Оценка иммунологической эффективности аллогенной противоопухолевой вакцины на основе клеток меланомы, модифицированных геном tag7

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ И СОЦИАЛЬНОГО РАЗВИТИЯ

РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

ГОСУДАРСТВЕННОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ

Волгоградский государственный медицинский университет

Медико-биологический факультет

Кафедра молекулярной биологии и генетики

Дипломная работа Пузановой Ольги Порфирьевны

"Оценка иммунологической эффективности аллогенной противоопухолевой вакцины на основе клеток меланомы, модифицированных геном tag7"

Специальность-040800"Медицинская биохимия"

Работа выполнена в лаборатории экспериментальной диагностики и биотерапии опухолей НИИ Экспериментальной диагностики и терапии опухолей ГУ РОНЦ им. НН Блохина РАМН

Заведующий лабораторией

Директор НИИ ЭДиТО ГУ РОНЦ им.Н.Н.Блохина РАМН

Заместитель директора ГУ РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН по научной работе профессор, д.м.н. Барышников Анатолий Юрьевич

Научный руководитель

старший научный сотрудник, к.б.н. Лукашина Марина Игоревна

Дипломник Пузанова Ольга Порфирьевна

Волгоград,2007

Оглавление

Список использованных сокращений..................................................................4

ВВЕДЕНИЕ............................................................................................................6

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Введение......................................................................................................10

1. Общие принципы функционирования иммунной системы. ........................11

1.1.Органы лимфоидной системы в иммунном ответе...........................12

1.2. Механизмы активации иммунной системы......................................15

1.3. Гуморальный ответ in vivo.................................................................18

1.3.1. Фазы гуморального ответа

1.3.2. Типы активации В-лимфоцитов.

1.3.3. Иммунологическая память Вторичный иммунный ответ.

2. Гуморальный ответ при онкогенезе...............................................................23

2.1. Спонтанный гуморальный ответ к опухолевым антигенам. Корреляция с экспрессией ОАА. Экспериментальные данные.......................24

2.2. Спонтанный гуморальный ответ к ОАА: механизм реализации иммунорегуляторных функций. .........................................................................26

3. Гуморальный иммунный ответ, индуцированный противоопухолевой иммунотерапией........................................................................................................

3.1. Корреляция гуморального и клеточного иммунного ответа при проведении противоопухолевой вакцинотерапии.............................................27

3.2.Возможные механизмы противоопухолевой защиты при участии гуморальных факторов.........................................................................................31

4. Экспериментальные модели изучения гуморального ответа к ОАА меланомы. Мониторинг гуморального иммунного ответа у опухолевых больных..................................................................................................................35

Заключение ...................................................................................................39

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

1.Описание использованных материалов (реактивы, буферные растворы и питательные среды, характеристика клеточных линий, описание оборудования)........................................................................................................40

2. Методы исследования...........................................................................................

2.1. Протокол иммунизации.......................................................................42

2.2.Культуральная работа...........................................................................43

2.2. Прямая реакция иммунофлюоресценции ПРИФ..................................

2.3. Непрямая реакция иммунофлюоресценции НРИФ..........................44

3. Схемы экспериментов.......................................................................................45

4. Статистическая обработка данных..................................................................46

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

3.1. Динамика иммунного ответа........................................................................47

3.2 Характер изменения показателей......................................................................

3.2.1. Сравнение средних общего массива данных.......................50

3.2.2. Сравнение средних связывания IgM, IgG антител для каждого из обследуемых больных.................................................................................51

3.3 Индивидуальная оценка полученных результатов для каждого из обследуемых больных...........................................................................................57

Глава 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ И ВЫВОДЫ...................................62

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.....................................................................................................63

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ.....................................................................................64

ПРИЛОЖЕНИЯ.....................................................................................................72

1.Описание использованных материалов

2.Результаты и их обсуждение

2.1. Статистический анализ данных

2.2. Индивидуальная оценка полученных результатов для каждого из обследуемых больных

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ

Ab- antibody- антитело;

ADCC- antibody-dependent cellular cytotoxicity- антителами опосредованные цитотоксические клеточные реакции

ADCL- antibody-mediated complement-dependent cell lyzis- антителами опосредованный комплемент- зависимый клеточный лизис

Ag- antigen- АГ- антиген;

AIDS- acquired immune deficiency syndrome-СПИД;

AJCC- American Joint Committee on Cancer- соединенный американский комитет по проблемам рака

APC- antigen presenting cell- АПК- антигенпрезентирующая клетка;

CAMP- cyclic AMP-циклическая АМФ;

CD- clasters designations- кластеры обозначения моноклональных антител;

CEA- carcinoembryonic antigen- РЭА- рак-эмбриональный антиген

CRC- colorectal cancer- колоректальный рак

CT- cancer-testis antigen – антиген рака яичек,

CTL- cytotoxic T-lymphocyte- ЦТЛ- цитотоксический Т-лимфоцит;

DC- dendritic cell- ДК дендритные клетки

DNA- deoxyribonucleic acid- дезоксирибонуклеиновая кислота;

D-region-diversity region of Ig or T-cell recipe for Ag- рецептор Т-клетки для антигена;

DTH - delayed type hypersensitivity – ГЗТ- гиперчувствительность замедленного типа

EGF-R- Epidermal Growth Factor Receptor- рецептор эпидермального фактора роста;

ELISA- enzyme-linked immunosorbent assay- ИФА-иммуноферментный анализ;

F (ab)²- antigen binding fragment;

FAСS- fluorescence-activated cell sorter- проточный цитометр;

FCS- fetal calf serum- ТЭС- телячья эмбриональная сыворотка;

FITC- florescein isothiocyanate- ФИТЦ- флюоресцин изотиоцианат;

GM-CSF granulocyte-macrophage colony-stimulating factor-ГМ-КСФ гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор

НSP- heat shock protein- БТШ белки теплового шока

HbsAg - поверхностный антиген вируса гепатита В;

HLA- human leukocyte antigen-человеческие лейкоцитарные антигены;

IFN- interferon -интерферон ИФН 

Il- interleukin- ИЛ- интерлейкин;

Il-2R- receptor for Il-2- рецептор ИЛ-2;

MAA- melanoma associated antigens- МАА-меланома ассоциированные антигены.

mAb- monoclonal Ab antibodies- моноклональные антитела;

MHC- major histocompatibility complex- ГКГ-главный комплекс гистосовместимости;

MLS- mixed lymphocyte culture- СКЛ- смешенная культура лимфоцитов;

MLTR mixed lymphocyte-tumor cell reaction-MTLC mixed tumor- lymphocyte culture- CОЛК- смешанная опухоль-лимфоцитарная культура

PFC- plaque forming cells- антитело образующая клетка;

RT-PCR reverse transcriptase polymerase chain reaction;

TAA -tumor associated antigens- ОАА-опухоль ассоциированные антигены;

TGF-transformed grown factor - ТФР трансформирующий фактор роста;

TNF  - tumor necrosis factor - ФНО фактор некроза опухоли.

ВВЕДЕНИЕ

Активная специфическая иммунотерапия рака является наиболее современным и высоко эффективным способом воздействия на опухоль.

Имеются убедительные экспериментальные доказательства перспектив и целесообразности развития активной специфической иммунотерапии:

• возможность предупреждения приживления сингенной опухоли после предварительной иммунизации против нее;

• способность к лизису Т-лимфоцитами in vitro аутологичных опухолевых клеток;

• продукция Т-лимфоцитами цитокинов в ответ на стимуляцию аутологичными опухолевыми клетками;

• получение in vitro популяции Т-лимфоцитов с противоопухолевой активностью, которая может быть реализована после введения их в организм;

• наличие опухолевых антигенов, которые могут быть распознаны цитотоксическими Т-лимфоцитами.

Основные усилия исследователей в области активной специфической иммунотерапии направлены на повышение иммуногенности опухолевых леток (с помощью генной терапии), преодоление местной или системной иммунодепрессии (ИЛ2, адъюванты специфической иммунотерапии) и восстановление механизма презентации антигенов (с помощью предшественников дендритных клеток ДК).

Поэтому противоопухолевая вакцинотерапия на современном этапе исследований считается весьма перспективным методом, сочетающим высокую эффективность и относительно невысокий риск ухудшения состояния пациентов. По определению N.P.Restifo и M. Sznol (1997), “вакцинотерапия это метод, основанный на использовании любого антигена или комплекса антигенов (совместно или без адъювантов) для модуляции иммунного ответа”. В отличие от вакцинаций при инфекционных заболеваниях, вакцинотерапия при раке имеет принципиально иную задачу, так как индуцирует активный иммунный ответ против антигенов из собственных тканей и применяется для стимуляции иммунного ответа пациента на “собственную” опухоль.

Клеточная вакцинация (аутогенная трансплантация дендритных и опухолевых клеток), являющаяся одним из способов активной специфической иммунотерапии рака, в своем механизме действия предполагает влияние на клеточный и гуморальный иммунный ответ.

Предполагая скорое широкое распространение клеточной вакцинации в клинической практике, в настоящее время разработка критериев оценки иммунологической эффективности алловакцин является необходимым условием проведения специфической иммунотерапии рака [M Y. Mapara, M Sykes 2004]. В то же время одной из неразрешенных до настоящего времени проблем является невозможность автоматического переноса в онкологическую клинику данных первичного иммунологического скрининга (количество клеток того или иного фенотипа, уровень иммуноглобулинов разных изотипов, комплемента, показателей фагоцитоза и другие) без проведенных дополнительных исследований [Н.М. Бережная, 2004]. Для решения данной проблемы необходимо применение таких методов исследований, которые отражают изменения в системе иммунитета при злокачественном росте, а также функциональное состояние клеток, формирующих противоопухолевую защиту.

Оценка эффективности гуморального иммунного ответа (ГИО), помимо Т-клеточного ответа, является необходимым требованием при проведении данных экспериментальных исследований, и включает множество этапов: определение концентрации в сыворотке иммунизированных больных отдельных классов иммуноглобулинов с помощью серологических реакций [J.-w. Cui, W.-h. Li, J. Wang, 2005; U.Sahin, O.Tureci, M.Pfreundschuh, 1997], идентификация специфических к конкретным опухолевым антигенам антител, проводимая параллельно с определением экспрессии данных антигенов на опухолевых клетках у обследуемых пациентов и у здоровых лиц [E. Stockert, E. J?ger, 1998; Y.Nagata, S Gnjatic, 2000].

Выбранная экспериментальная модель представляет собой оценку иммунологической эффективности алловакцинации, посредством оценки связывания иммуноглобулинов сыворотки пациентов, вырабатываемых на фоне проводимой иммунизации с антигенами представленными на опухолевых клетках различных линий.

Применение данного подхода для оценки результатов вакцинотерапии рака при сопоставлении результатов с данными иммунофенотипирования пациентов позволит охарактеризовать динамику развития иммунологических эффектов гуморального звена иммунитета во взаимосвязи с Т-клеточным ответом, способствует пониманию некоторых предполагаемых механизмов влияния особенностей антигенного репертуара аллогенных клеток на сигнальную передачу в ходе иммунного ответа.

Для реализации поставленных практических задач в лаборатории НИИ Экспериментальной диагностики и биотерапии опухолей ГУ РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН создан банк более пятидесяти различных линий опухолевых клеток, свойства которых изучены и описаны сотрудниками НИИ ЭДиТО ГУ РОНЦ, проводятся исследования с использованием гибридов опухолевых и дендритных клеток. Регулярный план работы лаборатории включает иммунофенотипирование пациентов в ходе иммунотерапии, оценка степени зрелости аутологичных дендритных клеток, с использованием прямой и непрямой РИФ, проточной цитофлюориметрии, культивирование опухолевых клеток различных линий, выделение дендритных клеток из периферической крови и их дальнейшее культивирование, получение лизата из аутологичных опухолевых клеток для праймирования дендритов. Возможно использование охарактеризованных линий опухолевых клеток для оценки гуморального звена иммунитета при алловакцинации.

Цели и задачи.

Цель работы: изучение гуморального иммунного ответа больных диссеминированной меланомой при иммунизации аллогенной клеточной вакциной на основе клеток меланомы линии melP, модифицированных геном tag7.

Задачи:

1. Титрование goat-anti human IgG FITC, goat-anti human IgM RPE антител на МПК больного хроническим лимфолейкозом методом прямой РИФ

2. Оценка связывания IgM, IgG антител сыворотки иммунизированных клеточной вакциной пациентов до введения вакцины, после 4, 9, 14 и 25 введений вакцины методом непрямой РИФ на опухолевых клетках линий melKor, melIbr, melP.

3. Культивирование опухолевых клеточных линий меланомы (melKor, melIbr, melP) с целью получения достаточного количества клеток для использования их в дальнейших исследованиях.

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

ВВЕДЕНИЕ

Изучение гуморального ответа к опухоль ассоциированным антигенам ОАА привлекло внимание ученых еще в 1970 году, когда при использовании поликлональной сыворотки от онкологических больных было идентифицировано более 30 иммуногенных опухолевых пептида. Многочисленные антигены на клеточной поверхности, включая муцин, онкопротеины и карбогидрат антиген, индуцировали развитие гуморального иммунного ответа, в некоторых случаях, появление циркулирующих иммунных комплексов. Появление методов анализа с применением количественных и полуколичественных аналитических систем позволило идентифицировать специфические антитела ко многим внутриклеточным и поверхностным опухолевым белкам. Исследования, направленные на определение частоты развития гуморального иммунного ответа к определенному набору антигенов, путем обнаружения в сыворотке больных специфичных к ОАА антител, являются одним из шагов на пути к созданию уникальных панелей антигенов для различных типов опухолей, что могло бы способствовать определению высокого риска заболевания, а так же явиться одним из способов неинвазивной диагностики рака [16,17].

Следует отметить, что роль специфичных гуморальных факторов в противоопухолевом ответе неоднозначна. При изучении эффектов гуморальных факторов, специфичных к поверхностным опухолевым антигенам были выявлены как антителами-опосредованные ЦТЛ-реакции, комплемент-зависимый лизис опухолевых клеток in vitro, так и свидетельства участия анти-ОАА антител в ускользании опухоли от иммунного надзора (эффект маскировки) [1-5]. Анализ клинических данных при проведении оценки гуморального ответа позволил выявить корреляцию продукции антител к внутриклеточным антигенам с неблагоприятным прогнозом заболевания: появление анти- p53 антител часто ассоциировано с неблагоприятным прогнозом рака молочной железы [48].

Дополнением к идентификации гуморального ответа к ОАА явились исследования иммунологических эффектов противоопухолевых вакцин. В настоящее время имеются экспериментальные данные, свидетельствующие о корреляции гуморального и клеточного иммунного ответа при проведении вакцинотерапии[.21,22,25,29-34]. В многочисленных работах современных исследователей показано, что появление ЦТЛ и антител, специфичных к ОАА коррелирует с клиническим эффектом, при условии успешной иммунизации, и является основным критерием иммунологической эффективности противоопухолевой терапии [14,34-36,44,53-57]. Однако, утверждения о протекторной роли гуморальных факторов в противоопухолевом ответе требуют доказательств, ведущим механизмом противоопухолевой защиты по-прежнему признается реализация CD8+ цитотоксического Т-клеточного ответа.

1. Общие принципы функционирования иммунной системы

Иммунная система призвана сохранять биологическую индивидуальность организма, распознавая и уничтожая чужеродные антигены вирусной, бактериальной и химической природы, а также удаляя из организма трансформированные собственные клетки. [36]

Компоненты системы иммунного реагирования подразделяются на антиген презентирующие клетки, ответственные за распознавание антигена и презентацию его Т-хелперам, и эффекторные иммунокомпетентные клетки (плазматические клетки и цитотоксические Т-лимфоциты), осуществляющие эллиминацию антигена из организма посредством специфических антителами- и перфорин/ гранзим В-опосредованных цитокосических реакций при получении соответствующего сигнала от Т-хелперов[5].

Таким образом, условно выделяют два типа иммунореактивности: клеточный и гуморальный иммунный ответ.

Гуморальный иммунитет – комплекс иммунологических реакций, развивающихся в ответ на антигенную стимуляцию при участии специфических (антитела) и неспецифических (белки острой фазы, опсонины, компоненты системы комплемента) сывороточных белковых факторов.

Клеточный иммунитет – система иммунного реагирования на антиген посредством специфических адаптивных (цитотоксическе Т-лимфоциты) и неспецифических врожденных (дендритные клетки, макрофаги, натуральные киллеры) клеточных компонентов иммунитета.

Наиболее вероятно, что реализация иммунной защиты предполагает активацию обоих компонентов иммунной системы, гуморального и клеточного иммунитета.

Клетки лимфоидной системы, представленные Т- и В-лимфоцитами, вспомогательными клетками (макрофаги, клетки Лангерганса и фолликулярные дендритные клетки, осуществляющие презентацию антигена), функционируют в составе либо- обособленных, окруженных капсулой лимфоидных органов, либо- диффузных образований (безкапсульной лимфоидной ткани слизистых оболочек [5-7].

