Содержание
Введение
I. Теоретическая часть
1. Биологические особенности и характеристика бактерий различных родов аэробных азотфиксирующих бактерий
2. Роль свободноживущих азотфиксаторов в обогащении почвы азотом
3. Оптимальные факторы среды для развития аэробных азотфиксирующих бактерий
4. Влияние корневых выделений растений, органических удобрений, соломы, на активность фиксации азота азотобактером и размеры азотонакопления в почве
II. Практическая часть
1. Объект и методы исследования
1.1. Характеристика взятого образца почвы
1.2. Методы биологического исследования почвы
1.2.1.Отбор средней почвенной пробы для микробиологического анализа и требования к ней
1.2.2. Определение влажности почвы
1.2.3.Учет численности микроорганизмов почвы
1.2.4.Приготовление почвенной суспензии и посев на питательные среды
2.Результаты опыта. Учет численности микроорганизмов различных групп
Заключение
Список используемой литературы
Введение
Среди процессов, от которых зависит биологическая продуктивность является фиксация микроорганизмами азота. Проблема биологической азотфиксации относится к числу основных проблем сельскохозяйственной и биологической науки. Перед учеными стоит задача изыскать возможности управления процессом азотфиксации и на этой основе увеличить урожайность сельскохозяйственных культур.
Азот является абсолютно необходимым элементом для всех живых организмов. Основным резервуаром азота служит земная атмосфера. Эукариотические организмы не способны усваивать азот непосредственно из атмосферы. Такой способностью обладает ограниченное количество ви-дов прокариот, которых называют азотфиксаторами, а процесс связывания азота атмосферы (восстановление до ) этими организмами - биологической азотфиксацией.
Биологическая азотфиксация представляет собой глобальный процесс, обеспечивающий существование жизни на Земле. Общая мировая биологическая фиксация азота составляет 17,2• т/год, что в четыре раза превышает связывание N2 в форме NH3 на предприятиях химической промышленности.
Впервые выделить культуру свободноживущих азотфиксирующих микроорганизмов удалось в 1893 году С.Н. Виноградскому. Он выделил почвенный спороносный анаэробный микроорганизм, относящийся к роду Clostridium , названный автором в честь выдающегося французского микробиолога Л. Пастера Clostridium pasteurianum. В 1901 году М. Бейеринк выделил аэробно живущий почвенный микроорганизм Azotobacter, способный к азотфиксации, неприхотливый при выращивании. Этот микроорганизм интенсивно исследуют не только как удобную модельную культуру, но и применяют в технологии обогащения сельскохозяйственных посевов биологическим азотом. С тех пор коллекции свободноживущих азотфиксаторов постоянно увеличиваются, особенно с 1949 года, когда в арсенал методов регистрации фиксации азота вошли метод изотопных индикаторов ( ) и реакция восстановления ацетилена в этилен, катализируемая основным ферментом системы азотфиксации - нитрогеназой. Тогда выяснилось, что способностью к фиксации азота обладают большинство аноксигенных фототрофных бактерий, многие цианобактерии, некоторые бациллы, клебсиеллы и др. [7]
Теоретическая часть
1. Биологические особенности и характеристика бактерий различных родов аэробных азотфиксирующих бактерий
К свободноживущим азотофиксирующим микроорганизмам относятся представители сем. Azotobacteriaceae,а именно:
Род Azotobacter впервые был выделен голландским ученым Мартином Бейериком в 1901 году из огородной почвы. Азотобактер требователен к субстрату и особенно реагирует на дефицит фосфора. На бедных почвах он не развивается. В связи с этим его используют в качестве индикатора на содержание в почве фосфора и калия. Азотобактер плохо развивается в кислой среде, растет при рН 5,5 - 7,8 и более влаголюбив, чем другие микроорганизмы почвы. Азотобактер широко распространен в почвах разных географических широт. В целинных почвах азотобактер встречается редко, и по мере их окультуривания, создания необходимых условий численность его возрастает. Положительное действие азотобактера на растения объясняется тем, что он выделяет в окружающую среду витамины и другие биологически активные вещества: никотиновую и пантотеновую кислоты, гиббереллин, гетероауксин.
