к созданию различных типов приборов и методов определения концентрации глюкозы в крови.
Клиническая лабораторная диагностика играет все более важную роль на современном этапе развития практической медицины. Согласно данным ВОЗ:
- удельный вес лабораторных исследований составляет 75—90% от общего числа различных видов исследований, проводимых больному в лечебных учреждениях;
- в 60-70% клинических случаев правильный диагноз пациенту врачи устанавливают на основании результатов лабораторных исследований;
- более 70% врачебных решений принимается на основании полученных результатов лабораторных исследований;
- в 65% случаев результатов лабораторных исследований, выполненных по неотложным показаниям, приводят к коренному изменению терапии, что позволяет спасти жизни пациентов.
В РФ функционирует более 8000 клинико-диагностических лабораторий (КДЛ), которые выполняют около 3,5 млр. анализов в год. Однако почти 80% в структуре лабораторных анализов приходится на низкоинформативные виды исследований - общеклиническое исследование крови и мочи, в то время, как современная клиническая практика нуждается в высокоинформативных видах лабораторных анализов. Низкое качество и информативность лабораторных исследований сформировало недоверие врачей к результатам анализов. При переходе пациента с одного уровня оказания медицинской помощи на другой, или переводе в другое лечебно-профилактическое учреждение (ЛПУ), повторно выполняется до 40% лабораторных исследований, поэтому весьма актуальным становится вопрос перед персоналом лаборатории о качественности и эффективности используемых диагностических реактивов и реагентов для определения тех или иных жизненно важных веществ в биологических средах организма.
В связи с чем, целью данной работы явилась разработка критериев эффективности при проведении сравнительной характеристики наборов различных производителей для определения концентрации глюкозы в крови.
Для реализации завяленной цели необходимо решение следующих задач:
- анализ теоретической литературы по проблеме исследования;
- проведение аналитического анализа полученной информации;
- разработка критериев эффективности и необходимости при проведении сравнительной характеристики наборов различных производителей для определения концентрации глюкозы в крови, используемых в условиях ЛПУ;
- проведение сравнительной характеристики наборов различных производителей для определения концентрации глюкозы в крови, используемых в условиях ЛПУ и выбор наилучшего набора, основываясь на разработанных и предложенных критериях эффективности и качественности.
Предмет исследования – процесс определения концентрации глюкозы в крови.
Объект исследования - наборы различных производителей для определения концентрации глюкозы в крови, используемые в условиях КДЛ.
Исследование проводилось на базе КДЛ 122 МЧС ФМБА РФ по СПб и Ленинградской области.

Реакция основана на способности сахара (глюкозы) восстанавливать гидрат окиси меди Сu(OH)2 в гидрат закиси меди CuOH и закись меди Сu2O — желто-красный осадок:
2. Реакция со щелочным раствором висмута — реакция Ниландера (Nylander E., 1883).
В данной пробе используют гидроокись висмута Bi(OH)3, образующуюся при смешении азотнокислого висмута Bi(OH)2NO2 c едким натром:
Реакция основана на способности сахара (глюкозы) восстанавливать азотнокислый висмут в металлический висмут, при этом образуется темно-бурый или черный осадок.
Указанные реакции протекают не стехиометрически, зависят от рН раствора, времени реакции, температуры и концентрации реактивов. При соблюдении условий реакция воспроизводима и обеспечивает получение достаточно надежных результатов [5].
Наиболее «живучей» оказалась проба Бенедикта (Benedict S., 1909). Она основана на том же принципе, что и проба Фелинга, за исключением того, что вместо сегнетовой соли используется цитрат калия или натрия. Это позволяет для ее проведения использовать реактивы в таблетированной форме. Таблетки, входящие в состав набора («Clinitest»), содержат безводный сульфат меди, гидроксид натрия, лимонную кислоту, бикарбонат натрия (NaHCO3). После смешивания в пробирке нескольких капель мочи (≈0,25 мл) с 0,5 мл воды в нее вносят таблетку и оставляют на 15 с. Затем содержимое пробирки перемешивают и сравнивают окраску содержимого с цветовой шкалой. Взаимодействие гидроксида натрия и воды приводит к повышению температуры. В результате реакции между лимонной кислотой и NaHCO3 образуется углекислота, что предотвращает окисление ионов меди кислородом воздуха.
XX век. Количественные методы. Начало XX века характеризовалось разработкой количественных методов, которые были основаны на «редуцирующих» свойствах сахара. В частности, так называемый неокупроиновый метод широко использовался в проточных анализаторах компании «Technicon» и применялся в лабораториях до середины 1960-х гг. [6].