1.1.Органы лимфоидной системы в иммунном ответе

Основные лимфоидные органы и ткани подразделяют на превичные (центральные) и вторичные (периферические).

Первичные лимфоидные органы служат основным местом развития лимфоцитов: у млекопитающих тимус - место созревания Т- клеток, печень плода и костный мозг – В –лимфоцитов. Вторичная лимфоидная ткань – это то микроокружение, в котором лимфоциты могут взаимодействовать с антигенами. Вторичные лимфоидные органы и образования представлены селезенкой, лимфатическими узлами и лимфоидной тканью слизистых оболочек, включая миндалины и пейеровы бляшки подвздошной кишки. Функции (механизмы иммунного реагирования на антиген) лимфоидной ткани различной локализации отличаются друг от друга. Селезенка отвечает на антигены, находящиеся в крови. Лимфатические узлы защищают организм от антигенов, проникающих через кожу или слизистые оболочки и затем, транспортируемых с лимфой по лимфатическим сосудам. Имммунный ответ на проникшие такими путями антигены складывается из секреции антител в кровоток и из местных клеточных реакций. Лимфоидная ткань слизистых оболочек ответственна за защиту только слизистых. Основной эффекторный механизм местного иммунного ответа на уровне слизистой оболочки – это секреция и транспорт секреторных IgA (sIgA) непосредственно на поверхность эпителия. [66]

Лимфоидная ткань лимфатических узлов. Реакция на подкожное и внутрикожное введение антигена.

Лимфатические узлы человека – образования округлой или бобовидной формы, диаметром 2-8 мм, с углублением для входа и выхода кровеносных сосудов, называемых воротами. Лимфатические коллекторы, локализуясь в местах слияния лимфатических сосудов, образуют сеть, собирающую и фильтрующую интерстициальную тканевую жидкость во время ее прохождения от периферии к грудному лимфатическому протоку. Снаружи лимфоузел покрыт капсулой, радиально расположеные перегородки - трабекулы вместе с тяжами ретикулярного остова поддерживают заполняющие узел клетки. Различают В-клеточную (корковую) область, или кортекс, Т-клеточную (паракортикальную) область и центральную (мозговую). Последняя образована клеточными тяжами содержащими, Т- и В- лимфоциты, плазматические клетки и макрофаги.

Относящиеся к антиген-презентирующим клеткам АПК, в том числе клетки Лангерганса, из кожи и других плоскоэпителиальных покровов тела мигрируют в виде вуалевидных клеток по афферентным лимфатическим сосудам в паракортикальные области регионарных лимфатических узлов. Там они взаимодействуют с многочисленными Т-клетками и представляют собой уже интедигитальные клетки (ИДК). Такая миграция обеспечивает эффективный механизм доставки антигенов из кожи и слизистых оболочек к Т-хелперам лимфоузлов. На этих АПК обильно экспрессированы ГКГ МНС II класса, необходимыедля презентации антигена хелперным Т-клеткам [65].

Фолликулярные дендритные (разветвленные) клетки (ФДК), презентирующие антигены В-клеткам, содержатся в первичных вторичных фолликулах В-клеточных областей лимфоузлов. Прочно соединяясь с десмосомами отростков и образуя стабильную сеть, они не мигрируют из мест своего расположения. ФДК не экспрессируют ГКГ МНС класса II, но связывают антигены посредством рецепторов компонентов комплемента (CD21 и CD35), ассоциированным в данном случае с иммунными комплексами (иккосомами). Кроме того, ФДК экспрессируют рецепторы для Fc. Недавно в герменативных центрах внутри вторичных В-клеточных фолликулов обнаружен второй тип АПК- дендритные клетки центров размножения, которые в отличие от ФДК экспрессируют белки ГКГ МНС класса II и способны к миграции.

Дендритные клетки располагаются на пересечении путей врожденного и адаптивного иммунных ответов. Одним из условий эффективной активации системы адаптивного иммунитета является стимуляция дендритных клеток патогеном. Последующий процесс созревания дендритных клеток - это сложный процесс развития, характеризующийся индукцией стимулирующей активности, секрецией провоспалительных цитокинов, процессингом антигена и его презентацией и миграцией клеток в лимфатические узлы. [6, 65].

1.2. Активация иммунокомпетентных клеток

Важную роль в активации иммунокомпетентных клеток играют Т-лимфоциты. Т-лимфоциты, несущие на своей поверхности кластер СD4, хелперы. Наивные Т-лимфоциты (Th0) дифференцируются в Т-хелперы первого порядка (Th1) или Т-хелперы второго порядка (Th2), различающиеся синтезом цитокинов.

С точки зрения концепции Тh1/Тh2 дивергенции цитокины 1 типа (IL-2, IL-12, IL-15, IFN-?, IFN-?) вовлечены в Тh1 ответ, первично индуцируют Т-клеточный иммунитет, напротив, цитокины 2 типа (IL-4, IL-5, IL-6, IL-10 and IL-13) ассоциированы с Тh2 иммунным ответом, приводят к активации В-лимфоцитов и гуморального иммунитета [5,6,14]. Набор цитокинов определяет характер иммунного реагирования: развитие иммунного ответа или формирование толерантности [5]

Однако, многочисленные экспериментальные данные свидетельствуют о взаимосвязи Тh1 и Тh2 сигнальных механизмов. IL-2, помимо стимуляции пролиферации Т-хелперов, цитотоксических лимфоцитов, необходим для активации В-лимфоцитов, а также в межклеточном взаимодействии. В- лимфоциты, посредством продукции антител способны как стимулировать так и подавлять активацию Т-лимфоцитов.

Роль костимуляторных сигналов в индукции иммунного ответа.

Условием эффективности сигнальных взаимодействий иммунокомпетентных клеток с целью индукции иммунного ответа является использование двойного сигнала. Гипотеза двойного сигнала явилась теоретической основой адьювантной терапии при проведении противоопухолевой вакцинации.[18,27,54]

Антиген-презентирующие клетки (АПК), к которым относятся дендритные клетки, макрофаги и некоторые другие, взаимодействуют с патогеном. Поглощенный патоген индуцирует синтез антигенных пептидов, которые представляются в комплексе с антигенами главного комплекса гистосовместимости ГКГ (major histocomplatibility complex - MHC), формируя первый сигнальный каскад. Одновременно с этим АПК распознает “чужого”, запускает цитокиновый каскад и синтезирует костимуляторные (кооперативно действующие) молекулы В7, B7–1, B7H, 4–1BBL, обеспечивая второй сигнальный каскад. Таким образом, наивная Т-клетка претерпевает стадию дифференцировки с образованием Т-хелпера. Через сложный каскад цитокинов и взаимодействий такая клетка инициирует антительный и/или цитотоксический Т-лимфоцитарный ответ (рис.1).

Таким образом, дифференцировка наивных Т-лимфоцитов с образованием Т-хелперов происходит лишь в случае получения двух сигналов: одного - через Т-клеточный рецептор (TCR) от главного комплекса гистосовместимости второго типа (ГКГII), второго - благодаря взаимодействию костимуляторных молекул CD28 и B7–1, B7H, 4–1BBL. Первый сигнал обусловливает последующую направленность Т-лимфоцита на определенный антиген, а второй подтверждает чужеродность антигена. Антиген-презентирующая клетка обеспечивает Т-лимфоцит обоими сигналами. Для синтеза В7 АПК должна посредством патоген-распознающих молекул узнать “чужое”. Одновременно с этим патоген поглощается антиген-презентирующей клеткой, а его антигенные пептиды транспортируются на поверхность АПК с молекулой ГКГ II. Весь этот контактный процесс дополнительно сопровождается секрецией определенных цитокинов (IL-2, IL-12, IL-15, IFN-?, IFN-? ). [66]

Одним из терапевтических подходов, является стратегия увеличения экспрессии костимуляторных молекул на поверхности опухолевой клетки, таких как B7–1, B7H, 4–1BBL .

Индукция экспрессии костимуляторных молекул опухолевыми клетками при введении генетических конструктов явилась основой ДНК-вакцинации как способа активной специфической противоопухолевой иммунотерапии.[3]

Рис.1. Схема взаимодействия антиген-презентирующей клетки (АПК) с наивным Т-лимфоцитом.



Другой путь индукции специфического ответа состоит в использовании антител, специфично связывающих костимуляторные молекулы, или увеличение продукции антител специфичных к костимуляторным молекулам посредством переноса генов. [32,59]

В экспериментальных моделях на крысах Melero I. и соавт показано, иммунизация животных анти 4-1 ВВ моноклональными антителами anti?4-1BB mAb приводила к регрессии и стабилизации низкоиммуногенной саркомы и высокозлокачественной мастоцитомы.[32]

Так как экспрессия 4-1 ВВ молекул характерна не для наивных, а для зрелых Т-лимфоцитов, распознающих 4–1BBL на поверхности АПК, как полагает Adrian F возможно, противоопухолевый эффект анти-4-1ВВ антител обусловлен их стимулирующим влиянием на экспрессию рецепторов к костимуляторным молекулам на ЦТЛ в периферических органах иммунной системы.[1,32]

Несмотря на особое значение костимуляторных сигналов, индуцирующих специфический ЦТЛ иммунный ответ даже к очень низким дозам антигена, необходимым условием эффективного иммунного ответа является присутствие факторов дифференцировки цитотоксических Т-лимфоцитов, стимулирующих ГКГ экспрессию, таких как IFN-? 136,238 (32) IFN-?, продуцируется Тh1 типа, является индуктором ЦТЛ-ответа. Кроме того, работах Finkelman F D и соавт. показано, стимуляция выработки В-клетками специфических IgG изотипов, у человека IgG1, у мыши IgG2, осуществляется при участиии IFN-?. [14]

Таким образом, взаимодействие Т-хелперов и АПК после введения антигена открывает всю последовательность дальнейших событий и в основном определяет их дальнейший результат. Если активируется достаточное число хелперных Т-клеток (Тh) CD4+, то в ответ на антигенную стимуляцию Т-лимфоциты пролиферируют с образованием ЦТЛ, В-лимфоциты пролиферируют с образованием клона плазматических клеток, продуцирующих антитела. Первичный иммунный ответ заканчивается формированием клеток памяти. При повторном контакте с антигеном они обеспечивают более быстрый и выраженный вторичный иммунный ответ.

Если же стимуляция Th-лимфоцитов недостаточна, то развивается та или иная форма иммунологической толерантности. [6].

1.3. Гуморальный ответ in vivo

1.3.1. Фазы гуморального ответа

Реализация гуморального иммунного ответа включает следующие процессы:

• созревание аффинности антител и формирование иммунологической памяти.

• усиление продукции антител при вторичном ответе,

• переключение изотипов иммуноглобулинов.

Для понимания иммунологических механизмов вышеописанных процессов необходимо рассматривать функции гетерогенной В-клеточной популяции как целостной системы.

Гуморальный иммунный ответ, вызванный антигенной стимуляцией, протекает в четыре фазы.

1. Лаг-фаза, в течение которой антитела в сыворотке не обнаруживаются.

2. Лог-фаза, в течение которой титр антител нарастает логарифмически.

3. Фаза плато – стабилизация титра антител.

4.Фаза затухания ответа, во время которой происходит выделение или катаболизирование иммуноглобулинов. (рис)

Временные соотношения между фазами и уровень продуцируемых антител зависят от природы антигенного стимула и особенностей организма.

Изучение ответа на первичную и вторичную стимуляцию антигеном выявило 4 основных существующих между ними различия.

Класс антител. При первичном ответе синтез IgM предшествует появлению IgG, тогда как при втиоричном преобладают IgG, а IgM присутствуют в меньшем количестве.

Аффинность антител. Как правило при вторичном ответе антитела отличаются значительно более высокой аффинностью. Эта его особенность известна как "созревание аффинности".

Фактор времени. Вторичный иммунный ответ характеризуется укороченной лаг- фазой и более продолжительными фазами плато и затухания. По сравнению с гуморальным ответом на первичную антигенную стимуляцию тот же уровень концентрации антител после вторичной стимуляции достигается быстрее и сохраняется дольше.

Титр антител. Уровень антител во время фазы плато значительно выше при вторичном ответе и обычно в десять и более раз превышает содержание антител после первичного введения антигена.

1.3.2. Активация В-клеток

Активация В-клеток и процесс созревания В-клеточной афинности протекает в центрах размножения – герменативных центрах безкапсульной лимфоидной ткани слизистых оболочек, кортикальной зоны лимфатических узлов и краевой зоны белой пульпы селезенки.

Типы активации В-лимфоцитов.

В иммунном отвeте на большинство антигенов участвуют Т- и В-клетки, распознающие антиген сопряженно. Такие антигены называются Т-зависимыми. Однако некоторые натигены способны активировать В-клетки без помощи Т-клеток – Т-независимые антигены. При Т-зависимом иммунном ответе происходит постепенное изменение класса преобладающих специфических антител, обычно в сторону доминирования IgG. При иммунизации Т-независимыми антигенами такого переключения изотипа иммуноглобулинов не происходит, и соновным классом образующихся антител остается, как правило, IgM

Стимуляция В-клеток Т-независимыми антигенами.

Для Т-независимых антигенов характерен ряд общих свойств:

1-Все они представляют собой крупные полимерные молеккулы с повторяющимися антигенными детерминантами. 2-Многие из Т-независимых антигенов в высоких концентрациях обладают способностью активировать клоны В-клеток, специфичных к другим антигенам (феномен поликлональной В-клеточно активации). Однако в низких дозах они активируют только В-клетки соответствующей специфичности. 3- Т-независимые антигены обладают повышенной устойчивостью к деградации. Это относится к микробным антигенам, бактериальным углеводам (декстран, леван) и белкам бактерий (флагеллину и эндотоксину).

Первичный иммунный ответна Т-независимые антигны обычно слабее, чем на Т-зависимые, и достигает пика раньше. И при первичной и при вторичной иммунизации продуцируются главным образом антитела IgM .Отсутствие переключений изотипов иммуноглобулинов, можно обяснить особенностью сигнальных взаимодействий В-клеток с Т-независимыми антигенами. А именно, активация В-клеток Т-независимыми антигенами не требует участия Т-клеток, то есть осуществляется при отсутствии CD40 СD40L сигнальных взаимодействий.

Однако, для некоторых тимус независимых антигенов известно присутствие в структуре молекулы участков с поликлональной митогенной активностью, что может обеспечить полноценную активацию В-клеток в обход помощи Т-хелперов.

Активация В-клеток Т-зависимыми антигенами.

Действие тимус-зависимого антигена на В-клетку без помощи Т-клеток приводит к пролиферации сответствующего В-клетокчного клона, но не обеспечивает его дифференцировку до зрелых IgG продуцирующих клеток. Для полноценного развития клона В-клеток необходим не только специфический сигнал от гаптенной части молекулы антигена, но неспецифический – со стороны медиатора Т-клеток. Секреция последнего начинается после распознавания Т-клетками "несущей" части антигена.[36]

1.3.3 Переключение изотипов иммуноглобулинов.

Взаимодействия Т-клеток, определяющие переключение изотипов иммуноглобулинов.

Продукция цитокинов Т- и В-клетками, являющаяся результатом эффективной их активации в результате сигнальных взаимодействий с профессиональными АПК на определенной стадии их зрелости при вторичной иммунизации антигеном, определяет переключение изотипов иммуноглобулинов.

Молекулярная основа переключения изотипа.

Перестройки ДНК зависят от сигналов, генерируемых Т-клкетками CD4+, от цитокинов и CD40L, который играет особо важную роль.

Т-клеточные цитокины, присутствующие в непосредственной близости к В-клеткам, определяют новый изотип продуцируемых иммуноглобулинов.

Цитокин ИЛ4 способствует переключению на синтез IgG1 и IgE и подавляет синтез IgG2а, TGF бетта вызывает переключение на продукцию IgA IgG2b ИФ гамма.

В-лимфоциты, активированные Т клетками посредством связывания CD40 с CD40L, мигрируют в первичные фолликулы, где имеется густая сеть фолликулярных ДК. В этом окружении происходит быстрое деление В-клеток, сопровождающееся соматическим мутированием (реанжировкой) Ig- генов. [67]

1.3.4. Иммунологическая память Вторичный иммунный ответ.

Существенной особенностью гуморального иммунного ответа позвоночных животных является формирование иммунологической памяти: способность вспоминать предшествующий контакт с антигеном [3].