Молодые клетки азотобактера представляют собой палочки размером 2-3×4-6 мкм. Позже они превращаются в крупные кокки диаметром 4 мкм. Кокковидные клетки обычно покрыты капсулой и содержат различные включения (жир, крахмал, поли-β-гидроксимасляную кислоту и т.д.).
У кокковидных клеток некоторых видов азотобактера появляется толстая оболочка и они превращаются в цисту. На одних питательных средах палочки быстро приобретают кокковидную форму, на других – лишь по истечению длительного времени. Палочковидные клетки азотобактера имеют жгутики и обладают подвижностью. При переходе палочек в кокки жгутики обычно теряются. [3]
Все виды азотобактера аэробны. Источник азота для них - соли аммония, нитриты, нитраты и аминокислоты. При отсутствии связанных форм азота азотобактер фиксирует молекулярный азот. Небольшие дозы азотсодержащих соединений не приводят к депрессии фиксации азота, а иногда даже стимулируют её. Увеличение дозы связанного азота в среде полностью подавляет усвоение молекулярного азота. Энергия усвоения азота у отдельных культур азотобактера колеблется в широком диапазоне. Активные культуры связывают 15...20 мг азота на 1 г. потребленного органического вещества.
Азотобактер способен использовать большой набор органических соединений - моно- и дисахариды, некоторые полисахариды(декстрин, крахмал), многие спирты, органические кислоты, в том числе ароматические. Вообще азотобактер проявляет высокую потребность в органических веществах, поэтому в больших количествах встречается в хорошо удобренных почвах.
Из описанных видов азотобактера наиболее изучены A. chroococcum, A. beigerinckii, A. vinelandii и A. paspali. Перечисленные виды различаются по размерам и форме клетки, а так же по некоторым другим признакам, в частности пигментации колоний. Так, колонии A. chroococcum имеют бурый, почти черный цвет, A. vinelandii выделяют желтый пигмент зеленой флуоресценции, A. paspali так же продуцируют желтый пигмент. В почве чаще всего встречается A. chroococcum.
Род Beijerinckia был выделен из кислых почв рисовых полей в Индии (в 1939 г.). Г. Деркс (1950), обнаружив эту бактерию в почве Ботанического сада в Богоре (Ява), предложил назвать ее именем М. Бейеринка — одного из первых исследователей фиксаторов азота.
Клетки бактерий рода Beijerinckia имеют круглую, овальную или палочковидную формы; палочки иногда искривлены. Размеры молодых клеток 0,5-2,0 х 1,0-4,5 мкм. Встречаются подвижные и неподвижные формы. Цист и спор не образуют. Культуры характеризуются медленным ростом. Типичные колонии формируются обычно через 3 недели при 30°С. Большинство культур Beijerinckia образует на безазотном агаре с глюкозой выпуклые, нередко складчатые, блестящие слизистые колонии очень вязкой консистенции. При старении культуры, как правило, образуют темноокрашенный пигмент.[3]
На 1г использованного энергетического материала организмы рода Beijerinckia фиксируют 16-20 мг молекулярного азота. Спектр углеродсодержащих соединений, доступных бейеринкии, значительно уже, чем у азотобактера. Хорошо используются моно- и дисахариды, хуже — крахмал, органические кислоты, ароматические вещества не усваиваются. Минеральный азот и многие аминокислоты бактерии рода Beijerinckia предпочитают молекулярному азоту.
Основные отличия бейеринкии от азотобактера — высокая кислотоустойчивость (могут расти даже при рН 3,0), кальцефобность (ничтожные дозы кальция подавляют рост), устойчивость к высоким концентрациям железа, алюминия.
