Вход

Изменения окислительно-восстановительного потенциала среды культивирования устойчивой к тяжелым металлам бактерии

Реферат по биологии
Дата создания: 2011
Язык реферата: Русский
Word, docx, 55 кб
Реферат можно скачать бесплатно
Скачать
Данная работа не подходит - план Б:
Создаете заказ
Выбираете исполнителя
Готовый результат
Исполнители предлагают свои условия
Автор работает
Заказать
Не подходит данная работа?
Вы можете заказать написание любой учебной работы на любую тему.
Заказать новую работу

Особое положение тяжелых металлов (ТМ) среди загрязнителей связано как с возможностью их накопления организмами и передачи по пищевым цепям, так и с высокой токсичностью (Reddy, Prasad, 1990). Воздействие ТМ прежде всего сказывается на первичных продуцентах - микроводорослях и цианобактериях, которые наравне с гетеротрофными микроорганизмами могут использоваться для детоксикации и извлечения ценных металлов, поскольку способны аккумулировать их из водной среды и донных отложений в количестве, многократно превышающем потребность в них, как в компонентах минерального питания (Nagase et al., 1994). Наибольшей устойчивостью к ТМ отличаются микроорганизмы, выделенные в местах, содержащих промышленные загрязнения, либо месторождения соответствующего металла (Горленко и др., 1977).

Ванадий, как один из широко распространенных ТМ, используется зелеными, желто-зелеными и бурыми водорослями, содержится в альтернативных нитрогеназах некоторых почвенных бактерий, но не является необходимым элементом для развития большинства прокариотных микроорганизмов, среди которых наиболее активными биоаккумуляторами ванадия являются бактерии рода Pseudomonas , а также ряд цианобактерий (Rehder, 1991). Его токсический эффект обусловлен главным образом тем, что восстанавливаясь в клетках, он стимулирует образование свободнорадикальных состояний О 2 (Popper et al., 1991).

Ионы ТМ образуют меркаптиды с SH-группами тиоловых соединений клеток: реакция обратима, но равновесие ее смещено в сторону слабодиссоциирующих металлтиолатов (Торчинский, 1977). Устойчивость фототрофных и других микроорганизмов к действию ТМ в наибольшей степени обусловлена специфическим связыванием основной части поглощенных клетками ТМ смежными остатками цистеина в молекуле специализированных белков - металлотионеинов (МТ). Общим для этих белков является молекулярная масса до 10 кДа и высокое содержание тиоловых групп. В спектре оптического поглощения МТ в УФ-области около 250 нм, наблюдаются типичные для металлтиолатных комплексов шиpокие полосы, которые исчезают пpи удалении металла (Ang, Wong, 1992). Цианобактерии, культивируемые в присутствии высоких концентраций ванадата синтезируют связывающий ионы металла МТ второго класса (Саванина и др., 1995).

В настоящей работе установлена корреляция между зависимым от ванадата накоплением в среде культивирования бактерий Ps. diminuta низкомолекулярных, богатых SH-группами белков и изменениями окислительно-восстановительного потенциала (E h ) среды.

Материалы и методы

В работе использовали гетеротрофные бактерии, выделенные из придонного осадка ванадийсодержащего промышленного водоема и идентифицированные нами как Ps. diminuta (Саванина и др., 1998). Бактерии культивировали при температуре 25-27° в конических колбах на среде, содержащей в 100 мл водопроводной воды глюкозу и пептон в концентрации по 1 г/л (pH 7,2).

Для определения в культуральной жидкости Ps. diminuta содержания низкомолекулярных белков и SH-групп пробы диализовали 24 час при 0о против 50 мМ Трис-HCl буфера, pH 7,6, включающего 10 мМ ЭДТА с использованием мембраны фирмы Serva (Германия) с диаметром пор, пропускающих молекулы массой <10-15 кД. В присутствии ЭДТА, сульфгидрильные группы МТ и других SH-содержащих соединений освобождаются от большей части связанного ванадия и становятся реакционноспособными.