В-клетки с высоко аффинными рецепторами проходят отбор по выживаемости, основанный на взаимодействии их мембраносвязанных поверхностных антител и комплекса В-клетка ко-рецептор и комплементом на поверхности фолликулярных ДК. При прохождении через центр размножения В- лимфоциты экспрессируют ген "клеточной выживаемости", bcl-2. Клетки с высоко аффинными IgG за счет связывания продукта bcl-2 избегают апоптоза; клетки же с низкоаффинными рецепторами таким свойством не обладают и погибают в результате апоптоза. [68] В-клетки иммунологическо памяти качественно отличаются от непримированных В- лимфоцитов тем, что начинают продуцировать IgG антитела раньше и обычно обладают высокоафинными антигеными рецепторами благодаря селекции в ходе первичного ответа. [69]

Таким образом, специфичный гуморальный иммунный ответ (образование антител) представляет собой кульминацию ряда клеточных и молекулярных взаимодействий, происходящих в определенной последовательности: распознавание антигена, представленного им антиген презентирующими клетками, пролиферация активных Т- и В-клеток, синтез антител. Взаимодействие компонентов Т-клеточного и гуморального иммунитета осуществляется практически на всех уровнях реализации иммунной защиты, включая презентацию антигена иммунокомпетентным клеткам и элиминацию антигена из организма. При участии гуморального иммунного ответа, посредством продукции антител, осуществляются сложные иммунорегуляторные функции, обеспечивающие поддержание гомеостаза организма, а иногда, в условиях нарушения иммунокомпетентности лежат в основе патогенеза различных заболеваний.

2. Гуморальный ответ при онкогенезе. Экспериментальные данные

За последние десятилетия в многочисленных работах отечественных и зарубежных исследователей показано, что развитие опухоли сопровождается появлением антител, специфичных к опухолевым антигенам .[20-23,34,39]. Данный принцип функционирования иммунной системы лег в основу нового метода идентификации иммуногенных опухоль-ассоциированных антигенов ОАА и поставил перед учеными новую задачу, изучения роли антител к ОАА в противоопухолевом иммунном ответе.

В 1988г Wong JH и сооавт. продемонстрировали экспрессию ОАА на перевиваемых линиях клеток меланомы, используя сыворотку больных меланомой пациентов, предварительно абсорбировав ее на аутологичных лимфобластных клетках для удаления антител, необладавших специфичностью к ОАА [60].

В середине 1990-х годов был разработан метод  серологического скрининга экспрессионных рекомбинантных клонотек кДНК, полученных из опухолевого материала (SEREX) (Sahin et al., 1995). Клоны, на которые есть иммунный ответ с высоким титром IgG, отбираются для дальнейшего анализа. Таким образом, был разработан эффективный метод, позволяющий одновременно анализировать большой набор антигенов, выявляемых по методу SEREX к раковым антигенам - SMARTA (Serological MiniArrays of Recombinant Tumor Antigens, Lagarkova et al., 2003),. и быстро оценить их принадлежность к тому или иному классу [11].

Использование спектра антител онкологических больных для систематического поиска опухолевых антигенов позволило идентифицировать полный спектр человеческих опухолевых антигенов, продемонстрировав, что многие опухоли человека вызывают многочисленные иммунные ответы в организме опухоленосителя [53].

2.1 Спонтанный гуморальный ответ к опухолевым антигенам, корреляция с экспрессией ОАА.

Анализируя опыт своих коллег по изучению механизмов развития противоопухолевого ответа, Roshni Mitra и соавт пришли к выводу, что выраженность гуморального иммунного ответа к опухоль-ассоциированным антигенам ОАА определяется иммуногенностью опухолевых клеток [36]. Поскольку опухолевые антигены могут стимулировать или возможно блокировать иммунные реакции, их наличие на поверхности клеток может быть критическим фактором, влияющим на рост опухоли [59, 63] .

Предметом многочисленных исследований конца 90х явилось изучение экспрессии ОАА у онкологических больных во взаимосвязи с гуморальным и клеточным иммунным ответом, а так же характером течения заболевания [40, 58, 59].

В работах, опубликованных в 1991г. Portoukalian J, Carrel S было показано, что уровень специфических антител к ОАА меланомы MAGE-1, MAGE-3, SSX2, Melan A, и тирозиназа в сыворотке крови онкологических больных зависит от уровня экспрессии этих антигенов в организме опухоленосителя [48]. Позднее Jager E и соавт. исследовали гуморальный иммунный ответ к ОАА меланомы (MAGE-1, MAGE-3, SSX2, Melan A и тирозиназа) во взаимосвязи с клиническими данными. При проведении оценки уровня антител, специфичных к ОАА, методом твердофазного иммуноферментного анализа в сыворотке пациентов с меланомой после тотальной резекции опухоли без метастазов присутствие антител не было выявлено, в то время как высокие титры антител к меланома-ассоциированным антигенам МАА обнаруживались у пациентов с опухолевой прогрессией [22].

Ген NY-ESO-1, клонированный из опухоли пищевода, , SEREX методом, экспрессия которого была показана для рака яичек, стал предметом многочисленных исследований в области экспериментальной иммунологии и онкологии, так как в отличие от других известных ОАА, распознаваемых ЦТЛ, гуморальный ответ против NY-ESO-1 часто обнаруживается при анализе сыворотки крови пациентов с опухолями различных типов, экспрессирующими NY-ESO-1 антиген. Предварительными данными показано, что гуморальный ответ зависит от уровня экспрессии антигена. При исследовании нормальных индивидов и онкологических больных антитела к NY-ESO-1 обнаруживались в 44-50% случаев только в группе последних при высокой экспрессии NY-ESO-1 [20]. Прогрессия заболевания, как правило, сопровождается увеличением экспрессии NY-ESO-1, а стабилизация титров антител NY-ESO-1 на протяжении длительного времени в течение трех лет наблюдалась у пациентов с постепенной регрессией большой массы опухоли [21].

В 2005 Nakagava K. и соавт. опубликовали результаты работы, по изучению экспрессии транскриптов идентифицированного ими гена XAGE-1, обладающего характеристиками СТ-подобного антигена (cancer/testis-like antigens), у пациентов с аденокарциномой легких. В результате проведения оценки гуморального иммунного ответа методом ELISA и Western blot-гибридизации продукция анти-XAGE-1b антител была выявлена только у пациентов с XAGE-1b продуцирующим гистологическим типом опухоли [44].

По данным Enkhtsetseg Purev et al. гуморальный и клеточный иммунный ответ к мутантному рецептору фактора роста EGF-RvIII у больных раком молочной железы коррелировал с эксспрессией EGF-RvIII и не наблюдался у здоровых доноров. [50].

2.2. Спонтанный гуморальный ответ к ОАА: механизм реализации иммунорегуляторных функций.

Продукция идиотипических антител как способ иммуносупрессии в условиях злокачественного роста.

Многочисленные экспериментальные данные свидетельствуют о том, что продукция антител к ОАА при онкогенезе является одним из механизмов ускользания опухолевых клеток от иммунного надзора анти-ОАА. IgG антитела блокируют сигнальные молекулы антигенных пептидов составе ГКГ на поверхности опухолевых клеток, препятствуя тем самым распознаванию ОАА иммунокомпетентными клетками. Данный иммунологический механизм получил название "эффект маскировки".

Антитела направленно взаимодействующие с HLA-DR комплексами на плазматической мембране В-лимфоцитов и моноцитов человека, как было показано Muchmore AV, Megson M, Decker JM, in vitro подавляют клеточные и гуморальные иммунные реакции. При изучении эффектов антител с мононуклеарами периферической крови МПК в реакциях антиген-специфическикой пролиферации и поликлональной продукции иммуноглобулинов выявлена супрессия реакций в присутствии интактных IgG фракций кроличьей гетероантисыворотки (anti-P29,34), человеческой аллоантисыворотки (Ia 172), и мышиных моноклональных антител in vitro. Для выделенных F(ab')2 фрагментов антител данные эффекты в исследуемых концентрациях не были показаны. Полученные Muchmore AV, Megson M, Decker JM экспериментальные данные, позволяют сделать вывод о роли Fc доменов в присутствии ингибиторных свойств антител к HLA-DR молекулам. [43].

В модели плазмоцитомы, когда опухолевые В-клетки неспособны экспрессировать ГКГ 2 класса, Bogen B и соавт продемонстрировано развитие толерантности CD4⁺ T-клеток к опухолевым Ig идиотипам. Позднее было показано, толерантность опосредована клональной делецией Т-клеток, специфичных к идиотипам, и дозо-зависимо индуцируется при повышении концентрации Ig опухолевых белков в сыворотке крови. [45]

3. Гуморальный иммунный ответ, индуцированный противоопухолевой иммунотерапией.

3.1 Корреляция гуморального и клеточного иммунного ответа при проведении противоопухолевой вакцинации.

Многочисленные экспериментальные данные свидетельствуют о развитии специфичного к ОАА антигенам гуморального иммунного ответа в результате иммунизации различными клеточными вакцинами [17,40], вирусными рекомбинантами, пептидными [20,21,26] и ДНК-вакцинами [27,43,45], который часто сопровождается клиническим эффектом. [17,22,37-46]. По мнению исследователей Alexander Knuth, Dirk J?ger, Elke J?ger, анализ клинических данных по результатам проведения иммунизации онкологических больных за прошедшие годы позволит сделать вывод о применимости оценки интенсивности гуморального ответа к ОАА как критического параметра, определяющего иммунологическую эффективность вакцинации [1].

Пептидные вакцины

Экспериментальные данные, представленные в работах Elke J?ger, Yasuhiro Nagata, Sacha Gnjatic по изучению иммунологических эффектов пептидной противоопухолевой вакцины свидетельствуют о корреляции гуморального и клеточного иммунитета к NY-ESO-1 при проведении специфической иммунотерапии: CD8⁺ T клеточный ответ к HLA-A2-презентированным NY-ESO-1 пептидам был выявлен у пациентов с анти-NY-ESO-1 антителами и не был обнаружен у пациентов с недостаточно выраженным гуморальным ответом к данному антигену, а так же при низкой экспрессии NY-ESO-1. [20-24]

При проведении оценки клинических результатов вакцинотерапии рака толстой кишки после иммунизации пептидной вакциной на основе карцинома-эмбрионального антигена у пациентов с высоким уровнем IgG антител против муцин сиалил Tn (STn) эпитопов отмечается увеличение продолжительности жизни. Повышение уровня anti-STn IgM антител является независимым критерием благоприятного прогноза рака толстой кишки [42].

Вирусные рекомбинанты и ДНК-вакцины

Puisieux I и соавт. показали, иммунизация мышей вакциной на основе вирусных рекомбинантов, кодирующих CEA, индуцировала эффективный клеточный и гуморальный ответ к СЕА, спровождающийся положительными реакциями ГЗТ у животных с СЕА-экспрессирующими опухолями.[49] .E. Jager, J. Karbach, S. Gnjatic и соавт. показано, иммунизация онкологических больных вакциной к NY-ESO-1 антигену, на основе рекомбинантного вируса ветряной оспы домашней птицы, индуцирует гуморальный и клеточный иммунный ответ к NY-ESO-1 [33]. По мнению Rosenberg SA важной особенностью ДНК-вакцин, как способа невирусного переноса генов для иммунизации, является их способность активировать Тh2 –лимфоциты, индуцируя преимущественно гуморальный ответ.[51]

Вакцины на основе идиотипических антител

В работах J. S. De Bono и соавт. показано, иммунизация онкологических больных BrevaRex^® mAb-AR20.5 моноклональными крысиными антителами к MUC1 опухоль-ассоциированному антигену индуцирует как клеточный, так и гуморальный имммунный ответ к MUC1. [4]. По данным Morton D L , высокие титры anti-MUC-1 IgG антител при проведении вакцинотерапии анти-MUC1 идиотипическими антителами являются фактором благоприятного прогноза для пациентов с раком молочной железы и другими MUC1 экспрессирующими опухолями [40,41]

Вакцины на основе анти-идиотипических антител

В качестве индуктора специфического иммунного ответа могут выступать и антиидиотипические антитела. По мнению Ferrone и соавт. антиидиотипические антитела теоретически могут стимулировать "спящие" клоны иммунных клеток, нереактивных по отношению к неоантигенам псевдоантигенам, и тем самым индуцировать гуморальный и возможно клеточный иммунный ответ. [65]

При проведении 1/2 фазы клинических испытаний вакцины на основе антиидиотипических антител к меланома ассоциированным антигенам высокой молекулярной массы (HMW)-MAA, в соединении с БЦЖ как адьювантом, анализ гуморального иммунного ответа к HMW-MAA выявил наличие антител против HMW-MAA у 60 % пациентов с меланомой IV стадии [38]. При чем, данные анти-HMW-МАА антитела обоих IgM и IgG изотипов способствовали развитию ЦТЛ-опосредованного иммунного ответа к антиидиотипам, и сопровождались увеличением продолжительности жизни пациентов . [37, 38, 40]

Аллогенные вакцины на основе опухолевых клеток

Для оценки иммунологических эффектов аллогенной клеточной вакцины CancerVax на основе клеток меланомы трех линий, экспрессирующих широкий диапазон ОАА и ГКГ пептидные комплексы, Morton DL, Takahashi T исследовали гуморальный и клеточный иммунный ответ у вакцинированных больных с диссеминированной меланомой III и IVMб стадии. .[40,55]. В работах Morton DL, Foshag LJ, Hoon DS показано, что иммунные факторы, специфичные к клеткам вакцины CancerVax, могут перекрестно реагировать с опухолевыми клетками реципиента, экспрессирующими иммуногенные ОАА, такие как ганглиозиды (GD2, GM2, GD3, и GM3), гликопротеины (М-фетальный антиген, TA90), и белки (MAGE-1, MAGE-3). При этом, различные ОАА индуцируют и гуморальный и клеточный ответ против аллогенных опухолевых клеток .При исследовании IgG и IgM гуморального иммунного ответа к TA90, одного из ОАА клеток аллогенной вакцины CancerVax, было выявлено, IgM ответ к TA90 сопровождался увеличением продолжительности жизни иммунизированных больных в два раза по сравнению с результатами в группах, получавших только химиотерапевтическое лечение или БЦЖ-адьювантную терапию, где средняя продолжительность жизни составляла 7,5 месяцев.[41]

Анализ результатов клинических испытаний вакцины CancerVax у пациентов с аденокарциномой кишечника Colorectal cancer (CRC) показал, что активация Т-хелперов и продукция антител не всегда сопровождаются выраженным клиническим эффектом. В результате проведения вакцинотерапии у всех 32 обследуемых был выявлен поликлональный IgG гуморальный ответ к раковому-эмбриональному антигену РЭА carcinoembryonic antigen (CEA), 17 из которых с CRC IV стадии. У семи из восьми пациентов, иммунизированных после операции, наблюдалась стабилизация процесса в течение 12-33 месяцев. Восемь из девяти пациентов с неоперабельными опухолями отвечали на терапию прогрессией заболевания.[17].

В то же время при иммунизации антиидиотипическими антителами к РЭА по данным, появление IgM антител к CEA является благоприятным фактором в прогнозе колоректального рака [2].

Часто гуморальный ответ при вакцинации сопровождается Т-клеточным ответом к ОАА и коррелирует с клиническим эффектом. Однако, роль IgG и IgM гуморальных факторов в противоопухолевой защите различна.[15,17,39,40]. Показано, что именно продукция IgM антител к ОАА, индуцированная введением вакцины, в большинстве случаев сопровождается клиническим эффектом. Таким образом, хотя экспериментальные данные свидетельствуют о развитии гуморального и клеточного иммунного ответа при проведении вакцинотерапии, роль гуморальных факторов в развитии противоопухолевого ответа остается невыясненной.

3.2 Возможные механизмы противоопухолевой защиты при участии гуморальных факторов.

Накопление положительного опыта использования анти-идиотипических антител в терапии рака молочной железы и В-клеточной лимфомы за последние годы вновь привлекло интерес исследователей к изучению роли гуморальных факторов в противоопухолевом иммунном ответе.

При изучения механизмов реализации цитотоксических реакций при участии гуморальных факторов Carter P и соавт. показали: антитела не оказывали прямое цитотоксическое воздействие на клетки, инфецированные вирусом, или опухолевые клетки per se, но блокировали вирусные сигнальные молекулы на поверхности или осуществляли реализацию второго эффекторного механизма, индуцировали антителами-опосредованные ЦТЛ-клеточные реакции antibody-dependent cellular cytotoxicity (ADCC) или комплемент-зависимую цитотоксичность complement-dependent cytotoxicity (CDC).[8]

Протективная роль отдельных изотипов иммуноглобулинов может быть выяснена исходя из их основных функций. Для пентамера IgМ наиболее характерна эффективная активация системы комплемента, для мономера IgG – опсонизация и ЦТЛ-опосредованная цитотоксичность.

3.2.1. Нейтрализация

Один из гипотетических механизмов позитивного влияния ОАА на эффективность развития противоопухолевого, в том числе и гуморального ответа при вакцинации, основывается на способности поверхностных гликопротеинов функционировать как молекулы клеточной адгезии. Многие ОАА представляют собой молекулы с большим молекулярным весом (ТА90, CEA, МUС1) и выраженными адгезионными свойствами и, обеспечивая эффективное прикрепление, играют ключевую роль в метастазировании.