Бактерии рода Beijerinckia широко распространены в почвах южной и тропической зоны, реже встречаются в зоне умеренного климата. Beijerinckia часто встречается на поверхности листьев тропических растений в Индонезии.
Раньше полагали, что бактерии рода Beijerinckia могут существовать только в кислых почвах. Сейчас установлено, что они неплохо развиваются и в нейтральных и щелочных почвах. Тем не менее следует полагать, что Beijerinckia играют значительную роль в азотном балансе главным образом кислых почв (латеритах, красноземах), не имея существенного агрономического значения для нейтральных почв.
К свободноживущим фиксаторам молекулярного азота семейства Azotobakteriaceae относятся также виды рода Derxia, выделенные из почв Индии с рН 6,5. Это медленно растущие на безазотистых средах палочковидные бактерии со слизистыми капсулами, обладающие на определенной стадии развития жгутиками. Колонии могут быть пленочными или слизистыми, при старении преобретают желтовато-коричневый цвет. Derxia используют различные источники углерода - моно-, ди-, полисахариды, спирты, органические кислоты, в среде без азота фиксируют 12 - 15 мг N2 на 1 г использованного сахара. Представитель данного рода - Derxia gummosa - развивается в почвах с рН 4,5 - 6,5, однако лучше растет при рН 5,1 - 5,5. Виды данного рода распространены в почвах тропической зоны - Индии, Индонезии, тропической Африки, Южной Америки. [2]
2. Роль свободноживущих азотфиксаторов в обогащении почвы азотом
По предложению С. П. Костычева и его сотрудников с 30-х годов XX века в СССР начали применять землеудобрительный препарат, содержащий культуру Az. chroococcum. Он рассматривался как аналог азотных удобрений. Позднее, когда выяснилась способность азотобактера продуцировать биологически активные вещества, его действие на растения начали связывать не только с процессом азотфиксации и улучшением азотного питания растений, но и с поступлением в растения вырабатываемых им биологически активных соединений (витаминов и стимуляторов роста). С азотобактерином в СССР была проведена очень большая работа, которая позволяет в настоящее время дать вполне определенный отзыв о целесообразности его использования в практике сельского хозяйства.[1]
Создается вполне определенное впечатление, что для полевых культур азотобактерин малоэффективен. Опыты, поставленные в 1958-1960 гг., показали, что лишь в 34% случаев применение препарата давало прибавку урожая, но она была невысока и граничила с возможной ошибкой полевого эксперимента.
На унавоженных почвах положительное действие азотобактерина возрастает. Вполне благоприятно влияет этот препарат на овощные культуры, которые, как правило, выращиваются на сильно удобренных навозом почвах. В таких случаях бактеризация высеваемых семян может увеличить урожай на 20-30% и, что особенно важно, ускорить его созревание. [4]
Азотобактер, безусловно, не может действовать как аналог азотных удобрений. Его благоприятный эффект на растения связан с продукцией биологически активных веществ и особенно фунгистатических соединений. Азотобактерин, очевидно, может с успехом применяться на богатых почвах как ростовой препарат.
Вклад свободноживущих азотфиксаторов в азотный фонд почвы весьма существенен. До последнего времени считали, что деятельность этих микроорганизмов не имеет особого значения в азотном питании растений. Однако длительные опыты опровергли эту точку зрения. Так, показано, что без применения азотных удобрений и без посева бобовых можно получить урожаи зерновых культур, для создания которых требуется внесение до 50 кг азота на 1 га. При этом к возможным источникам пополнения азота относятся деятельность свободноживущих азотфиксаторов и отчасти поступление этого элемента из атмосферы с дождевыми водами.
По материалам многолетнего опыта МСХА, на делянках бессменной ржи ежегодное азотонакопление при известковании почвы составило 28 кг/га, а на неизвесткованном фоне, где условия для азотфиксаторов были хуже – в 2,5 аза меньше.