Плотность клеточных суспензий определяли нефелометрически при 540 нм на спектрофотометре фирмы Hitachi (Япония), модель U-2000. Для определения концентрации ванадия в биологическом материале и культуральной жидкости использовали цветную реакцию ванадия с 4-(2-пиридилазо)-резорцином. Клетки предварительно трижды отмывали от среды культивирования и озоляли азотной кислотой. Оптическую плотность измеряли на том же спектрофотометре при 520 нм используя коэффициент молярной экстинкции 24500 М -1 см -1 . Содержание диализованных низкомолекулярных белков определяли по Лоури (Lowry et al., 1951). Концентрацию тиоловых групп в этих белках и других соединениях определяли с реактивом Элмана (5,5'-дитиобис(2-нитробензойная) кислота) в присутствии ЭДТА (Веревкина и др., 1977) и регистрировали при длине волны 412 нм на том же спектрофотометре используя коэффициент молярной экстикции 11400 М -1 см -1 . Величины pH и E h среды култивирования измеряли на электрометре фирмы Cole-Parmer (США), модель DigipHase, pH определяли с помощью комбинированного стеклянного электрода с двойным Ag/AgCl электродом сравнения фирмы Radiometer (Голландия); для определения E h использовали Pt-электрод, а в качестве электрода сравнения - Ag/AgCl (оба электрода Российского производства); потенциал электрода сравнения относительно нормального водородного электрода, измеренный как в работе (Barsky, Samuilov, 1979), составляет 225±10 мВ. Таким образом, истинная величина E h среды представляет собой сумму измеряемой величины E h и потенциала электрода сравнения.

Результаты и их обсуждение

Клетки Ps. diminuta , изолированные из пробы придонного осадка промышленного водоема, сбросовые воды которого содержат как отходы металлургического производства ванадий в концентрации 100-700 мг/л, хорошо растут как без ванадата, так и в его присутствии; при этом максимальное количество клеток бактерий достигает 2x10 7 кл/мл среды через 12-16 суток культивирования (рис. 1). Ванадат в концентрации 700 мг/л снижает накопление биомассы Ps. diminuta на 30-40%. В дальнейших опытах ванадат добавляли в концентрации 100 мг/л, поскольку не оказывая заметного влияния на рост бактерий, ванадат в этой концентрации значительно стимулировал выделение из клеток низкомолекулярных белков.

Применение метода диализного (смешанно-раздельного) культивирования фототрофных микроорганизмов - цианобактерий или микроводорослей с гетеротрофными бактериями рода Pseudomonas (Гусев и др., 1988) позволило выявить ряд закономерностей роста двух различных культур, разделенных полупроницаемой мембраной. При культивировании фототрофного компонента в присутствии ванадата клетки активно выделяют в среду углеводы и гликолат. Эти соединения используются для роста гетеротрофным компонентом в качестве субстратов окисления. При этом бактерии эффективно поглощают ванадат, существенно снижая его концентрацию в среде (Саванина и др., 1994; Гусев и др., 1997).

Действительно, как показывают наши опыты содержание ванадата в клетках Ps. diminuta , в течение первых 2 суток культивирования быстро увеличивается от 0 до 5-6 мкг/млн клеток, а затем снижается приблизительно в 10 раз (рис. 2, кривая 1). Иная картина наблюдается относительно концентрации ванадата в культуральной жидкости. За первые двое суток культивирования Ps. diminuta содержание ванадата в среде падает от 100 до 10-12 мг/л, а затем начинает постепенно увеличиваться по мере развития культуры; причем в среду возвращается до 60% ванадата (рис. 2, кривая 2). Как видно, накопление ионов ванадия в клетках коррелирует c его содержанием в культуральной жидкости: увеличение концентрации ванадата в клетках сопровождается ее снижением в среде культивирования и наоборот.