Популярные в свое время методы определения глюкозы в крови были основаны на восстановлении глюкозой при участии ионов меди фосфорно-молибденовой кислоты (Folin–Wu) или мышьяково-молибденовой кислоты (Somogyi–Nelson) с образованием окрашенных комплексов молибдена:
Неокупроин (2,9-диметил-1,10-фенантролин) может также быть восстановлен при участии ионов меди с образованием окрашенного цветного комплекса:
Несмотря на то, что этот метод чувствительнее, чем другие способы, основанные на восстановлении ионов меди, он также не обладал требуемой специфичностью. Данная группа методов в настоящее время не используется и представляет только исторический интерес.
Широкое распространение в лабораториях методов объемного анализа в 1930–50-х гг. позволяло использовать для количественного определения сахара в крови метод, предложенный Hagedorn и Iensen и получивший название феррицианидный метод, поскольку в реакции использовался феррицианид калия.
Феррицианидный метод. В щелочной среде при температуре кипения в присутствии глюкозы феррицианид калия K3Fe(CN)6 восстанавливается в ферроцианид калия K4Fe(CN)6. О количестве глюкозы в исследуемом образце судили по остатку феррицианида калия, который определяли йодометрическим титрованием. При адаптации метода к автоанализаторам за ходом реакции следили по уменьшению интенсивности окраски раствора, обусловленной феррицианидом калия. В более поздних вариантах метода в 1960–70-х гг. использовали непрямое измерение феррицианида после его реакции с ионами железа и образованием комплекса, окрашенного в синий цвет. В настоящее время данный метод не используется. Специфичность метода невелика; наличие креатинина и мочевой кислоты приводит к ложному завышению результатов [7].
Ортотолуидиновый метод был первым химическим методом, в котором не использовались «редуцирующие» свойства глюкозы. Это открыло эру определения так называемой истинной глюкозы [8].
Ряд ароматических аминов: анилин, бензидин, 2-аминодифенил и о-толуидин — реагируют с глюкозой в кислой среде и образуют окрашенные комплексы. Из ряда перечисленных соединений нашел применение о-толуидин. Он конденсируется с альдегидной группой глюкозы, образует равновесную смесь из глюкозамина и шиффова основания. Дальнейшие перегруппировки приводят к образованию смеси хромогенов сине-зеленого цвета с максимумом поглощения при 630 нм [9]. Определение глюкозы с о-толуидином обычно выполняют после осаждения белков сыворотки крови в кислой среде, хотя реакция может быть проведена непосредственно с сывороткой без осаждения белков:
Данная реакция неспецифична по отношению к глюкозе, многие углеводы способны вступать в реакцию с о-толуидином. Фруктоза с о-толуидином реагирует слабо, при реакции с галактозой развивается интенсивная окраска. Эти моносахариды обычно присутствуют в крови в низкой концентрации, в некоторых случаях, например, при галактоземии или при проведении нагрузки (проба с ксилозой), они могут вмешиваться в определение глюкозы. Интенсивность поглощения комплекса зависит от условий фотометрии. Пентозы реагируют с о-толуидином и образуют комплекс оранжевого цвета с максимумом поглощения около 480 нм. Измерение поглощения при двух длинах волны позволяет определять ксилозу в присутствии глюкозы [10].
Современные подходы к определению концентрации глюкозы
Используемые в настоящее время методы определения глюкозы в крови и моче представляют собой несложные аналитические процедуры. Эти методы подробно изучены и оценены с точки зрения надежности, чувствительности и воспроизводимости [11, 12]. В настоящее время в лабораториях практически повсеместно используют ферментативные методы — гексокиназный или глюкозооксидазный. По данным Коллегии американских патологов (САР), в 1991 г. гексокиназный метод использовали в более чем половине всех лабораторий. Практически полностью лаборатории отказались от о-толуидинового метода [13].
Ферментативные методы
1. Гексокиназный метод
«Классический» спектрофотометрический вариант. Глюкоза под действием гексокиназы (ГК) при участии АТФ превращается в глюкозо-6-фосфат (Г-6-Ф), который под действием глюкозо-6-фосфат-дегидрогеназы (Г-6-ФДГ) превращается в 6-фосфоглюконо-d-лактон. Количество НАДФН2, образовавшегося в ходе данной реакции, пропорционально количеству глюкозы в среде инкубации и может быть определено по изменению поглощения.