Если ОАА оказываются вовлечены в клеточную адгезию, то возможным механизмом протективного действия антител, специфичных к ОАА, является способность блокировать молекулы эпитопов клеточной адгезии.

Повысить эффективность противоопухолевой вакцинации можно и модифицируя некоторые регуляторные взаимодействия между клетками иммунной системы. Так, блокада CTLA-4 Т-клеточного рецептора усиливает иммунный ответ на опухолевые антигены. Этот рецептор, как и СD28, связывается с В7.1 и В7.2 молекулами дендритных клеток, обладая при этом большей аффинностью подавлять Т-клеточный иммунный ответ. В экспериментальных исследованиях показано, что применение анти-CTLA-антител существенно усиливает иммунный ответ, что коррелирует с противоопухолевым эффектом. Начаты клинические испытания таких антител совместно с вакцинацией против меланомы, рака яичников и простаты [45].

Стимуляция выработки идиотипических антител к ОАА — как способ вакцинотерапии злокачественных опухолей

G17DT- (синтетический гастриноподобный пептид, связанный с дифтерийным токсином) иммуноген, используется как стимулятор продукции нейтрализующих антител против гастрина, который, в свою очередь, является ростовым фактором GI злокачественных опухолей. При анализе клинических результатов иммунотерапии G17DT-вакциной выявлено увеличение продолжительности жизни пациентов с продвинутым раком поджелудочной железы по сравнению с плацебо [42]. Появление anti-G17 гуморального ответа, как было показано, сопровождалось клиническим эффектом и являлось критерием благоприятного прогноза заболевания.[42,43].

3.2.2. Атителами опосредованные ЦТЛ-реакции.

Неуклонно пополняется количество экспериментальных данных, свидетельствующих об участии в распознавании опухолевых антигенов факторов гуморальной иммунной системы. Антителозависимый Т-клеточный цитолиз осуществляется экстрацеллюлярно в отсутствии комплемента и обеспечивается киллерными клетками Т-системы, имеющими рецептор к Fc-фрагменту IgG. В-лимфоциты не обладают такой цитотоксичностью, а эффективность Т-киллеров выше, чем активность фагоцитов. Данный механизм имеет значение в противоопухолевом иммунитете, реакции отторжения трансплантата, хроническом прогрессирующем гепатите и др.[8]

Elisabeth Stockert и соавт. было показано, что в сыворотке больных меланомой обнаруживаются антитела, специфичные для опухолевых антигенов, которые являются в свою очередь мишенями для распознавания цототоксических Т-лимфоцитов, к таким антигенам относятся MAGE и тирозиназа, обнаруживаемые в сыворотке пациентов, больных меланомой, а так же ЦТЛ специфичны для NY-ESO-1, антиген рака яичка, инициирующего образование аутологичных антител, которые были недавно идентифицированны.[22,36] В отногшении NY-ESO-1, в сыворотке больных к которому выявлены специфичные антитела, были идентифицированы три HLA-A2-презентируемых пептида, распознаваемые СTL двух различных линий.[20, 26].

3.2.3. Комплемент-зависимый лизис опухолевых клеток, опосредованный анти - ОАА IgM антителами.

Результатом специфического связывания IgM антител с антигеном на поверхности клетки является взамодействие Fcфрагментов иммуноглобулинов с компонентом системы комплемента C1q (классический путь активации системы комплемента), запускающее каскад протеолитических реакций, и приводит в итоге к формированию "мембранного атакующего комплекса" на поверхности клетки мишени. Многочисленные продукты последовательной активации компонентов системы комплемента, анафилактогены, осуществляют амплификацию сигнала, способствуют опсонизации и фагоцитозу.

Таким образом, возможным результатом специфического связывания IgM-антител с ОАА на поверхности опухолевых клеток может являться активация системы комплемента.

В экспериментальной модели in vitro Hunt KK, Shibata M, Gupta RK, Morton DL. продемонстрировали IgM-опосредованный комплемент-зависимый лизис опухолевых клеток на примере ТА90-специфичных реакций. Выделенные из сыворотки пациентов, иммунизированных вакциной на основе аллогенных клеток меланомы, поликлональные анти-ТА90 IgM, но не анти ТА90 IgG антитела, в присутствии комплемента морской свинки осуществляли лизис от 36% до 71% культивируемых опухолевых клеток различных линий, включая меланому, рак молочной железы, нейробластому. Было выявлено отсутствие цитотоксичности после предварительной абсорбции сыворотки на клетках меланомы различных линий, но не на аутологичных лимфобластах.[58]

Результаты исследований по изучению IgG и IgМ продукции при вакцинации во взаимосвязи с клиническими данными свидетельствуют о преимущественной роли IgМ в реализации противоопухолевого ответа.[40,41]. Таким образом, IgМ опосредованная активация комплемента против опухолевых клеток может являться одним из возможных механизмов противоопухолевого действия гуморальных факторов.

4 . Экспериментальные модели изучения гуморального ответа к ОАА меланомы, индуцированного вакцинотерапией. Системы мониторинга гуморального иммунного ответа у опухолевых больных.

Работы по изучению иммуногенности ОАА меланомы, а именно гуморального иммунного ответа к данным антигенам у опухолевых больных появились уже в конце 60х годов двадцатого века.

Принцип определения поликлонального гуморального ответа к ОАА в реакции поверхностной иммунофлюоресценции, одним из первых описанный в работах Morton et al., Surgery 1968, лег в основу экспериментальных моделей по изучению иммунологических эффектов противоопухолевых аутологичных и аллогенных вакцин на основе опухолевых клеток.

Для оценки гуморального иммунного ответа у пациентов с меланомой IIIА, IVМб стадии при проведении клинических испытаний противоопухолевой вакцины "MCV" на основе аллогенных клеток меланомы Ravindranath, Euhus и соавт определяли уровень анти ММА IgM и IgG антител в сыворотке иммунизированных больных по реакции поверхностной флюоресценции при окраске FITC конъюгированными goat anti-human IgG антителами по методике, описанной Morton et al., Surgery. [69] Сыворотка, после предварительной абсорбции на аутологичных лимфобластах для удаления антител, специфичных к HLA антигенам ( Saxton et al., Int J Cancer 1987), тестировалась против М14 линии меланомы, экспрессирующей все шесть иммуногенных МАА: ганглиозиды (GD2, GM2 и O-acetyl GD3), липопротеин меланомы и гликолипиды. (Sidell et al., Cancer Immunol Immunother 1979). Ранее Euhus et al., Cancer (Immunol Immunother 1989) было показано, что ганглиозиды GD2, GM2 и O-ацетил GD3 индуцируют IgM ответ, остальные МАА индуцируют продукцию обоих, IgM и IgG, подклассов антител.

Подобное исследование сыворотки крови иммунизированных пациентов было проведено на аутологичных клетках меланомы, предварительно выделенных, ослабленных обработкой ферментом (Chang et al., J Clin Lab Analysis 1:326-331(1987)), культивированных в течение 2 – 4 дней в RPMI 1640, содержащей 5 % человеческой сыворотки пуповины, для постановки реакции иммунофлюоресценции. Учет результатов проводился на проточном цитофлюориметре FACscan (Becton Dickinson, Calif.). Анализ полученных результатов, показал корреляцию гуморального ответа к ОАА с положительными реакциями на ГЗТ, а так же с клиническим эффектом вакцинотерапии.

Экспериментальная модель исследования гуморального иммунного ответа у пациентов с диагнозом диссеминированная меланома, вакцинированных аллогенной противоопухолевой вакциной на основе клеток меланомы, в the John Wayne Cancer Institute (JWCI) включала определение титров IgG, IgM антител к очищенному TA90 гликопротеину, ОАА меланомы, и неочищенному PPD, не являющемуся ОАА, для оценки эффективности совместно с вакцинацией проводимой адьювантной терапии при иммунизации БЦЖ.. Модифицированная методика твердофазного ИФА сделала возможным исследование у пациентов IgG и IgM гуморального иммунного ответа к TA90. Для оценки гуморального ответа к ОАА использовались Anti-TA90 IgG and IgM антитела и очищенный TA90 гликопротеин, как мишень для определения титров IgG и IgM антител.[17]

Очищенный TA90 гликопротеин был мобилизован в гель в концентрации 50 нг в лунке, 100 мкл образцов сыворотки крови инкубировали в лунках планшета, после чего в лунки были добавлены Goat antihuman IgG (1:500) или antihuman IgM (1:1000) антитела коньюгированные с алкалинфосфатом.

Было показано, что гуморальный иммунный ответ к ТА90 , но не к PPD, коррелирует с Т-клеточным ответом и клинической эффективностью вакцинотерапии. Следует отметить, развитие гуморального иммунного ответа к ОАА при вакцинации не было связано с неспецифическими иммунными реакциями, вызванными адьювантной терапией БЦЖ, проводимой совместно с противоопухолевой вакцинацией, так как IgM, IgG гуморальный ответ к TA90 при вакцинации аллогенной вакциной на основе клеток меланомы не коррелирует с иммунным ответом к маркеру иммунологической реактивности к БЦЖ. (PPD), неявляющемуся ОАА.[41]

В 2003 г калифорнийскими учеными были опубликованы результаты исследований по изучению гуморального иммунного ответа у онкологических больных, иммунизированных аллогенной вакциной на основе клеток меланомы, экспрессирующих gp43 комплекс ОАА (из 810 антигенов). Группа обследуемых включала 44 пациента с регионарной метастатической меланомой (22- с клиническим эффектом в течение 1 года после вакцинации, 22 – с периодом ремиссии в течение 5 лет). После проведения предварительной оценки связывания IgM-человеческих моноклональных антител L92 и цитотоксических Т-лимфоцитов с gp43 опухоль-ассоциированным антигенным пептидом была проведена оценка IgG, IgM антительного ответа к 810 антигенному пептиду gp43 методом твердофазного ИФА. Выявлено значительное увеличение IgM на четвертую неделю (после первой прививки). Уровень IgM был значительно высоким у пациентов, проживших более 5 лет [55].

Elisabeth Stockert et al была разработана система скрининга гуморального иммунного ответа к аутоиммуногенным опухолевым антигенам у онкологических больных с применением следующего набора рекомбинантных белков NY-ESO-1, MAGE-1, MAGE-3, SSX2, Melan-A и тирозиназы для твердофазного иммуноферментного анализа [54]. Было показано, что уровень специфических антител к ОАА меланомы в сыворотке онкологических больных зависит от уровня экспрессии этих антигенов в организме опухоленосителя [54].

Zhang J-Y, Casiano C A., Peng X-X проведены исследования по изучению возможностей применения минилучевого ELISPOT анализа для обнаружения антител, специфично связывающих определенные группы антигенов на опухолевых клетках, так называемых ОАА. В предложенной авторами экспериментальной модели мини-лучевой анализ ОАА включал определение полноразмерных рекомбинантных пептидов экспрессируемых cDNA, кодирующей протоонкогены c-myc, p53, cyclin B1, p62, Koc, IMP1 и, тем самым, сигналы выживания. У всех 527 исследуемых больных частота обнаружения антител была различной и определялась типом антигена, но не превышала 15-20%. Однако, следует отметить, что исследовались пациенты с опухолями различной локализации и стадией заболевания. Кроме того, в дополнении к суммарной оценке гуморального ответа к общему числу антигенов, при проведении пошаговой оценки к каждому из опухолевых антигенов в отдельности частота положительных реакций с антителом увеличивалась до уровня 44-68%. Для рака молочной железы, легких и простаты показано наличие индивидуального профиля реактивности, что достигается путем уникальной конструкции антигенов mini-array. Для колоректального рака, гепатоцеллюлярной карциномы и рака желудка с выбранными семи ОАА индивидуальный профиль антител не был показан.[64]

По мнению Michele Maio исследование гуморального ответа к заданному набору опухолевых антигенов методом твердофазного иммуноферментного анализа- an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)- открывает новые возможности ранней диагностики рака и может явиться одним из способов мониторинга гуморального иммунного ответа при проведении активной специфической иммунотерапии.[29].

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, мониторинг гуморального иммунного ответа у опухолевых больных необходим не только для установления характера течения и прогноза заболевания, но и служит неотъемлемым компонентом оценки эффективности противоопухолевой вакцинотерапии. Исследования гуморального иммунного ответа в различных экспериментальных моделях открывают новые возможности в выявлении перспективных мишеней вакцинотерапии и служат основой в понимании механизмов функционирования противоопухолевого иммунитета и иммунной системы в целом.

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1.Описание использованных материалов

2.1.1 Реактивы

Калий хлористый KC l(ХЧ, ТУ 6-095324-87)

Калий фосфорнокислый однозамещенный KH₂PO₄ (ХЧ, ТУ 6-095324-87)

Натрий хлористый NaCl (ХЧ, ГОСТ 4233-77)

Натрий фосфорнокислый двузамещенный двенадцативодный Na₂HPO₄ *12Н₂О (ХЧ, ГОСТ 9337-79)

Натрия азид NaN₃ (ХЧ, ГОСТ 9337-79)

Глицерин (Лаверна)

Формалин (ГОСТ 1625-89)

Bovine serum albumine BSA (Sigma)

Антитела

F(ab)²-goat anti-human IgG FITC (Serotec: STAR97F, Bratch No 0504),

F(ab)²-goat anti-human IgM RPE (Serotec: STAR99PE, Bratch No 270605)

Растворы для ведения линий

Версен стерил. (БиоЛот, Серия №8-04-06, 27.12.04)

Dimethil sulfoxid DMSO

Компоненты питательных сред

RPMI 1640 стерил. (БиоЛот, Серия К 05-04, 17.03.05)

Телячья эмбриональная сыворотка стерильная фильтрованная ТЭС-Fetal Bovine Serum Research Grade-EU Approved, tripe 0,1 um Sterile Filtred (Hy Clone, Pc: CH 30160.03, Lot No: CPK 0163, expiry date: OCT 2008, Bottle tic 0822)

Гентамицин (10мг/мл, 10мл, Кат № А011)

Пируват натрия стерил. (11мг/мл, 10 мл, Кат №Ф023)

L-глутамин сухой (146 мг, Кат № Ф032)

2.1.2.Буферные растворы и питательные среды

Состав буферных растворов и питательных сред представлен в таб1-4 (См. в разделе Приложения.- 1.Описание использованных материалов.)

1. Двусолевой фосфатный буферный раствор PBS 10x, pH(1x)=7.4 (таб. 1)

Стерилизовали автоклавированием, раствор титровали после разбавления до pH 7.4.

2. Буфер для антител.(таб. 2)

3. Раствор формальдегида в РВS 1% (таб. 3)

4. Питательная среда для ведения клеточных линий меланомы

Компоненты питательных сред представлены в таб. 4. приложения.

С целью сохранения чистоты культуры для каждой из перевиваемых линий опухолевых клеток использовалась отдельно приготовленная стерильная среда.

5. Замораживающая смесь (ТЭС 90%, ДМСО 10%)

2.1.3. Характеристика клеточных линий

Используемые в эксперименте перевиваемые клеточные линии меланомы melKor(HLA-/-), melP(HLA+/-), melIbr(HLA+/+), получены и охарактеризованы сотрудниками НИИ ЭДиТО ГУ РОНЦ им Н. Н. Блохина. Линии охарактеризованы по экспрессии опухоль-ассоциированных антигенов MELAN-A, gp100, S100 методом иммуногистохимического анализа*. В смешанной опухоль-лимфоцитарной реакции показано, клетки melKor (HLA-/-), melP(HLA+/-), melIbr (HLA+/+) in vitro стимулируют экспрессию CD25, CD71, CD95, HLA-DR лимфоцитов здоровых доноров.**таб.5, рис1-3 (Приложения.-раздел1.)

* Михайлова И.Н. Лукашина М.И, Барышников А.Ю. и др. Клеточные линии меланомы – основа для создания противоопухолевых вакцин // Вестник Российской академии медицинских наук Москва Медицина 2005 с. 37-40.

** Смирнова А.В., Лукашина М.И., Михайлова И.Н. Исследование роли экспрессии молекул HLA I и II классов в активации лимфоцитов./ В печати

2.1.4 Оборудование

Ламинарный шкаф (БОВ 0-0-1).

СО_2- инкубатор (Flow cytometry, USA).

Световой микроскоп (Биолан, МБ).

Центрифуга (Beckman GPR Centrifuge, UK).

Дозаторы переменного объема автоматические (Biohit, Fin).

2.2. Методы исследования

Исследование гуморального иммунного ответа проводили

у 12 пациентов с гистологически верифицированным диагнозом диссеменированная меланома (9 женщин в возрасте от 49 до 52 лет и 2 мужчин в возрасте от 45 до 50 лет), получивших полный курс химио- и лучевой терапии в Российском онкологическом научном центре им Н.Н. Блохина РАМН, которые прошли курс иммунотерапии в рамках проведения 2 фазы клинических испытаний противоопухолевой вакцины "Аллоген", на основе клеток меланомы линии melP, модифицированных геном tag7, в период с ноября 2004г. по ноябрь 2006г.