Столь значительное увеличение концентрации ванадата в среде по мере выхода кривой роста на стационарный уровень может быть обусловлено тем, что ванадат выделяется из нативных и разрушенных клеток вместе с компонентами связывающими металл. Такими компонентами прежде всего являются низкомолекулярные богатые SH-группами белки; могут быть и другие тиоловые соединения, к которым относятся глутатион, цистеин, тиогликолевая кислота, дитиоэтанол, дитиопропанол и т.д.

Известно, что специфическую устойчивость фототрофных микроорганизмов к действию ТМ обеспечивает наличие в клетках SH-содержащих белков с мол. м. до 10 кДа, связывающих большую часть поглощенных клетками ТМ (Obata et al., 1994). Содержание низкомолекулярных белков и коррелирующее с ним содержание SH-групп в клетках цианобактерий возрастает под действием ванадата (Лебедева и др., 1993). Выделенный из клеток Anacystis nidulans белок был идентифицирован как МТ II класса, связывающий ванадий (Саванина и др., 1995). Известно, что МТ большинства прокариот как правило состоят из одной полипептидной цепи с мол. м. до 7-10 кДа и высоким содержанием цистеина (в среднем до 30%) (Kagi, 1993). Клетки Ps. fluorescens выделяют в среду связывающие ионы Zn полипептиды с мол. м. 1-3,5 кДа. (Appana, Whitmore, 1995). Поскольку клетки Ps. diminuta выделены из ванадийсодержащего промышленного водоема и по данным рис. 1 устойчивы к действию ванадата, представляет интерес определение содержания низкомолекулярных белков и SH-групп в культуральной жидкости Ps. diminuta в динамике развития культуры.

Как видно из рис. 3 в среде культивирования Ps. diminuta наблюдается накопление низкомолекулярных белков, содержание которых к 12 суткам составляет около 50 мкг/мл (кривая 1). В присутствии ванадата количество белка к этому периоду времени возрастает до 450 мкг/мл (кривая 2). Это согласуется с ранее полученными данными о стимуляции синтеза МТ у цианобактерий (Лебедева и др., 1993; Саванина и др., 1995) и в клетках животных организмов (Gachot et al., 1994).

Подобным образом ванадат стимулирует накопление SH-групп низкомолекулярных белков и, возможно, других тиолсодержащих соединений в среде культивирования Ps. diminuta (рис. 3, кривые 3 и 4); зависимости содержания SH-групп в среде от возраста культуры имеют колоколообразный характер с максимумом, приходящимся на 8-9 сутки. Кажущееся несоответствие характеров накопления SH-групп и белка в среде (наличие спада в содержании SH-групп, тогда как по белку такого спада нет), может быть обусловлено окислением SH-групп кислородом, которое должно значительно усиливаться при значениях pH выше 7, как это показано ранее для цистеина (Barsky et al., 1984). Действительно, в соответствии с нашими данными pH культуры Ps. diminuta с возрастом увеличивается от 7 до 8,5; в присутствии ванадата величины pH на 0,3-0,5 единицы выше, чем в контроле.

Колоколообразная зависимость накопления SH-групп в среде от возраста культуры Ps. diminuta сопровождается сходной зависимостью снижения E h среды. По мере развития культуры величина E h уменьшается и достигает минимума (180-200 мВ) к 6-8 суткам, а затем вновь возрастает (рис. 4, кривая 1). В присутствии ванадата минимальное значение E h достигает 80 - 90 мВ (кривая 2). Столь низкие значения E h в аэробных условиях могут быть обусловлены только наличием в среде значительных количеств тиолсодержащих соединений, стандартный редокс-потенциал которых в анаэробных условиях существенно ниже 0 мВ. Так, например, 1,4-дитиотреитол, эффективно восстанавливающий SH-группы ферментов и кофакторов, имеет стандартный потенциал -330 мВ при pH 7; сходными окислительно-восстановительными свойствами обладают тиогликолевая кислота, 2-меркаптоэтанол, димеркаптопропанол и др. (Досон и др., 1991).