При использовании дрожжевой Г-6-ФДГ коферментом служит НАДФ. НАД в качестве кофермента применяют при использовании бактериальной Г-6-ФДГ (Leuconostoc mesenteroides).
Данный метод рассматривают в качестве референтного. Белки сыворотки или плазмы крови осаждают растворами гидроксида бария Ba(ОН)2 и сернокислого цинка (ZnSO4). Надосадочную жидкость смешивают с рабочим реактивом, содержащим АТФ, НАД, гексокиназу, глюкозо-6-фосфатдегидрогеназу. После окончания реакции определяют величину поглощения при длине волны 340 нм.
Для данного метода пригодна сыворотка или плазма, полученная с использованием NaF, ЭДТУК, гепарина, оксалата или цитрата. Гемолизированные образцы, содержащие больше 5 г/л гемоглобина, непригодны, поскольку ферменты эритроцитов и некоторые эфиры фосфорной кислоты способны при такой концентрации вмешиваться в реакцию.
2. Глюкозооксидазный метод
Фермент глюкозооксидаза (D-глюкоза: кислород-оксидоредуктаза, КФ 1.1.3.4) катализирует окисление глюкозы до глюконовой кислоты и образование перекиси водорода H2O2:
Фермент пероксидаза в присутствии перекиси водорода окисляет хромогенный краситель типа о-дианизидина, что приводит к образованию окрашенного продукта, интенсивность окраски которого пропорциональна содержанию глюкозы в среде инкубации:
Фотометрию проводят при длине волны 400 нм.
Глюкозооксидазный метод пригоден для определения глюкозы в спинномозговой жидкости. В моче содержатся высокие концентрации веществ, способных вмешиваться в пероксидазную реакцию, в частности, мочевая кислота, что способствует получению ложноотрицательных результатов. В связи с этим глюкозооксидазный метод следует с осторожностью использовать для определения глюкозы в моче. Результаты реакции глюкозооксидаза — пероксидаза — 4-аминофеназон обычно регистрируются между 500 и 525 нм. Данная процедура адаптирована ко всем автоанализаторам, включая и те, в которых используют технологию «сухой химии».
Другие производители тест-полосок используют другие соединения, например, 3,3,5',5'-тетраметилбензидин и 1,7-дигидронафталин, чьи окисленные формы приобретают окраску. Образец сыворотки, плазмы, мочи или спинномозговой жидкости (10 мкл) наносится на поверхность слоя, содержащего реагенты. Глюкоза реагирует с реагентами, приводя к образованию окрашенного продукта. Интенсивность окрашивания измеряют с помощью отражательного фотометра. Преимущества этой системы включают небольшой объем образца, отсутствие жидких реактивов и высокую устойчивость при хранении. Реакция, приспособленная к тест-полоскам, широко используется для выявления глюкозы в моче или сыворотке крови [19].
Модификации метода
Уникальную специфичность глюкозооксидазной реакции использовали для создания автоматизированных методов определения глюкозы с высокой специфичностью и точностью. Эти процедуры основаны на регистрации потребления кислорода при помощи кислородного электрода в процессе окисления глюкозы после добавления образца к раствору, содержащему глюкозооксидазу [20]. Поскольку измерение убыли кислорода относится только к первой реакции, определение становится более специфичным по отношению к глюкозе, так как исключается вторая менее специфичная стадия реакции при участии пероксидазы. Для предотвращения образования кислорода из H2O2 при участии каталазы, присутствующей в некоторых образцах глюкозооксидазы, H2O2 удаляется из реакционной среды с помощью двух дополнительных реакций:
Метод был использован для определения глюкозы в моче, сыворотке, плазме крови или спинномозговой жидкости. В то же время данный подход не может использоваться для определения глюкозы в цельной крови, так как клетки крови способны поглощать кислород.
В настоящее время для определения содержания глюкозы в цельной крови широко применяются так называемые биосенсоры глюкозы [21]. Отличие данной группы «прямых» методов состоит в том, что с их помощью определяют активность глюкозы в цельной крови и плазме, в отличие от большинства «непрямых» лабораторных методов, предназначенных для определения концентрации глюкозы.
«Прямые» методы определения глюкозы
При иммобилизации глюкозооксидазы на одной стороне мембраны с небольшим размером пор и ее размещении поверх рабочего платинового электрода система начинает функционировать как биосенсор глюкозы. Диффузия глюкозы через наружную мембрану к слою фермента приводит к образованию потока перекиси водорода к поверхности электрода. Ее количество оценивается по увеличению тока электрода.