По данным академика ВАСХНИЛ И. С. Шатилова, в неудобряемых дерново-подзолистых почвах в год связывается 19 кг азота, а в удобряемых – 32-37 кг/га. Данные С. М. Гуревича свидетельствуют о том, что на типичных черноземах без выращивания бобовых культур в год связывается до 56 кг азота на 1 га.
Микроорганизмы-азотфиксаторы, находящиеся на поверхности растений и использующие органические выделения растительных тканей, фиксируют в год 2-10 кг азота на 1 га.[6]
3. Оптимальные факторы среды для развития аэробных азотфиксирующих бактерий
Аэробные азотфиксирующие бактерии живут в непрерывном взаимодействии с внешней средой, в которой они находятся, поэтому подвергаются разнообразным влияниям. На активность и формирование сообществ азотфиксаторов влияет ряд природных и антропогенных факторов, таких как температура почвы, ее влажность, воздушный режим почвы, кислотность, механические свойства.
Температура почвы
Температура почвы определяется географическим фактором и сезоном года. В одной и той же зоне температурный режим зависит от ее способности поглощать тепловые лучи, теплоизлучения, от характера растительности и т.д.
По отношению к температуре микроорганизмы сем. Azotobacteriaceae являются мезофиллами, т.е. температурный оптимум для них составляет 30-45 оС, минимум – 10-15 оС.
Влажность
Установлено, что процессы аммонификации и нитрификации лучше всего протекают при влажности почвы, равной 60%ПВ. Оптимум фиксации азота несколько сдвинут в сторону более высокой влажности. При относительной влажности окружающей среды ниже 30% жизнедеятельность большинства азотофиксаторов прекращается.
Аэрация почвы
Азотофиксирующие микроорганизмы хорошо переносят повышенное содержание в воздухе CO2. Нередко при этом отмечается даже улучшение их роста, тем не менее при 1-1,5% и более активность некоторых групп азотофиксаторов подавляется.
Для роста бактерии нуждаются в элементах минерального питания, особенно в фосфоре и кальции. Потребность азотобактера в данных элементах столь высока, что его используют как биологический индикатор на наличие фосфора и кальция в почве. Для энергичной азотфиксации микроорганизмам требуются микроэлементы, из которых наиболее важен молибден, который входит в состав ферментов, катализирующих процесс усвоения азота. Отмеченные физиологические особенности характеризуют экологию данного организма. Азотобактер обитает в высокоплодородных, достаточно влажных почвах с нейтральной или близкой к ней реакции среды. При недостаточной влажности большинство клеток отмирает. В черноземных, каштановых и сероземных почвах, благоприятных для рассматриваемого организма, его обнаруживают в значительных количествах только весной. При летнем иссушении почвы остаются единичные клетки. В зоне подзолистых и дерново-подзолистых почв азотобактер можно найти в огородных и пойменных почвах, богатых органическими соединениями, с оптимальным рН 6,8...7,2. [3]
4. Влияние корневых выделений растений, органических удобрений, соломы, продуктов разложения клетчатки на активность фиксации азота азотобактером и размеры азотонакопления в почве
Способность Azotobacter chroococcum размножаться при соответствующих условиях в ризосфере сельскохозяйственных культур дала основание предполагать, что указанный микроорганизм может улучшить азотное питание растений. По предложению академика С.П.Костычева и его сотрудников с тридцатых годов текущего столетия в нашей стране начали применять землеудобрительный препарат, содержащий культуру Azotobacter chroococcum, или азотобактерин.
Позднее, когда выяснилась способность микроорганизма продуцировать биологически активные вещества, его действие на растения стали связывать не только с фиксацией азота и улучшением азотного питания, но и с поступлением в растения вырабатываемых микроорганизмом биологически активных соединений (витаминов и стимуляторов роста).