В отличие от тиолов такие соединения, как органические кислоты, имеют стандартные редокс-потенциалы в интервале от 50 до 250 мВ. Согласно нашим данным (рис. 5) для достижения величины E h около 200 мВ содержание аскорбата в среде в аэробных условиях должно составлять несколько мМ (кривая 2), а в случае гликолата его концентрация при E h около 300 мВ достигает 200-400 мМ (кривая 3).

На рис. 5 также показана зависимость величины E h буферного раствора от концентрации SH-групп цистеина (кривая 1). Видно, что величинам E h около 200 и 100 мВ соответствуют концентрации SH-групп около 20 и 120 мкМ. Эти значения согласуются с величинами E h (рис. 4) и концентрациями SH-групп (рис. 3) в культуральной жидкости Ps. diminuta .

Таким образом, полученная корреляции между содержанием ванадата в клетках и культуральной жидкости Ps. diminuta , накоплением низкомолекулярных белков и SH-групп и изменениями E h среды культивирования бактерий позволяют полагать, что ионы ванадия, поглощенные клетками Ps. diminuta стимулируют образование тионеинподобных белков, связываются с ними с участием SH-групп и выделяются из клеток вместе с белками, продуктами их деградации или с другими тиоловыми соединениями.

Список литературы

  1. Веревкина И.В., Точилкин А.И., Попова Н.А. 1977. Современные методы в биохимии, М.
  2. Горленко В.М., Дубинина Г.А., Кузнецов С.И. 1977. Экология водных микроорганизмов, М.
  3. Гусев М.В., Вольберг М.М., Лебедева А.Ф., Савельев И.Б. 1988. Использование метода диализного культивирования для подбора симбиотических альгобактериальных пар//Биол. науки, № 1, 103-106.
  4. Гусев М.В., Лебедева А.Ф., Саванина Я.В., Барский Е.Л. 1997. Устойчивость культур цианобактерии Anacystis nidulans и микроводоросли Dunaliella maritima к токсическому действию ванадия: влияние фосфата, железа и цистеина//Вестн. МГУ. Сер. Биология, № 3, 12-17.
  5. Досон Р., Эллиот Д., Эллиот У., Джонс К. 1991. Справочник биохимика, М.
  6. Лебедева А.Ф., Саванина Я.В., Савельев И.Б. 1993. Распрeделение ванадия в клетках цианобактерий Anacystis nidulans и Nostoc muscorum : взаимосвязь с SH-содержащими низкомолекулярными белками//Вестн. МГУ. Сер. Биология, № 4, 58-61.
  7. Саванина Я.В., Лебедева А.Ф., Савельев И.Б. 1994. Смешанно-раздельное культивирование цианобактерий Anacystis nidulans и Nostoc muscorum и бактерий рода Pseudomonas в присутствии ванадия//Вестн. МГУ. Сер. Биология, № 2, 29-34.
  8. Саванина Я.В., Адани А.Г., Лебедева А.Ф., Савельев И.Б., Гусев М.В. 1995. Образование ванадий-тионеина клетками Anacystis nidulans при высоких концентрациях металла//Вестн. МГУ. Сер. Биология, № 1, 38-46.
  9. Саванина Я.В., Пахомкина Б.С., Лебедева А.Ф., Дольникова Г.А. 1998. Смешанно-раздельное культивирование цианобактерий Anacystis nidulans , Anabaena variabilis и Nostoc muscorum с бактериями, выделенными из ванадийсодержащего промышленного водоема. Тез. докл. на V Международной конференции "Новые информационные технологии в медицине и экологии" Гурзуф.
  10. Торчинский Ю.М. 1977. Сера в белках, М.
© Рефератбанк, 2002 - 2017