Прямое определение глюкозы биосенсором с участием глюкозооксидазы протекает по следующим химическим реакциям:
Образование перекиси водорода может быть зарегистрировано амперометрическим методом с основным платиновым электродом и Ag/AgCl - электродом сравнения. Ток, образующийся в процессе измерения, пропорционален активности глюкозы образца. Из-за влияния различных факторов глюкозооксидазная сенсорная система имеет ряд ограничений:
1. Ответ биосенсора во многом зависит от интенсивности перемешивания образца. При недостаточном перемешивании возможно искажение ответа, поскольку потребление субстрата ферментом ведет к прогрессирующему истощению его количества вблизи мембранной поверхности.
2. Скорость реакции определяется особенностями ферментативной кинетики иммобилизированного фермента. Кажущаяся константа Михаэлиса для глюкозооксидазы на мембране — около 5 ммоль/л, линейный ответ достижим только до уровня 2–3 ммоль/л глюкозы, тогда как диапазон измерения следует расширить до концентрации, по крайней мере, 50 ммоль/л.
3. Свойства иммобилизированного фермента делают систему высокочувствительной к изменениям рН образца, температуры и напряжения кислорода, являющегося субстратом реакции.
4. Адсорбция белка и клеток крови на мембране может привести к быстрой потере ответа сенсора на глюкозу, особенно при использовании образцов цельной крови.
Основная проблема при использовании биосенсоров глюкозы, основанных на амперометрическом определении перекиси водорода, — их чувствительность к ряду соединений, содержащихся в крови: аскорбиновой кислоте, парацетамолу (ацетоминофену — Tyienol™) [23]. В частности, концентрация ацетоминофена 15,1 мг/100 мл (1,0 ммоль/л) приводит к завышению результатов определения глюкозы на 1,4 ммоль/л. Использование специальных ацетатцеллюлозных мембранных систем позволяет уменьшить влияние подобных соединений.
Многие из перечисленных проблем в настоящее время устранены путем использования специальных мембран в биосенсоре. Увеличение линейности было достигнуто снижением проницаемости мембраны для глюкозы. В этом случае фактором, лимитирующим скорость всего процесса, становится проникновение глюкозы через мембрану к ферменту. При поддержании мембранной системы в условиях минимального доступа кислорода соотношение глюкоза/кислород в слое фермента остается достаточно низким, что уменьшает эффекты колебания рО2 [24].
Влияние величины гематокрита
Результаты определения глюкозы при использовании цельной крови зависят от величины гематокрита. В этих случаях гематокритный эффект тесно связан с содержанием воды в образце. При использовании тест-полосок его вклад в конечный результат определяется природой барьера, разделяющего кровь и реагентный слой [25, 26]. Влияние величины гематокрита на результаты определения глюкозы может быть весьма выражено при низких и высоких значениях, что приводит к ошибочным результатам при анемии или полицитемии. Теоретически биосенсоры глюкозы, определяющие глюкозу в цельной крови, должны обеспечивать получение результатов, сопоставимых с результатами, полученными при исследовании плазмы.
Влияние кислорода
Поскольку в глюкозооксидазном методе кислород является участником реакции, колебания напряжения кислорода теоретически должны влиять на результаты исследования. На практике это не представляет существенной проблемы для методов, в которых адекватные количества растворенного кислорода присутствуют в реактивах. В то же время в некоторых системах было обнаружено, что снижение pO2 способствует завышению результатов определения глюкозы в венозной крови [24].
Влияние антикоагулянтов и ингибиторов гликолиза
Концентрация глюкозы в любом образце крови начинает снижаться в результате продолжающихся в эритроцитах и лейкоцитах гликолиза. Для стабилизации уровня глюкозы в исследуемый образец крови добавляют ингибиторы гликолиза: фторид, оксалат или йодацетат натрия. Многие из перечисленных соединений, в частности, фториды, а также ЭДТУК, цитрат/лимонная кислота могут вмешиваться в методы с использованием глюкозного сенсора.
Сравнение результатов использования «прямого» метода и гексокиназного метода
Поскольку референтный гексокиназный метод не используют для определения глюкозы в цельной крови, его результаты трудно сопоставить с результатами, полученными в цельной крови с помощью биосенсоров. Разведение водной фазы образца не учитывается в референтном методе, что приводит к получению более высоких результатов в плазме крови по сравнению с биосенсорами глюкозы приблизительно на 7%. При четком соблюдении правил проведения исследования результаты, полученные при использовании различных методов, по крайней мере, для плазмы, должны соответствовать референтному методу [27].