2.2.1. Протокол вакцинации

Иммунизацию осуществляли внутрикожным введением вакцины в количестве 2*10⁶ клеток (в плечо, лопаточную, паховою, околопупочную области), с интервалом 7-14 дней. Забор сыворотки крови для проведения иммунологического исследования осуществлялся непосредственно перед 1, 3, 5, 10, 15 и 26 введением вакцины (до введения вакцины, после 2, 4, 9, 14 и 25 введений).

Продолжительность иммунизации изменялась в зависимости от реакции пациентов на введение вакцины и характера течения заболевания.

В зависимости от продолжительности вакцинотерапии можно выделить три группы пациентов: 1)- "группа А"- пациенты с продолжительностью вакцинотерапии более 10 мес. (21-32 введений) — 3 из 12 (25%); 2)- "группа В"-пациенты с продолжительностью вакцинотерапии от 5 до 8 мес. (12-17 введений)— 6 из 12 (50%); 3)- "группа С"- пациенты с продолжительностью вакцинотерапии до 4 мес. (5-8 введений) — 3 из 12 (25%).

2.2.2. Культуральная работа

Клеточные линии (глава 2 -раздел1.4.), имеющие монослойный характер роста, культивировали в питательной среде на основе RPMI-1640 (2- 1.1.), в условиях абсолютной влажности при 37°С, в атмосфере 5% СО₂. Клетки поддерживали в логарифмической фазе роста постоянным пересевом культуры через 3-4 дня. Для открепления клеток с пластика использовали раствор Версена (2- 1.1).

2.2.3. Реакция прямой поверхностной иммунофлуоресценции

Титрование goat-anti-human IgG FITC, goat-anti-human IgM RPE поверхностных антител (2- 1.1) проводили на МПК больного хроническим лимфолейкозом, выделенных в желатине по стандартной методике (Лимфоциты. Методы. Под ред. Дж. Клауса. – М.: Мир – 1990).

Дважды отмытый в 10 мл раствора РBS центрифугированием (200g 10') клеточный осадок ресуспендировали в 1мл раствора РBS для подсчета концентрации клеток в камере Горяева. К 50 мкл клеточной суспензии, содержащей 2,5х10⁵ клеток, добавляли по 20 мкл разведения goat-anti-human IgG FITC, goat-anti-human IgM RPE антител в соответствии с протоколом эксперимента (2- 3.1), инкубировали при +4C в темноте 30 минут. Клетки дважды отмывали в 1 мл PBS центрифугированием (200g 10'), затем фиксировали добавлением 300 мкл 1% раствора формальдегида в PBS (2- 1.2).

2.2.4. Реакция непрямой поверхностной иммунофлуоресценции

Каждому из образцов сыворотки крови был присвоен кодовый номер, таким образом, иммуноанализ проводили вслепую.

Для приготовления аликвот (1:2, 1:10) сывороток иммунизированных вакциной пациентов использовали буфер для антител (2-1.2). Оценку связывания антигенных опухолевых пептидов, экспрессируемых на клетках трех линий меланомы (2-1.4.), проводили в реакции непрямой поверхностной флюоресценции с использованием F(ab)²goat-anti human IgG FITC (разведение 1:200), F(ab)²goat-anti human IgM RPE (разведение 1:10) антител. После культивирования клетки собирали и дважды отмывали в растворе PBS, pH 7,4. По 50 мкл клеточной суспензии каждой линии, содержащей 2,5х10⁵ клеток, вносили в соответствующие пронумерованные пробирки, добавляли по 20 мкл сыворотки в соответствии с протоколом эксперимента (2- 3.2) и инкубировали при +4C в темноте 30 минут. Клетки дважды отмывали в 1 мл PBS центрифугированием (200g 10'). Затем добавляли по 20 мкл F(ab)²goat-anti human IgG FITC, F(ab)²goat-anty human IgM RPE антител (методы -1.1) и инкубировали при +4C в темноте 30 минут. Клетки дважды отмывали в 1 мл PBS центрифугированием, затем фиксировали добавлением 300 мкл 1% раствора формальдегида в PBS (2-1.2).

2.2.5. Учет результатов РИФ

Связывание поликлональных IgM, IgG антител сыворотки крови пациентов в процессе иммунизации на клетках исследуемых линий оценивали с помощью проточного цитофлюориметра FACSCalibur (Becton Dickinson, США) по интенсивности флуоресценции при окраске F(ab)²-goat anti-human IgM RPE коньюгированными антителами на канале FL2 и при окраске F(ab)²-goat anti-human IgG FITC коньюгированными антителами на канале FL1 при количестве клеток в гейте не менее 5 000.

2.3.Схемы экспериментов

2.3.1 Титрование поверхностных антител на МПК больного хроническим лимфолейкозом

1-неокрашенные клетки (50 мкл)

2-кл (50 мкл) + goat anti-human IgG (1:100) (20мкл)

3-кл (50мкл) + goat anti-human IgG (1:200) (20мкл)

4-кл (50мкл) + goat anti-human IgG (1:250) (20мкл)

5-кл (50мкл) + goat anti-human IgG (1:300) (20мкл)

6-кл (50мкл) + goat anti-human IgG (1:400) (20мкл)

7-кл (50мкл) + goat anti-human IgМ (1:5) (20мкл)

8-кл (50 мкл) + goat anti-human IgM (1:10) (20 мкл)

9-кл (50мкл) + goat anti-human IgM (1:20) (20 мкл)

10-кл (50мкл) + goat anti-human IgM (1:25) (20 мкл)

2.3.2.Схема стандартного протокола эксперимента для каждой из линий клеток (melIbr, melP, melKor)

1-неокрашенные клетки (50 мкл)

2-кл (50 мкл) + goat anti-human IgG (1:200) (20мкл)

3-кл (50мкл) +сыворотка (1:2)(20мкл) + goat anti-human IgG (1:200) (20мкл)

4-кл (50мкл) +сыворотка (1:10)(20мкл) +goat anti-human IgG (1:200) (20мкл)

5-кл (50мкл) + goat anti-human IgМ (1:10) (20мкл)

6-кл (50 мкл) + сыворотка(1:2)(20 мкл) +goat anti-human IgM (1:10) (20 мкл)

7-кл (50мкл) + сыворотка (1:10) + goat anti-human IgM (1:10) (20 мкл)

2.3.4. Статистическая обработка данных

Описание массива исходных данных по связыванию IgM-, IgG- антител сыворотки крови обследуемых в разведении 1:2, 1:10 для каждой из линий клеток до введения вакцины, после 4, 9, 14 введений проведено с использованием стандартного набора параметров описательной статистики пакета анализа данных Microsoft Excel 2003. Для каждого выше описанного массива данных было построено нормальное распределение Стьюдента при использовании программы Statistica 6.0

Изменение показателей по отношению к исходному уровню (?Х) рассчитывали по формуле

?Х=(Х_{имеющееся}-Х_{исходное})/ Х_{исходное}*100%,

где Х_{исходное} - значение показателя до иммунизации

Х_{имеющееся}- значение в процессе иммунизации.

Сравнение средних генеральных совокупностей опытных значений до введения вакцины и в ходе иммунизации проводили с помощью непараметрического парного рангового критерия Уилкоксона, где вычислялись Z-статистика и Р₀ –вероятность нулевой гипотезы (Н₀ нет различий).

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Исследуемые показатели:

1. связывание поликлональных IgM антител сыворотки крови иммунизированных больных на клетках меланомы линии melIbr (НLA+/+) до иммунизации, после 4, 9, 14 введений вакцины;

2. связывание поликлональных IgM антител сыворотки крови иммунизированных больных на клетках меланомы линии melP(НLA+/-) до иммунизации, после 4, 9, 14 введений вакцины;

3. связывание поликлональных IgM антител сыворотки крови иммунизированных больных на клетках меланомы линии melKor(НLA-/-) до иммунизации, после 4, 9, 14 введений вакцины;

4. связывание поликлональных IgG антител сыворотки крови иммунизированных больных на клетках меланомы линии melIbr (НLA+/+) до иммунизации, после 4, 9, 14 введений вакцины;

5. связывание поликлональных IgG антител сыворотки крови иммунизированных больных на клетках меланомы линии melP(НLA+/-) до иммунизации, после 4, 9, 14 введений вакцины;

6. связывание поликлональных IgG антител сыворотки крови иммунизированных больных на клетках меланомы линии melKor(НLA-/-) до иммунизации, после 4, 9, 14 введений вакцины.

3.1. Динамика иммунного ответа

Динамика связывания поликлональных IgM, IgG антител при разведении сыворотки крови больных 1:2 и 1:10 во всех случаях носила сходный характер. Изменение средних связывания IgM, IgG антител (количество повторов n=5) при разведении сыворотки 1:2 и 1:10 на каждой из исследуемых линий клеток в зависимости от продолжительности вакцинотерапии показано на диаграммах 1-23, гистограммах 1-23 (приложения-2.2.).

3.1.1. Поликлональный IgM ответ

Динамика связывания IgM антител на клетках линии mel Ibr (HLA+/+)

Пик иммунного ответа выявлен у 3 из 12 (25%) пациентов:

• через 2 месяца после начала иммунизации (после 3-5 введений вакцины) — у 2 пациентов с продолжительностью вакцинотерапии от 5 до 8 мес. (12-17 введений),

• через 7 месяцев после начала иммунизации (после 18 введения вакцины) — у 1 пациента с продолжительностью вакцинотерапии 10 мес (21-25 введений).

У 9 из 12 (75%) пациентов с различной продолжительностью иммунизации максимальное изменение связывания IgM антител по отношению к исходному уровню выявлено в момент последнего забора сыворотки.

Динамика связывания IgM антител на клетках линии mel Р (HLA+/-)

У 3 из 12 (25%) пациентов пик иммунного ответа выявлен:

• через 7 месяцев после начала иммунизации (после 18 введения вакцины) – у 2 с продолжительностью вакцинотерапии 10 мес. (21-25 введений),

• через 2 месяца после начала иммунизации (после 3-5 введений вакцины) — у 1 с продолжительностью вакцинотерапии от 5 до 8 мес. (12-17 введений) и у 1 с продолжительностью вакцинотерапии 5 мес. (8-9 введений).

У 9 из 12 (75%) с различной продолжительностью иммунизации максимальное изменение связывания IgM антител по отношению к исходному уровню выявлено в момент последнего забора сыворотки.

Динамика связывания IgM антител на клетках линии mel Kor (HLA+/-)

У 12 (100%) пациентов максимальное изменение связывания IgM антител по отношению к исходному уровню выявлено в момент последнего забора сыворотки.

3.1.2. Поликлональный IgG ответ

Динамика связывания IgG антител на клетках линии mel Ibr (HLA+/+)

У 12 (100%) пациентов максимальное изменение связывания IgM антител по отношению к исходному уровню выявлено в момент последнего забора сыворотки.

Динамика связывания IgG антител на клетках линии mel Р (HLA+/-)

У 1 из 12 (8,3%) пациентов 1 с продолжительностью вакцинотерапии от 5 до 8 мес. (12-17 введений) пик иммунного ответа выявлен через 2 месяца после начала иммунизации (после 3-5 введений вакцины).

У 11 из 12 (91,7%) пациентов с различной продолжительностью иммунизации максимальное изменение связывания IgG антител по отношению к исходному уровню выявлено в момент последнего забора сыворотки.

Динамика связывания IgG антител на клетках линии mel Kor (HLA+/-)

У 1 из 12 (8,3%) пациентов 1 с продолжительностью вакцинотерапии 10 мес. (21-25 введений) пик иммунного ответа выявлен через 9 месяцев после начала иммунизации (после 20 введения вакцины). У 11 из 12 (91,7%) пациентов с различной продолжительностью иммунизации максимальное изменение связывания IgG антител по отношению к исходному уровню выявлено в момент последнего забора сыворотки.

Показано: динамика связывания IgM, IgG антител различна на клетках линий mel Kor (HLA-/-), melP(HLA+/-), mel Ibr(HLA+/+) и в группах с различной продолжительностью вакцинотерапии.

3.2 Характер изменения показателей

Статистическое описание общего массива данных по связыванию IgM, IgG антител на клетках исследуемых линий при двух разведениях сыворотки приведено в приложении таблицы 1-4, диаграммы 1-12.

3.2.1. Сравнение средних общего массива данных

Сравнение средних общего массива данных до иммунизации и после 4, 9, 14 введений вакцины

Результаты оценки связывания IgM, IgG антител на клетках линии melIbr (НLA+/+), melP(НLA+/-), melKor(НLA-/-) до введения, после 4, 9, 14 введений вакцины представлены в таблице 5 (приложения-2.1).

Среднее связывания IgM антител

• на клетках линии mel Ibr (НLA+/+)до введения вакцины 23.0%±3 (от 8% до 47%), после 9 введений вакцины 25%±2.4 (от 8% до 65,7%), после 14 введений 32%±5.1 (от 10% до 68,7%),

• на клетках линии melР (НLA+/-) до введения вакцины 19%±4.3 (от 9% до 43%), после 9 введений вакцины 21%±3.9 (от 13% до 50%), после 14 введений 27%±3.3 (от 15% до 46%),

• на клетках линии melKor (НLA-/-) до введения вакцины 26%±3.7 (от 6% до 47%), после 9 введений вакцины 23%±8.5 (от 8% до 33%), после 14 введений 23%±6.4 (от 9% до 32%).

Среднее связывания IgG антител

• на клетках линии mel Ibr (НLA+/+) до введения вакцины 11.5%±1.7 (от 1% до 12%), после 9 введений вакцины 5%±4.0 (от 0.6% до 24%), после 14 введений 4.3%±0.3 (от 1.3% до 7%),

• на клетках линии melР (НLA+/-) до введения вакцины 4.1%±0.9 (от 1% до 9%), после 9 введений вакцины 3.7%±1.3 (от 0.5% до 10%), после 14 введений 3.9%±1.0 (от 1% до 8%),

• на клетках линии melKor (НLA-/-) до введения вакцины 4.5%±0.7 (от 1% до 12%), после 9 введений вакцины 5.3%±2.0 (от 0.6% до 25%), после 14 введений 4.3%±0.3 (от 1.3% до 7%).

В ходе статистического анализа с применением парного критерия Уилкоксона показано, отличия при сравнении средних генеральных совокупностей общего массива данных до введения и после 4 введений, до введения и после 9 введений, до введения и после 14 введений при n=12 незначимы (P>0,05).

Сравнение средних общего массива данных до иммунизации и на пике иммунного ответа

Результаты оценки связывания IgM, IgG антител на клетках линии melIbr, melP, melKor в исследуемых группах до введения и на пике иммунного ответа представлены в таблице 6. (приложения-2.1).

Среднее связывания IgM антител

• на клетках линии mel Ibr (НLA+/+) до введения вакцины 23.0%±3 (от 8% до 47%), на пике иммунного ответа 21,2%± 5 (от 6,7% до 68,7%),

• на клетках линии melР (НLA+/-) до введения вакцины 19,0%±4,3 (от 9% до 43%), на пике иммунного ответа 24,5%±4,8 (от 6% до 56,7 %),

• на клетках melKor (НLA-/-) до введения вакцины 26%±3,7 (от 6% до 47%), на пике иммунного ответа 22,5%±3,8 (от 2,8% до 41,5%).

При сравнении средних общего массива опытных значений до введения и на пике иммунного ответа при n=12 отличия незначимы (P>0,05).

Среднее связывания IgG антител

• на клетках линии melIbr (НLA+/+) до введения вакцины 11.5%±1.7 (от 1% до 12%), на пике иммунного ответа 4.79%± 0.8 (от 1.5% до 9.8%), на клетках линии melР (НLA+/-) до введения вакцины 4.1%±0.9 (от 1% до 9%), на пике иммунного ответа 3.2%±0.9 (от 0.5% до 9.8%), на клетках melKor (НLA-/-) до введения вакцины 4.5%±0.7 (от 1 % до 12%), на пике иммунного ответа 5.7%±1.8 (от 0.8% до 24%).

При сравнении средних общего массива данных до введения и на пике иммунного ответа при n=12 отличия незначимы (P>0,05).

3.2.2. Сравнение средних связывания IgM, IgG антител у каждого из 12 обследуемых больных

Для выявления статистически значимых тенденций изменения исследуемых показателей проводили сравнение средних связывания IgM, IgG антител при разведении сыворотки 1:10 до иммунизации и на пике иммунного ответа у каждого из 12 обследуемых больных.