Весьма важное свойство азотобактера заключается в том, что он вырабатывает фунгистатическое вещество, представляющее собой метиловый эфир алифатической тетраеновой кислоты, содержащей гидроксильную и B-метильную группы. Обнаруженный антибиотик, по данным Н.И. Придачиной, активен против значительного числа фитопатогенных грибов. Благодаря описываемому свойству при бактеризации азотобактером в ризосфере угнетается развитие микроскопических грибов, многие из которых задерживают рост растений.
Работа с различными штаммами Azotobacter chroococcum подтвердила хорошее действие на растения лишь культур, вырабатывающих биологически активные вещества, поэтому при селекции для производственных целей отбирают культуры азотобактера, продуцирующие биологически активные соединения, стимулирующие рост растений, и угнетающие развитие фитопатогенных грибов. Так, культура азотобактера снимает угнетающее действие фитотоксичного гриба Alternaria на кукурузу, а рост незараженного растения стимулирует. Однако, для полевых культур азотобактерин мало эффективен. Это связано с его способностью развиваться лишь в хорошо окультуренных почвах. На унавоженных почвах положительное действие азотобактерина возрастает. Препарат хорошо влияет, например, на овощные культуры, которые обычно выращивают на сильно удобренных навозом почвах. Здесь бактеризация семян может повысить урожай на 20...30% и, что особенно важно, ускорить его созревание. Для объяснения эффективности азотобактера прежде всего следует выяснить, может ли этот микроорганизм, используя корневые выделения, накопить достаточно азота для развития растения. Опыты с монобактериальными культурами, в которых высшее растение, выращенное из стерильных семян, инокулировали культурой азотобактера, дают на этот вопрос отрицательный ответ. За счет корневых выделений бактерия не может усвоить такое количество азота, которое обеспечивало бы высокий урожай растений. Вместе с тем, при определенных условиях азотобактер улучшает рост растений. В этом можно убедиться, если в условиях монобактериальной культуры обработать им семена растений. Объясняется это тем, что азотобактер синтезирует много биологически активных соединений- никотиновую и пантотеновую кислоты, пиридоксин, биотин, гетероауксин, гиббереллин, и, возможно, ряд других соединений. Комплекс указанных веществ способен стимулировать прорастание семян, ускорять развитие растений в благоприятных условиях среды. Положительное действие азотобактера легко понять, учитывая физиологические особенности данной бактерии. Она активно размножается лишь в плодородных почвах, обеспеченных органическим веществом, фосфором и влагой. Дефицит увлажнения азотобактер переносит хуже, чем другие бактерии Известно, что в плодородных почвах присутствует спонтанная культура Azotobacter. Как же в таком случае объяснить положительный эффект дополнительного заражения? Вероятно, это связано с небольшой численностью клеток азотобактера даже в плодородной почве. При бактеризации количество бактерий сильно возрастает, особенно в ризосфере, что и создает благоприятные условия для развития корневой системы. Проявляется как стимулирующее влияние ростовых веществ, так и подавление вредной грибной флоры, а также некоторые накопления в почве доступного растениям азота.
Препарат азотобактерин используют в основном для оранжерейной и парниковой культуры растений, или в случае овощных культур. Обычно его готовят, размножая микроорганизм в стерильной почве или низовом торфе, имеющих нейтральную реакцию и высокое содержание гумуса. К почве добавляют источник углерода, доступный азотобактеру, например, солому. В последнее время солому часто используют как органическое удобрение. Внесение соломы обогащает почву гумусом. Кроме того, в ней содержится около 0,5% азота и другие необходимые растениям вещества. При правильном внесении соломы почва обогащается органическим веществом и в ней активизируются мобилизационные процессы включая деятельность азотофиксирующих микроорганизмов. В зависимости от ряда условий внесение 1 т соломы приводит к фиксации 5...12 кг молекулярного азота. [5]
Практическая часть
1. Объект и методы исследования
1.1. Характеристика взятого образца почвы.