Определение глюкозы с помощью глюкозодегидрогеназы
Фермент глюкозодегидрогеназа (β-D-глюкоза:НАД оксидоредуктаза, КФ 1.1.1.47) катализирует окисление глюкозы до глюконолактона:
Для ускорения превращения λ-глюкозы в β-форму в реакционную среду добавляют фермент мутаротазу. Количество образовавшегося НАДН2 пропорционально концентрации глюкозы в исследуемом образце.
В данном методе используют глюкозодегидрогеназу, полученную из Dacillus cereus. В 1975 г. был получен относительно чистый препарат глюкозодегидрогеназы, что позволило разработать метод определения глюкозы, основанный на данной высокоспецифичной ферментативной реакции [28].
Скорость реакции контролируют при 340 нм в кинетическом варианте или варианте фиксированного времени инкубации. Этот метод был адаптирован к автоанализаторам [29].
В обзоре Колледжа американских патологов (КАП) за 2001 г. указано, что 52% лабораторий для определения концентрации глюкозы использовали гексокиназную процедуру, из них большинство (93%) определяли поглощение НАДН2, остальные использовали модификации метода с солями тетразолия. Глюкозооксидазный метод с использованием электродов применяли в 21% лабораторий. Менее 1% лабораторий использовали метод на основе глюкозодегидрогеназы [30].
Референтные значения [41]
Несмотря на то, что концентрацию глюкозы в крови определяют с помощью ряда различных аналитических процедур, референтные значения колеблются незначительно. В табл. 1 и 2 представлены значения, которыми следует руководствоваться при использовании современных методов определения глюкозы. Половых различий в содержании глюкозы в крови и сыворотке крови не выявлено.
Таблица 1
Референтные значения содержания глюкозы в плазме/сыворотке крови у пациентов различных возрастных групп
Таблица 2
Референтные значения содержания глюкозы в цельной крови и спинномозговой жидкости
1.3. Методы определения глюкозы в сыворотке крови
В настоящее время существует достаточно много методов определения глюкозы. Их можно классифицировать следующим образом.
1. Редуктометрические. Почти не используются
2. Колориметрические. Почти не используются
3. Ферментативные:
   а) глюкозооксидазный
            - фотометрический по конечной точке
            - фотометрический кинетический
            - отражательная фотометрия – сухая химия
            - электрохимический
   б) гексокиназный.
Первые два метода крайне неудобны, токсичны и обладают низкой точностью, поэтому мы на них не будем останавливаться.
 Глюкозооксидазный метод
Сегодня наибольшее распространение получили методы, основанные на использовании фермента – глюкозооксидазы. В основе метода лежит следующая реакция:
Глюкозооксидаза катализирует перенос двух водородных атомов с первого углеродного атома глюкозы на кислород, растворенный в жидком реагенте. При этом в ходе реакции образуется в эквимолярных количествах перекись водорода. Т.е. концентрация образовавшейся перекиси водорода точно равна определяемой концентрации глюкозы. Следовательно, использование глюкозооксидазной реакции, трансформировало задачу определения концентрации глюкозы в задачу определения концентрации перекиси водорода, которая, как будет показано ниже, значительно проще первой. И здесь есть несколько способов, широко используемых сегодня в лабораторной практике (см. схему).                                         
 
Среди вышеперечисленных способов регистрации наибольшее распространение получил фотометрический биохимический метод, в котором молекулы перекиси водорода под действием фермента пероксидазы расщепляются с образованием активной формы кислорода – супероксид анион-радикала – О2-, который в свою очередь окисляет хромоген, что приводит к значительному изменению спектра поглощения хромогена.
 
 На рис. 2 и 3 показаны спектры рабочего раствора до внесения в него стандартного раствора глюкозы и после. Максимум поглощения реакционной смеси – (реактив + глюкоза) находится в области 500 нм. Соответственно, изменение оптической плотности конечной реакции на длине волны 480-520 нм пропорционально концентрации глюкозы, содержащейся в пробе. 
Рисунок 2. – Спектр рабочего раствора.
Рисунок 3. – Спектр реакционной смеси (рабочий раствор + глюкоза).
 Большая популярность данного метода определения глюкозы объясняется его высокой специфичностью и простотой выполнения. Метод можно реализовать как с применением обычного фотометра (лучше специализированного биохимического фотометра типа Микролаб 540), так и с помощью автоматических биохимических автоанализаторов.