Поликлональный IgM ответ

Оценка связывания IgM антител на клетках линии mel Ibr (НLA+/+)

(Таблица 7. Приложения-2.2)

Увеличение связывания IgM антител на клетках линии melIbr (НLA+/+) по отношению к исходному уровню выявлено у 4 из 12 (33,3%), пациенты с различной продолжительностью иммунотерапии:

• 1 пациент из 3 пациентов группы с продолжительностью иммунотерапии более 10 мес. (21-32 введений вакцины),

• 2 пациента из 6 пациентов группы с продолжительностью иммунотерапии от 5 до 8 мес. (12-17 введений вакцины),

• 1 пациент из 3 пациентов группы с продолжительностью иммунотерапии не более 4 мес. (5-8 введений вакцины).

Уменьшение связывания IgM антител на клетках линии melIbr (НLA+/+) по отношению к исходному уровню выявлено у 5 из 12 (41,6%), пациенты с различной продолжительностью иммунотерапии:

• 1 пациент из 3 пациентов группы с продолжительностью иммунотерапии более 10 мес. (21-32 введений вакцины),

• 4 пациента из 6 пациентов группы с продолжительностью иммунотерапии от 5 до 8 мес. (12-17 введений вакцины).

Данный показатель достоверно не изменялся по отношению к исходному уровню у 3 пациентов из 12 (25%):

• 2 пациента из 6 пациентов группы с продолжительностью иммунотерапии от 5 до 8 мес. (12-17 введений вакцины),

• 1 пациент из 3 пациентов группы с продолжительностью иммунотерапии не более 4 мес. (5-8 введений вакцины).

Оценка связывания IgM антител на клетках линии melР (НLA+/-)

(Таблица 8. Приложения-2.2)

Увеличение связывания IgM антител на клетках линии melР (НLA+/-) по отношению к исходному уровню выявлено у 6 из 12 (50%), пациенты с различной продолжительностью иммунотерапии:

• 2 пациента из 3 пациентов группы с продолжительностью иммунотерапии более 10 мес. (21-32 введений вакцины),

• 3 пациента из 6 пациентов группы с продолжительностью иммунотерапии от 5 до 8 мес. (12-17 введений вакцины),

• 1 пациент из 3 пациентов группы с продолжительностью иммунотерапии не более 4 мес. (5-8 введений вакцины).

Уменьшение связывания IgM антител на клетках линии melР (НLA+/-) по отношению к исходному уровню выявлено у 3 из 12 (25%), пациенты с различной продолжительностью иммунотерапии:

• 1 пациент из 3 пациентов группы с продолжительностью иммунотерапии более 10 мес. (21-32 введений вакцины),

• 1 пациент из 6 пациентов группы с продолжительностью иммунотерапии от 5 до 8 мес. (12-17 введений вакцины),

• 1 пациент из 3 пациентов группы с продолжительностью иммунотерапии не более 4 мес. (5-8 введений вакцины).

Данный показатель достоверно не изменялся по отношению к исходному уровню у 3 пациентов из 12 (25%):

• 2 пациента из 6 пациентов группы с продолжительностью иммунотерапии от 5 до 8 мес. (12-17 введений вакцины),

• 1 пациент из 3 пациентов группы с продолжительностью иммунотерапии не более 4 мес. (5-8 введений вакцины).

Оценка связывания IgM антител на клетках линии melKor (НLA-/-)

(Таблица 9. Приложения 2.2)

Увеличение связывания IgM антител на клетках линии melКоr (НLA-/-) по отношению к исходному уровню выявлено у 4 из 12 (33%) пациентов:

• 1 пациент из 3 пациентов группы с продолжительностью иммунотерапии более 10 мес. (21-32 введений вакцины),

• 3 пациента из 3 пациентов группы с продолжительностью иммунотерапии не более 4 мес. (5-8 введений вакцины).

Уменьшение связывания IgM антител на клетках линии melКоr (НLA-/-) по отношению к исходному уровню выявлено у 5 из 12 (41,6%) пациентов с продолжительностью иммунотерапии от 5 до 8 месяцев (12-17 введений вакцины) (5 из 6 пациентов группы по продолжительности вакцинотерапии).

Данный показатель достоверно не изменялся по отношению к исходному уровню у 3 из 12 (25%):

• 2 пациента из 3 пациентов группы с продолжительностью иммунотерапии более 10 мес. (21-32 введений вакцины),

• 1 пациент из 6 пациентов группы с продолжительностью иммунотерапии от 5 до 8 месяцев (12-17 введений вакцины).

Поликлональный IgG ответ.

Оценка связывания IgG антител на клетках линии mel Ibr (НLA+/+) (Таблица 10. Приложения 2.2)

Увеличение связывания IgG антител на клетках линии melIbr (НLA+/+) по отношению к исходному уровню выявлено у 3 из 12 (25%), пациенты с различной продолжительностью иммунотерапии:

• 1 пациент из 3 пациентов группы с продолжительностью иммунотерапии более 10 мес. (21-32 введений вакцины),

• 1 пациент из 6 пациентов группы с продолжительностью иммунотерапии от 5 до 8 мес. (12-17 введений вакцины),

• 1 пациент из 3 пациентов группы с продолжительностью иммунотерапии не более 4 мес. (5-8 введений вакцины).

Уменьшение связывания IgG антител на клетках линии melIbr (НLA+/+) по отношению к исходному уровню выявлено у 4 из 12 (33,3 %), пациенты с различной продолжительностью иммунотерапии:

• 3 пациента из 6 пациентов группы с продолжительностью иммунотерапии от 5 до 8 мес. (12-17 введений вакцины),

• 1 пациент из 3 пациентов группы с продолжительностью иммунотерапии не более 4 мес. (5-8 введений вакцины).

Данный показатель достоверно не изменялся по отношению к исходному уровню у 5 пациентов из 12 (41,6%), пациенты с различной продолжительностью иммунотерапии:

• 2 пациента из 3 пациентов группы с продолжительностью иммунотерапии более 10 мес. (21-32 введений вакцины),

• 2 пациента из 6 пациентов группы с продолжительностью иммунотерапии от 5 до 8 мес. (12-17 введений вакцины),

• 1 пациент из 3 пациентов группы с продолжительностью иммунотерапии не более 4 мес. (5-8 введений вакцины).

Оценка связывания IgG антител на клетках линии melР (НLA+/-)

(Таблица 11. Приложения 2.2)

Достоверное увеличение связывания IgG антител на клетках линии melР (НLA+/-) по отношению к исходному уровню не выявлено.

Уменьшение связывания IgG антител на клетках линии melР (НLA+/-) по отношению к исходному уровню выявлено у 1 из 12 (8,3%) обследуемых, из группы с продолжительностью вакцинотерапии от 5 до 8 мес.(12-17введений вакцины).

Данный показатель достоверно не изменялся по отношению к исходному уровню у 11 из 12 (91,6 %), пациенты с различной продолжительностью вакцинотерапии.

Оценка связывания IgG антител на клетках линии melKor (НLA-/-)

(Таблица 12. Приложения 2.2)

Увеличение связывания IgG антител на клетках линии melКоr (НLA-/-) по отношению к исходному уровню выявлено у 3 из 12 (25%), пациенты с различной продолжительностью вакцинотерапии:

• 1 пациент из 3 пациентов группы с продолжительностью иммунотерапии более 10 мес. (21-32 введений вакцины),

• 2 пациента из 6 пациентов группы с продолжительностью иммунотерапии от 5 до 8 мес. (12-17 введений вакцины).

Достоверное уменьшение связывания IgG антител на клетках линии melКоr (НLA-/-) по отношению к исходному уровню не выявлено.

Данный показатель не изменялся по отношению к исходному уровню у 9 из 12 (75%), пациенты с различной продолжительностью вакцинотерапии:

• 2 пациента из 3 пациентов группы с продолжительностью иммунотерапии более 10 мес. (21-32 введений вакцины),

• 4 пациента из 6 пациентов группы с продолжительностью иммунотерапии от 5 до 8 мес. (12-17 введений вакцины),

• 3 пациента из 3 пациентов группы с продолжительностью иммунотерапии не более 4 мес. (5-8 введений вакцины).

3.3 Индивидуальная оценка полученных результатов

А- Пациенты с продолжительностью иммунизации более 10 месяцев (от 21 до 32 введений).

У 1 из 3 пациентов данной группы с максимальной продолжительностью вакцинотерапии (15 месяцев, 32 введения вакцины) выявлено статистически достоверное увеличение связывания IgM антител (p<0,05) на клетках меланомы, экспрессирующих МНС 1,2 класса, максимальное и в 2 раза превышающее среднее значение в массиве данных на пике иммунного ответа, при отсутствии достоверных изменений связывания IgG антител на клетках трех исследуемых линий.

На диаграмме 1 показано увеличение процента связывания IgM антител сыворотки крови иммунизированного больного "2802" начиная с 3 введения вакцины (через две недели после первого введения) на клетках melIbr (HLA+/+). Пик иммунного ответа выявляется перед 15 введением вакцины (через 7 месяцев иммунотерапии): специфическое связывание IgM антител при разведении сыворотки крови 1:2 увеличилось на 987% или в 10 раз от исходного (?Х=987%) (исходный 6,1%±1,2, на пике 55,6%±4,1), при разведении сыворотки 1:10 в 6 раз ?Х=501% (исходный 11,4%±0,4, на пике 68,7%±0,9). (диаграмма 1, гистограмма 1, Приложения-2.2)

На диаграмме 2 показано увеличение связывания IgM антител сыворотки больного на клетках линии melP(HLA+/-). Пик иммунного ответа зарегистирован перед 15 введением вакцины (через 7 месяцев после первого введения): выявлено увеличение процента связывания IgM антител в 4,5 раза при разведении сыворотки крови 1:2 ?Х=358% (исходный 10,1%±1,7; на пике 46,3%±2,0) и при разведении сыворотки крови 1: 10 на 284% (исходный 11,8%±2,3; на пике 45,4%±1,8). (диаграмма 2, гистограмма 2, Приложения-2.2)

На клетках линии melKor (HLA-/-) изменение связывания IgM антител у данного пациента не было выявлено. (диаграмма 3, гистограмма 3, Приложения-2.2)

У 1 из 3 пациентов в группе с продолжительностью иммунизации более 10 мес. (21-32 введений) выявлена статистически достоверная тенденция к увеличению связывания IgМ антител на клетках melР(HLA+/-) и IgG антител на клетках трех исследуемых линий. Статистически достоверное изменение связывания IgM антител на клетках линии melIbr(HLA+/+), melКоr(HLA-/-) не выявлено.

Выявлено на клетках линии melIbr(HLA+/+) увеличение процента связывания IgG антител при разведении сыворотки крови 1:2 перед 14 введением (через 6,5 мес. иммунизации) ?Х=18,3% (исходный 3,8%±0,3, на пике 4,0%±1,2), при разведении сыворотки крови 1:10 перед 9 введением (4 мес. иммунизации) ?Х=70,5% (исходный 1,9%±0,8; перед 9 введением 4,5%±0,2), перед 14 введением (через 6,5 мес. иммунизации) ?Х=127,3% (исходный 1,9%±0,8; перед 14 введением 6,0%±1,3) и перед 18 введением (через 9 месяцев иммунизации) ?Х=243,2% (исходный 1,9%±0,8; перед 18 введением 9,8%±2,2). Диаграмма 4. Гистограмма 4. (Приложения 2.2)

На клетках линии melP(HLA+/-) выявлено последовательное увеличение связывания IgM антител, сопровождавшееся увеличением процента связывания IgG антител. Максимальное увеличение по отношению к исходному уровню выявлено перед 14 введением вакцины (через 7 месяцев иммунизации): при разведении сыворотки крови 1:2 ?Х=7,9% (исходный 18,2%±0,5; на пике 19,8%±3,7); при разведении сыворотки крови 1:10 ?Х=83% (исходный 11,1%±1,4; на пике 20,2%±1,9). Максимальное увеличение связывания IgG антител выявлено перед 18 введением (через 9 месяцев иммунизации) ?Х= 114,8% при разведении сыворотки крови 1:10 (исходный 8,9%±1,1; перед 18 введением 18,2%±1,6). (Диаграмма 5. Гистограмма 5.Приложения 2.2)

Выявлено на клетках линии melКоr(HLA-/-) увеличение связывания IgG антител достигало максимума перед 14 введением (через 7 месяцев иммунизации): при разведении сыворотки крови 1:2 ?Х=528,6% (исходный 0,8±0,4; на пике 5,8%±1,3); при разведении сыворотки крови 1:10 ?Х=240% (исходный 2,4%±1,1; на пике 7,4%±2,0) (Диаграмма 6. Гистограмма 6. Приложения- 2.2)

В-пациенты с продолжительностью иммунизации от 5 до 8 мес. 6— из 12 пациентов

У 5 из 6 (83%) пациентов данной группы выявлена статистически достоверная тенденция к уменьшению связывания IgM антител на клетках melKor(HLA-/-) (p<0,06) при отсутствии достоверного изменения связывания IgG антител на клетках трех исследуемых линий.

У 2 из 6 (33%) пациентов уменьшение связывания IgM антител на клетках melKor(HLA-/-) сопровождалось статистически достоверной тенденцией к увеличению связывания IgM антител на клетках melIbr(HLA+/+), melP(HLA+/-). (Диаграмма 7-12. Гистограмма 7-12. Приложения 2.2). У 2 из 6 (33,3%) пациентов уменьшение связывания IgM антител на клетках melKor(HLA-/-) сопровождалось достоверной тенденцией к уменьшению связывания IgM антител на клетках melIbr(HLA+/+), melP(HLA+/-) (Диаграмма 16-18. Гистограмма 16-18. Приложения 2.2), у 1 из 6— достоверной тенденцией к увеличению связывания IgM антител на клетках melIbr(HLA+/+) при отсутствии достоверных изменений связывания на клетках melP(HLA+/-). (Диаграмма 13-15. Гистограмма 13-15. Приложения 2.2)

У 1 из 2 пациентов с поликлональным IgM ответом на клетках линий melIbr(HLA+/+), melP(HLA+/-) увеличение связывания IgM антител выявлено после статистически незначимого уменьшения в ходе первых двух месяцев вакцинации ("отсроченный" поликлональный IgM ответ).

На клетках линии melIbr(HLA+/+) выявлено увеличение связывания IgM антител перед 8 введением вакцины (3 мес. иммунизации): при разведении сыворотки 1:2 ?Х=20,4% (исходный 12,3%±0,7; на пике 14,9%±1,0) при разведении сыворотки крови 1:10 ?Х=20% (исходный 5,4%±0,7; на пике 9,6%±1,0). При сравнении средних до иммунизации и перед 6 введением вакцины (1,5 мес. иммунизации) связывание IgM антител на клетках линии melIbr(HLA+/+) достоверно не изменялось. (Диаграмма 10.Гистограмма 10. Приложения 2.2)

На клетках линии melP(HLA+/-) выявлено перед 6 введением вакцины (1,5 мес. иммунизации) статистически незначимое уменьшение связывания IgM антител (р=1,03, двусторонее) при разведении сыворотки крови 1:2 ?Х= -40% (исходный 25,2%±4,1; на пике 17,9%±1,9), при разведении сыворотки крови 1:10 ?Х= -2,4% (исходный 14,5%±1,5; на пике 12,9%±1,8); перед 8 введением вакцины (3 мес. иммунизации) выявлено увеличение связывания IgM антител при разведении сыворотки крови 1:10 ?Х=69% (исходный 14,5%±1,4; на пике 24,6%±1,8), при разведении сыворотки 1:2—образец не проставлен. (Диаграмма 11.Гистограмма 11. Приложения 2.2)

У данного пациента (1 из 12) выявлена статистически достоверная тенденция к увеличению связывания IgG антител на клетках линии melIbr(HLA+/+): перед 8 введением (4 месяца иммунизации) при разведении сыворотки 1:2 ?Х= 42% (исходный 3,0%±0,7; перед 6 введением 5,6%±1,2), при разведении сыворотки крови 1:10 ?Х=45% (исходный 3,5%±1,8; перед 6 введением 6,3%±2,4). (Диаграмма 10.Гистограмма 10. Приложения 2.2).

С-группа с продолжительностью иммунизации не более 4 месяцев (8 ввведений).—3 из12 пациентов

У 3 пациентов данной группы выявлена статистически достоверная тенденция к увеличению связывания IgM антител на клетках линии melКоr(HLA-/-).

У 1 из 3 пациентов данной группы увеличение связывания IgM антител на клетках линии melКоr(HLA-/-) сопровождалось статистически значимым уменьшением связывания IgM антител на клетках линии melIbr(HLA+/+), при отсутствии достоверных изменений на клетках линии melР(HLA+/-). Диаграмма 19-21Гистограмма.19-21

У 1 из 3 пациентов данной группы увеличение связывания IgM антител на клетках линии melКоr(HLA-/-) сопровождалось статистически значимым увеличением IgG антител на клетках линии melКоr(HLA-/-), при отсутствии достоверных изменений связывания IgM, IgG на клетках линии melIbr(HLA+/+)melР(HLA+/-). Диаграмма 22-23. Гистограмма 22-23.