Для проведения микробиологического анализа был взял тепличный грунт, представляющий собой отработанный почвенный субстрат из теплиц и парников, рыхлый, легкий, темно-бурый или черный, как правило, крайне беден азотом и минеральными элементами. Может содержать пестициды и семена культурных растений. Характеризуется высокой пористостью (65-75%), наименьшей влагоемкостью 45-50%, воздухоемкостью 20-25%, плотностью - 0,4-0,6 г/см2. Используется для выращивания овощных культур, таких как огурцы, томаты и др. Получил широкое распространение в садоводстве.
1.2. Методы биологического исследования почвы.
1.2.1.Отбор средней почвенной пробы для микробиологического анализа и требования к ней.
1. Образец должен быть «средней почвенной пробой»: среднюю пробу получают путем смешивания отдельных образцов почвы (со 100 м2 берут пробу из 3-х точек).
2. Образец должен отображать характеристику исследуемой почвы: если анализируют пахотную почву, то пробы следует брать с глубины всего пахотного слоя, снимая верхние 2 см почвы; если анализируют определенный горизонт или почву по профилю – пробу берут из определенного горизонта; если анализируют весь горизонт – пробу берут начиная с нижнего горизонта.
3. Образец должен быть взят с соблюдением правил асептики (пробу берут стерильной лопаткой).
4. Образец должен иметь четкую характеристику, откуда он взят.
5. Образец должен быть свежим (анализируют в первые сутки после взятия).
6. Образец почвы должен быть однородным (тщательно перемешанным).
1.2.2. Определение влажности почвы.
Необходимо определить влажность почвы, так как полученные данные анализа при оценке результатов должны быть пересчитаны на 1г воздушно – сухой почвы. Для этого сначала взвешиваем пустой бюкс, затем помещаем в него 10-20г почвы и взвешиваем. После сушки в сушильном шкафу при 105º и достижения постоянной массы бюкс с навеской почвы снова взвешивают и определяют содержание воздушно – сухой почвы в 1г сырой.
1.2.3.Учет численности микроорганизмов почвы.
Для учета численности микроорганизмов в почве применяют широко распространенный метод питательных пластин (метод Коха). Он позволяет учесть количество живых клеток в почве и выявить родовой и видовой состав, выделить чистые культуры бактерий. Но потребность в питательных веществах у различных микроорганизмов неодинакова, поэтому суспензию почвы высевают на разные среды (плотные и жидкие), предназначенные для различных физиологических групп микроорганизмов.
При посеве почвенной суспензии на жидкие питательные среды методом предельного разведения, численность микроорганизмов бывает несколько занижена.
1.2.4.Приготовление почвенной суспензии и посев на питательные среды.
Для проведения общего микробиологического анализа почвы, необходимо сделать посев микроорганизмов на плотные среды (МПА, КАА)
мясо – пептонный агар (МПА) – учитывают количество сапрофитных микроорганизмов, использующие в качестве источника углерода органические соединения.
крахмало – аммиачный агар (КАА) – выявляют микроорганизмы, способные использовать минеральные формы азота.
Также используют метод обрастания комочков для выявления численности определенных групп микроорганизмов:
— для выявления аэробных целлюлозоразлагающих микроорганизмов раскладывание комочков производится на среде Гетчинсона.
— для выявления аэробных азотофиксаторов (в т.ч. Azotobacter) – на среде Эшби.
Приготовление почвенной суспензии: 10г почвы помещают в колбу емкостью 250 мл с 90 мл стерильной водопроводной воды, интенсивно взбалтывают вращательным движением (не смачивая пробки) 10 мин. Затем методом разведения готовят суспензии, содержащие разное количество почвы: из предыдущего разведения стерильной пипеткой переносят 1 мл суспензии в пробирку, содержащую 9 мл воды. В первой пробирке 1 мл суспензии, приготовленной по этому методу, соответствует разведению 10-1.
Из полученных разведений делают посев на жидкие и плотные питательные среды.
Если численность отдельных групп микроорганизмов в почве небольшая, их выявляют методом обрастания комочков почвы.