Глава 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ. ВЫВОДЫ

Показано

1. Динамика связывания IgM, IgG антител сыворотки иммунизированных больных изменяется в зависимости от продолжительности вакцинотерапии, изотипа антител и типа линии клеток.

3. Сравнение средних общего массива данных до иммунизации и на пике иммунного ответа не информативно вследствие расхождения значений внутри каждой из групп.

4. Сравнение средних до иммунизации и на пике иммунного ответа у каждого из обследуемых при разведении сыворотки 1:10 позволяет проследить взаимосвязь продолжительности иммунизации с характером изменения исследуемых показателей.

Выявлено, при оценке связывания IgM антител в группах:

1- достоверное изменение (уменьшение и увеличение) связывания IgM антител на клетках линии melIbr (НLA+/+) melР(НLA+/-)не зависело от продолжительности иммунизации;

2- достоверное увеличение связывания IgM антител на клетках линии melKor (НLA+/+)(Р<0,06 при n=3) у 3 из 12 (25%), 3 из 4 (70%) пациентов с продолжительностью вакцинотерапии до 4 месяцев (5-8 введений);

3- достоверное уменьшение связывания IgM антител клетках линии melKor (НLA-/-) (Р<0,02 при n=6) у 6 из 12 (50%), выявлено у 6 из 6 (100%) пациентов с продолжительностью вакцинотерапии от 5 до 8 месяцев (12-17 введений вакцины).

Выявлено, при оценке связывания IgG антител в группах:

1- достоверное изменение (уменьшение и увеличение) связывания IgG антител на клетках линии melIbr (НLA+/+), melР(НLA+/-), melКоr (НLA+/+) не зависело от продолжительности иммунизации.

Широкий разброс значений внутри групп позволяет сделать вывод, что реакция каждого обследуемого на введение вакцины была индивидуальной.

Выводы

1. Динамика IgM, IgG ответа на клетках линий (HLA-/-), (HLA+/-), (HLA+/+) свидетельствует о соотношении гуморальных факторов различной специфичности при иммунизации аллогенной вакциной.

3. Изменение связывания IgM, IgG на клетках линий mel Kor (HLA-/-), melP(HLA+/-), mel Ibr(HLA+/+) варьирует в широких пределах, что позволяет сделать вывод о необходимости разработки критериев индивидуальной оценки показателей при вакцинации.

4. Увеличение связывания IgM антител на клетках (HLA-/-), без изменения связывания на клетках линий (HLA+/+), (HLA+/-), в группе пациентов с продолжительностью наблюдения до 4 месяцев свидетельствует о присутствии в организме опухоленостеля иммуногенных опухоль-ассоциированных антигенов.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Данная экспериментальная модель позволила выявить и проследить изменение связывания IgM, IgG антител сыворотки крови больных на клетках меланомы, отличающихся экспрессией молекул ГКГ I/II класса при иммунизации аллогенной противоопухолевой вакциной. Сопоставление полученных результатов с данными иммунофенотипирования и клиническими данными позволит сделать вывод об иммунологической и клинической эффективности аллогенной противоопухолевой вакцины на основе клеток меланомы линии (HLA+/-), модифицированных геном tag7.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Adrian F Ochsenbein. Principles of tumor immunosurveillance and implications for immunotherapy// Gene therapy of Cancer. 2002(12), V- 9, no-12, P. 1043-105531

2. Albanopoulos K, Armakolas A, Konstadoulakis MM et al. Prognostic significance of circulating antibodies against carcinoembryonic antigen (anti-CEA) in patients with colon cancer. //Am J Gastroenterol 2000; 95: 1056–1061. .

3. Antia R, Levin B, Williamson P .A quantitative model suggests immune memory involves the colocalization of B and Th cells.//J Theor Biol 1991 Dec 7;153(3):371-84

4. Bono J. S, Rha S. Y., Stephenson J., Schultes B. C., Monroe P., Eckhardt G. S., Hammond L. A., Whiteside T. L., Nicodemus C. F., Cermak J. M., Rowinsky E. K.and A. W. Tolcher. Phase I trial of a murine antibody to MUC1 in patients with metastatic cancer: evidence for the activation of humoral and cellular antitumor immunity. // Annals of Oncology 2004 15(12):1825-1833

5. Banchereau J, Steinman RM. Dendritic cells and the control of immunity. //Nature 1998; 392: 245–252.

6. Belardelli F, Ferrantini M. Cytokines as a link between innate and adaptive antitumor immunity. //Trends Immunol 2002; 23: 201–208.

7. Canevari S, Pupa SM, Menard S 1975-1995 revised anti-cancer serological response: biological significance and clinical implications. //Ann Oncol 1996 Mar;7(3):227-32

8. Carter P. Improving the efficacy of antibody-based cancer therapies.// Nat Rev Cancer- 2001; 1: 118-129.

9. Chen Y-T,. G?re A O, Tsang S, Stockert E, J?ger E, Knuth A, and L J. Old. Identification of multiple cancer/testis antigens by allogeneic antibody screening of a melanoma cell line library (human cancer immunology / serological analysis of recombinant cDNA expression libraries).// Immunology, April 7, 1998 Vol. 95, Issue 12, 6919-6923

10. Cui J.-w.,. Li W.-h, Wang J., Li A.-l., Li H.-y.,. Wang H.-x, He K., Li W., Kang L.-h., Yu M., Shen B.-f., Wang G.-J., and Zhang X.-m.Proteomics-based Identification of Human Acute Leukemia Antigens That Induce Humoral Immune Response.// Mol. Cell. Proteomics, November 1, 2005; 4(11): 1718 - 1724.

11. Denkers E Y. and Gazzinelli R T.. Regulation and Function of T-Cell-Mediated Immunity during Toxoplasma gondii Infection.//Clin Microbiol Rev. 1998 October; 11(4): 569–588.

12. Disis ML, Calenoff E, McLaughllun G, et al. Existent T-cell and antibody immunity to HER-2/neu protein in patients with breast cancer. //Cancer Res. 1994;54:16–20.

13. Disis ML, Pupa SM, Gralow JR, et al. High-titer HER-2/neu protein-specific antibody can be detected in patients with early-stage breast cancer. //J Clin Oncol. 1997;15:3363–3367.

14. Dredge K, Marriott JB, Todryk SM et al. Adjuvants and the promotion of Th1-type cytokines in tumour immunotherapy. Cancer Immunol Immunother 2002; 51: 521–531.

15. Finkelman F D, Holmes J, Katona I M, Urban J F, Beckmann M P, Park L S, Shooley K A, Coffman R L, Mosmann T R, Paul W E. Lymphokine control of in vivo immunoglobulin isotype selection.// Annu Rev Immunol. 1990;8:303–333.

16. Foshag LJ, Morton DL, Nizze JA, Chawla SP: Response to chemotherapy in melanoma patients after active specific immunotherapy (ASI) with melanoma cell vaccine.// Proc Annu Meet Am Soc Clin Oncol 1993;12:A1355..

17. Habal N. et al. CancerVax, An Allogeneic Tumor Cell Vaccine, Induces Specific Humoral and Cellular Immune Responses in Advanced Colon Cancer.//Ann Surg Oncol, Vol. 8, No. 5, 2001

18. Hintzen RQ, de JR, Lens SM, van LR. CD27: marker and mediator of T-cell activation. //Immunol Today 1994; 15: 307-311.

19. Huskinson J, Stepick-Biek P N, Araujo F G, Thulliez P, Suzuki Y, Remington J S. Toxoplasma antigens recognized by immunoglobulin G subclasses during acute and chronic infection.// J Clin Microbiol. 1989;27:2031–2038

20. Jager E, Chen YT, Drijfhout JW, et al. Simultaneous humoral and cellular immune response against cancer-testis antigen NY-ESO-1: definition of human histocompatibility leukocyte antigen (HLA)-A2-binding peptide epitopes. //J Exp Med. 1998;187:265–270. doi: 10.1084/jem.187.2.265.

21. J?ger E, Nagata Y, Gnjatic S, Wada H, Stockert E, Karbach J, Dunbar P. R, , Ritter G. and A Knuth. Monitoring CD8 T cell responses to NY-ESO-1: Correlation of humoral and cellular immune responses// PNAS Immunology April 25, 2000, vol. -97, no.- 9,p 4760-4765

22. Jager E, Stockert E, Zidianakis Z, Chen YT, Karbach J, Jager D, Arand M, Ritter G, Old LJ, Knuth A. Humoral immune responses of cancer patients against "Cancer-Testis" antigen NY-ESO-1: correlation with clinical events.// Int J Cancer. 1999 Oct 22;84(5):506-10.

23. Jager E., Karbach J., Gnjatic S., Neumann A., Bender A., Valmori D., Ayyoub M., Ritter E., Ritter G., Jager D., Panicali D., Hoffman E. Recombinant vaccinia/fowlpox NY-ESO-1 vaccines induce both humoral and cellular NY-ESO-1-specific immune responses in cancer patients.// PNAS, September 26, 2006; 103(39): 14453 - 14458.

24. Jones PC, Sze LL, Liu PY, et al: Prolonged survival for melanoma patients with elevated IgM antibody to oncofetal antigen. //J Natl Cancer Inst 1981;66:249-254

25. Knight SC, Askonas BA, Macatonia SE. Dendritic cells as targets for cytotoxic T lymphocytes. //Adv Exp Med Biol 1997; 417: 389?-394

26. Knuth A, Wolfel T et al. Cellular and humoral immune responses against cancer: implications for cancer vaccines. //Curr Opin Immunol- 1991 Oct;3(5):659-64.

27. Liebowitz DN, Lee KP, June CH. Costimulatory approaches to adoptive immunotherapy. Curr Opin Oncol 1998; 10: 533-541

28. Machy P, Serre K, Leserman L. Class I-restricted presentation of exogenous antigen acquired by Fcgamma receptor-mediated endocytosis is regulated in dendritic cells.// Eur J Immunol 2000; 30: 848?857

29. Maio M., Coral S., Sigalotti L, Elisei R, Romei C, Rossi G, Cortini E, Colizzi F, Fenzi G, Altomonte M, Pinchera A and M Vitale. Analysis of Cancer-Testis Antigens in Sporadic Medullary Thyroid Carcinoma: Expression and Humoral Response to NY-ESO-1.// The Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism 2003. Vol. -88, No.- 2, p. 748-754

30. Mapara M. Y. and Sykes M. Tolerance and Cancer: Mechanisms of Tumor Evasion and Strategies for Breaking Tolerance. //J. Clin. Oncol., March 15, 2004; 22(6): 1136 - 1151.= ---3

31. Marshall JL, Hawkins MJ, Tsang KY, et al. Phase I study in cancer patients of a replication-defective avipox recombinant vaccine that expresses human carcinoembryonic antigen.// J Clin Oncol. 1999;17:332–337.

32. McAneny D, Ryan CA, Beazley RM, Kaufman HL. Results of a phase I trial of a recombinant vaccinia virus that expresses carcinoembryonic antigen in patients with advanced colorectal cancer.// Ann Surg Oncol . 1996;3:495–500.

33. Melero I, Shuford WW, Newby SA et al. Monoclonal antibodies against the 4-1BB T-cell activation molecule eradicate established tumors.// Nat Med 1997; 3: 682-685.

34. Mitchell DA, Nair SK, Gilboa E. Dendritic cell?macrophage precursors capture exogenous antigen for MHC class I presentation by dendritic cells//. Eur J Immunol 1998; 28: 1923-?1933.

35. Mitchell MS, Jakowatz J, Harel W, et al: Increased effectiveness of interferon alfa-2b following active specific immunotherapy for melanoma.// J Clin Oncol 1994;12:402-411.

36. Mitra R, Singh S. and A. Khar. Antitumour immune responses. [Expert Reviews in Molecular Medicine (2003), 5: 1-22] Published online by Cambridge University Press 13Feb2004

37. Mittelman A, Chen ZJ et al. Kinetics of the immune response and regression of metastatic lesions following development of humoral anti-high molecular weight-melanoma associated antigen immunity in three patients with advanced malignant melanoma immunized with mouse antiidiotypic monoclonal antibody MK2-23.// Cancer Res.-1994 Jan 15;54(2):415-21.

38. Mittelman A, Chen ZJ, Yang H, et al: Human high molecular weight melanoma-associated antigen (HMW-MAA) mimicry by mouse anti-idiotypic monoclonal antibody MK2-23: Induction of humoral anti-HMW-MAA immunity and prolongation of survival in patients with stage IV melanoma. //Proc Natl Acad Sci USA 1992;89:466-470.

39. Monji M., Nakatsura T., Senju S., Yoshitake Y., Sawatsubashi M., Shinohara M., Kageshita T., Ono T., Inokuchi A., and Y. Nishimura Identification of a Novel Human Cancer/Testis Antigen, KM-HN-1, Recognized by Cellular and Humoral Immune Responses.// Clin. Cancer Res., September 15, 2004; 10(18): 6047 - 6057.

40. Morton D L., Barth A. Vaccine Therapy for Malignant Melanoma//CA Cancer J Clin july/august 1996. Vol. -46, No.- 4, p. 225-244

41. Morton DL, Foshag LJ, Hoon DS, et al: Prolongation of survival in metastatic melanoma after active specific immunotherapy with a new polyvalent melanoma vaccine. //Ann Surg 1992;216

42. Mosolits S., Ullenhag G. and H. Mellstedt. Therapeutic vaccination in patients with gastrointestinal malignancies. A review of immunological and clinical results.// Annals of Oncology April 13, 2005 16(6):847-862.

43. Muchmore AV, Megson M, Decker JM, Knudsen P, Mann DL, Broder S. Inhibitory activity of antibodies to human Ia-like determinants: comparison of intact and pepsin-digested antibodies//. J Immunol 1983 Aug;131(2):725-30

44. Nakagawa K, Nogguchi Y, Uenaka A, Sato S, Okumuro H, Tanaka M. XAGE-1 expression in non : Small cell lung cancer and antibody response in patients //Clinical cancer research   ISSN 1078-0432  2005, vol. 11, no15, pp. 5496-5503

45. O'Carroll K S, Sotomayor E, Montgomery J, Borrello I, Hwang L, Fein S, Pardol D, Levitsky H. Induction of antigen-specific T cell anergy: An early event in the course of tumor progression// Immunology-1998. Feb3-V.-95, p. 1178-1183

46. Parajuli P et al. Cytolysis of human dendritic cells by autologous lymphokine-activated killer cells: participation of both T cells and NK cells in the killing. J Leukoc Biol 1999; 65: 764?770

47. Payette P J, Weeratna R D, McCluskie M J and H L Davis. Immune-mediated destruction of transfected myocytes following DNA vaccination occurs via multiple mechanisms.// Gene Therapy 2001(6), Vol- 8, no -18, P. 1395-1400.

48. Portoukalian J, Carrel S et al. Humoral immune response in disease-free advanced melanoma patients after vaccination with melanoma-associated gangliosides. EORTC Cooperative Melanoma Group.// Int J Cancer. 1991 Dec 2;49(6):893-9.

49. Puisieux I, Odin L, Poujol D, et al. Canarypox virus-mediated interleukin 12 gene transfer into a murine mammary adenocarcinoma induces tumor suppression and long-term antitumoral immunity.// Hum Gene Ther. 1998;9:2481–2492.

50. Purev E, Cai D, Miller E, Swoboda R, Mayer T, Klein-Szanto A, Marincola F M.. Immune Responses of Breast Cancer Patients to Mutated Epidermal Growth Factor Receptor (EGF-RvIII, EGF-R, and de2–7 EGF-R)// The Journal of Immunology, 2004, 173: 6472-6480.

51. Rosenberg SA, Zhai Y, Yang JC, et al. Immunizing patients with metastatic melanoma using recombinant adenoviruses encoding MART-1 or gp100 melanoma antigens. //J Natl Cancer Inst. 1998;90:1894–1900.

52. Sahin U, Tureci O, Chen YT, et al. Expression of multiple cancer/testis (CT) antigens in breast cancer and melanoma: basis for polyvalent CT vaccine strategies. //Int J Cancer. 1998;78:387–389.

53. Sahin U, Tureci O, Pfreundschuh M. Serological identification of human tumor antigens.//Curr Opin Immunol. 1997 Oct;9(5):709-16

54. Stockert E, E J?ger, Y-T Chen, MJ. Scanlan, I Gout, J Karbach, M Arand, A Knuth, and L J. Old. Survey of the Humoral Immune Response of Cancer Patients to a Panel of Human Tumor Antigens.// J. Exp. Med., Volume 187, Number 8, April 20, 1998 1349-1354

55. Takahashi T, Conforti A, Kikumoto Y, Hoon D. S.B., Morton D L. and R. F.Irie. Melanoma - IgM antibody - peptide antigen – prognosis.//The Lancet Oncology. February 2003 Vol- 4, Issue 2 , Pages 104-109

56. Theresa V Strong1 Gene therapy for carcinoma of the breast: Genetic immunotherapy.//Breast Cancer Res. 2000; 2(1): 15–21. Published online 1999 December 17. doi: 10.1186/bcr24.

57. Townsend SE, Allison JP. Tumor rejection after direct costimulation of CD8+ T cells by B7-transfected melanoma cells//. Science 1993; 259: 368-370

58. Ullenhag GJ, Frodin JE et al. Durable carcinoembryonic antigen (CEA)-specific humoral and cellular immune responses in colorectal carcinoma patients vaccinated with recombinant CEA and granulocyte-macrophage colony-stimulating factor. //Clin Cancer Res. 2004 May 15;10(10):3273-81.

59. Weinberg AD, Rivera MM, Prell R et al. Engagement of the OX-40 receptor in vivo enhances antitumor immunity.// J Immunol 2000; 164: 2160-2169.

60. Wong JH, Gupta RK, Morton DL. Demonstration of a well-characterized tumor-associated antigen on melanoma cell surface. //J Surg Oncol. 1988 Jul;38(3):147-50.

61. Yakirevich E., Sabo E., Lavie O., Mazareb S., Spagnoli G. C. and M. B. Resnick Expression of the MAGE-A4 and NY-ESO-1 Cancer-Testis Antigens in Serous Ovarian Neoplasms.// Clin. Cancer Res., December 15, 2003; 9(17): 6453 - 6460.

62. Ye Z., Hellstrom I., Hayden-Ledbetter M., Dahlin A., Ledbetter J. A., Hellstrom K. E.. Gene therapy for cancer using single-chain Fv fragments specific for 4–1BB.// Nat. Med. 2002. 8:343

63. Zhang J-Y, Casiano C A, Peng X-X, Koziol J A, Chan E K. L, Tan E M. Enhancement of antibody detection in cancer using panel of recombinant tumor-associated antigens.// Cancer epidemiology, biomarkers & prevention 2003, vol.12,no2,pp.136-143

64. Sashchenko L. P., Dukhanina E A., Yashin D V. ¶, Shatalov Y V., Romanova E A., Korobko E V. ¶, Demin A V. ¶,. Lukyanova T I, Kabanova O D., Khaidukov S V.|, Kiselev S L., Gabibov A G., Gnuchev N V.and G P. Georgiev . Peptidoglycan Recognition Protein Tag7 Forms a Cytotoxic Complex with Heat Shock Protein 70 in Solution and in Lymphocytes.//J. Biol. Chem. January 16, 2004, Vol. 279, Issue 3, 2117-2124.

65. Ferrone S: Human tumor-associated antigen mimicry by anti-idiotypic antibodies: Immunogenicity and clinical trials in patients with solid tumors. //Ann NY Acad Sci 1993;690:214-224.

66. Kuby J. 1997. Immunology. 3rd edn. Cell and Organs of the Immune System. New York: W.H. Freeman and Co. 47-83.

67. Brodsky F.M. 1991 The cell biology of antigen processing and presintation Ann. Rev.Immunol. 9:707-744.

68. Fearon DT, Carter RH. 1995. The CD19, CR2/TAPA-1 complex of B- lymphocytes: Linking natural to acquired immunity. Ann.Rev.Immunol.13:127-149.

69. Ravindranath et al., Cancer Res 1989; 49:3891-3897; Euhus et al., Cancer Immunol Immunother 1989; 29:247-254

ПРИЛОЖЕНИЯ

1.Описание использованных материалов

Таблица 1. Двусолевой фосфатный буферный раствор PBS 10x, pH(1x)=7.4

	1x	10x	Сток	100ml	500ml
KH2PO4	1.47mM	14.7mM	136.1g/M	0.2g	1.0g
Na2HPO4x12H2O	4.29mM	42.9mM	268.1g/M	1.15g	9g
NaCl	137mM	1.37M	58.44g/M	8.0g	40.0g
KCl	2.68mM	26.8mM	74.56g/M	0.2g	1.0g
H2O			mQ	90,45g	452,25g

Стерилизовали автоклавированием, раствор титровали после разбавления до pH 7.4.

Таблица 2. Буфер для антител.

	(w/v)	на 100 ml
BSA	0,1%	100 mg
NaN3 10%	0,1%	100 µl
Глицерин	5%	5 ml
PBS pH(1x)=7.4		95 ml

Таблица 3. Раствор формальдегида в РВS 1%

	на 50 ml
Формальдегид 30%	1,67ml
РВS pH(1x)=7.4	48 ml

Таблица 4. Питательная среда для ведения клеточных линий меланомы mel P, mel Kor, mel Ibr

		на 50ml
ТЭС инакт	10%(w/v)	5ml
Гентамицин 10mg/ml	0,1mg/ml	50µl
пируват натрия 11mg/ml	10mM	500µl
L-глутамин 146mg/5ml	2mM	500µl
RPMI 1640		44,05ml

Таблица 5. Сравнение средних общего массива данных до иммунизации и после 4, 9, 14 введений вакцины

	mel Ibr ( HLA+/+)	melP (HLA+/-)	melKor (HLA-/-)
Количество введений	0	9	14	0	9	14	0	9	14
IgM	Разброс (min,max)	8	47	8	66	10	68	9	43	13	50	15	46	6	47	8	33	9	32
Среднее ±ст.ошибка	23.0±3.3	25±2.4	32±5.1	19±10.3	21±3.9	27±3.3	26±3.7	23±8.5	23±6.4
IgG	Разброс (min,max)	1	12	0.6	24	1.3	7	1	9	0.5	10	1	8	1	12	0.6	25	1.3	7
Среднее ±ст.ошибка	11.5±1.7	5±4.0	4.3±0.3	4.1±0.9	3.7±1.3	3.9±1.0	4.5±0.7	5.3±2.0	4.3±0.3

Таблица 6. Сравнение средних общего массива данных до иммунизации и на пике иммунного ответа

	mel Ibr ( HLA+/+)	melP (HLA+/-)	melKor (HLA-/-)
Количество введений	0	max	0	max	0	max
IgM	Разброс (min,max)	8	47	6.8	68	9	43	6.2	57	6	47	2.8	42
Среднее ±ст.ошибка	23.0±3.1	21.2±6.7	19±4.3	24.51±6.1	26±3.7	22.47±5.3.
IgG	Разброс (min,max)	1	12	1.5	9.8	1	9	0.5	9.8	1	12	0.8	24.7
Среднее ±ст.ошибка	11.5±2.7	4.79±0.8	4.1±1.9	3.2±0.9	4.5±0.7	5.7±3.5

Таблица 7. Связывание IgМ антител на клетках mel Ibr (HLA+/+)

Группа	Х±m (initial)	Х±m (max)	Z- критерий	Принятая гипотеза	Р0-уровень	Продолжительность вакцинации (количество введений)
Увеличение показателя в ходе иммунизации	11,4±0,4	68,7±0,9	4,6	увеличение	<0>	Более 10 мес (21-32)
15,9±1,3	17,4±0,9	1,02	тенденция к увеличению тенденция к увеличению тенденция к увеличению	<0>	от 5 до 8 мес (12-17)
15,1±2,8	21,1±1,5	1,11	<0>	от 5 до 8 мес (12-17)
9,0±0,42	17,3±1,4	1,18	<0>	до 4 мес (5-8)
Уменьшение показателя в ходе иммунизации	27,9±3,4	22,1±2,5	0,9	тенденция к уменьшению	<0>	Более 10 мес (21-32)
47±2,1	26,9±0,7	1,34	тенденция к уменьшению	<0>	Более 10 мес (21-32)
20,6±0,8	14,9±2,9	1,08	тенденция к уменьшению	<0>	до 4 мес (5-8)
33,7±1,6	6,68±1,1	2,6	уменьшение	<0>	от 5 до 8 мес (12-17)
22,3±2,4	11,3±4,8	1,01	тенденция к уменьшению	<0>	от 5 до 8 мес (12-17)
Показатель достоверно не изменялся	8,04±0,6	9,7±1,8	0,09	нет различий	0,67	от 5 до 8 мес (12-17)
18,4±3,2	20,1±6,4	0,21	нет различий	0,92	от 5 до 8 мес (12-17)
47±2,7	42±1,8	0,18	нет различий	0,4	до 4 мес (5-8)

Таблица 8.Связывание IgМ антител на клетках mel Р (HLA+/-)

Группа	Х±m (initial)	Х±m (max)	Z- критерий	Принятая гипотеза	Р0-уровень	Продолжительность вакцинации (количество введений)
Увеличение показателя в ходе иммунизации	11,8±0,8	45,4±7,4	2,17	увеличение	<0>	Более 10 мес (21-32)
11,1±2,1	20,2±1,9	1,3	тенденция к увеличению	<0>	Более 10 мес (21-32)
14,5±1,3	24,6±3,3	1,22	тенденция к увеличению	<0>	от 5 до 8 мес (12-17)
9,7±0,9	14,9±0,4	1,09	тенденция к увеличению	<0>	от 5 до 8 мес (12-17)
28,5±1,4	37,4±2,4	1,1	тенденция к увеличению	<0>	от 5 до 8 мес (12-17)
43,8±1,2	56,7±1,7	1,4	тенденция к увеличению	<0>	до 4 мес (5-8)
Уменьшение показателя	16,9±2,0	14,8±0,9	1,04	тенденция к уменьшению	<0>	Более 10 мес (21-32)
14,8±1,1	6,2±0,15	1,6	тенденция к уменьшению	<0>	от 5 до 8 мес (12-17)
19,8±2,6	9,3±1,8	1,54	тенденция к уменьшению	<0>	до 4 мес (5-8)
Показатель достоверно не изменялся	22,±1,6	21,7±2,9	0,17	нет различий	0,7	от 5 до 8 мес (12-17)
18,4±3,2	20,1±6,4	0,02	нет различий	0,44	от 5 до 8 мес (12-17)
47±2,7	42±1,8	0,18	нет различий	0,2	до 4 мес (5-8)

Таблица 9. Связывание IgМ антител на клетках mel Коr (HLA-/-)

Группа	Х±m (initial)	Х±m (max)	Z- критерий	Принятая гипотеза	Р0-уровень	Продолжительность вакцинации (количество введений)
Увеличение показателя в ходе иммунизации	27,8±2,1	32,7±1,9	1,26	тенденция к увеличению	<0>	Более 10 мес (21-32)
24,2±4,6	27,6±0,4	1,02	тенденция к увеличению	<0>	до 4 мес (5-8)
32,1±1,7	38,3±2,8	1,12	тенденция к увеличению	<0>	до 4 мес (5-8)
15,8±0,8	31,6±1,9	1,41	тенденция к увеличению	<0>	до 4 мес (5-8)
Уменьшение показателя в ходе иммунизации	27,1±1,5	2,8±3,2	1,9	уменьшение	<0>	от 5 до 8 мес (12-17)
11,5±3,6	4,3±1,42	1,07	тенденция к уменьшению	<0>	от 5 до 8 мес (12-17)
36,9±4,7	16,7±1,9	1,38	тенденция к уменьшению	<0>	от 5 до 8 мес (12-17)
23,3±6,1	13,7±0,8	1,06	тенденция к уменьшению	<0>	от 5 до 8 мес (12-17)
31,2±1,5	21,9±2,9	1,14	тенденция к уменьшению	<0>	от 5 до 8 мес (12-17)
Показатель достоверно не изменялся	6,1±3,1	9,2±1,4	0,18	нет различий	0,91	Более 10 мес (21-32)
31,5±1,2	29,3±2,1	0,01	нет различий	1,2	Более 10 мес (21-32)
46,9±0,2	41,4±4,8	0,21	нет различий	0,13	от 5 до 8 мес (12-17)

Таблица 10. Связывание IgG антител на клетках линии mel Ibr (НLA+/+)

Группа	Х±m (initial)	Х±m (max)	Z- критерий	Принятая гипотеза	Р0-уровень	Продолжительность вакцинации (количество введений)
Увеличение показателя	2,7±0,4	9,1±1,8	1,1	тенденция к увеличению	<0>	Более 10 мес (21-32)
3,8±2,1	9,8±1,3	1,05	тенденция к увеличению	<0>	от 5 до 8 мес (12-17)
1,6±0,7	6,8±0,9	1,03	тенденция к увеличению	<0>	до 4 мес (5-8)
Уменьшение показателя в ходе иммунизации	5,1±0,1	3,3±1,9	1,01	тенденция к увеличению	<0>	от 5 до 8 мес (12-17)
17,8±1,1	7,0±0,2	1,87	уменьшение	<0>	от 5 до 8 мес (12-17)
8,0±1,6	2,3±1,2	1,1	тенденция к уменьшению	<0>	от 5 до 8 мес (12-17)
4,1±0,7	2,7±1,0	1,08	тенденция к уменьшению	<0>	до 4 мес (5-8)
Показатель достоверно не изменялся	8,3±4,1	5,3±0,4	0,06	нет различий	0,97	Более 10 мес (21-32)
1,58±1,5	4,6±2,0	0,11	нет различий	1,48	Более 10 мес (21-32)
1±0,6	2,1±0,4	0,08	нет различий	0,91	от 5 до 8 мес (12-17)
1,77±1,4	1,5±0,1	0,2	нет различий	1,2	от 5 до 8 мес (12-17)
2,6±0,8	3,32±1,6	0,01	нет различий	0,13	до 4 мес (5-8)

Таблица 11. Связывание IgG антител на клетках линии mel Р (НLA+/-)

Группа	Х±m (initial)	Х±m (max)	Z- критерий	Принятая гипотеза	Р0-уровень	Продолжительность вакцинации (количество введений)
Уменьшение	15,1±3,1	5,7±1,4	1,16	тенденция к уменьшению	<0>	от 5 до 8 мес (12-17)
Показатель достоверно не изменялся	11,5±0,6	10,1±0,7	0,02	нет различий	0,97	Более 10 мес (21-32)
5,1±0,1	5,3±1,9	0,03	нет различий	1,48	Более 10 мес (21-32)
7,8±1,4	7,0±0,4	0,09	нет различий	0,91	Более 10 мес (21-32)
4,7±1,2	9,8±0,36	0,1	нет различий	1,02	от 5 до 8 мес (12-17)
8,0±1,6	2,3±0,7	0,11	нет различий	1,2	от 5 до 8 мес (12-17)
4,1±0,7	2,7±1,6	0,07	нет различий	0,31	от 5 до 8 мес (12-17)
8,3±2,5	7,0±3,1	0,02	нет различий	0,7	от 5 до 8 мес (12-17)
1,82±1,5	1,6±0,09	0,1	нет различий	1,84	от 5 до 8 мес (12-17)
2,8±0,6	2,1±0,4	0,11	нет различий	1,12	до 4 мес (5-8)
1,6±0,3	1,9±0,5	0,02	нет различий	0,92	до 4 мес (5-8)
6,6±1,8	5,2±1,4	0,1	нет различий	1,16	до 4 мес (5-8)

Таблица 12. Связывание IgG антител на клетках линии mel Kor (НLA-/-)

Группа	Х±m (initial)	Х±m (max)	Z- критерий	Принятая гипотеза	Р0-уровень	Продолжительность вакцинации (количество введений)
Увеличение показателя	2,1±0,9	7,1±1,4	1,07	тенденция к увеличению	<0>	Более 10 мес (21-32)
2,3±0,3	9,3±1,0	1,15	тенденция к увеличению	<0>	от 5 до 8 мес (12-17)
7,0±1,8	24,8±1,9	1,42	тенденция к увеличению	<0>	от 5 до 8 мес (12-17)
Показатель достоверно не изменялся	3,1±0,1	3,3±1,9	0,04	нет различий	1,54	Более 10 мес (21-32)
6,8±1,1	7,0±0,2	0,12	нет различий	1,7	Более 10 мес (21-32)
8,0±4,6	6,3±1,2	0,1	нет различий	0,88	от 5 до 8 мес (12-17)
4,1±0,7	4,7±1,0	0,09	нет различий	1,09	от 5 до 8 мес (12-17)
8,3±4,1	8,9±2,4	0,07	нет различий	0,92	от 5 до 8 мес (12-17)
1,58±1,5	2,6±2,0	0,11	нет различий	0,84	от 5 до 8 мес (12-17)
1,3±0,6	2,1±0,8	0,03	нет различий	1,72	до 4 мес (5-8)
4,78±1,0	5,1±1,3	0,08	нет различий	1,04	до 4 мес (5-8)
6,2±0,8	3,5±1,6	0,24	нет различий	0,96	до 4 мес (5-8)

4.Оценка поликлонального IgM и IgG ответа на клетках линий melIbr, melP, melKor в группах обследуемых Группа-1А

А-Пациенты с периодом наблюдения более 10 мес., с выживаемостью более 1,5 лет –2 пациента из 12

Диаграмма1. melIbr(HLA+/+) (IgM ?/ IgG-) Диаграмма 2. melP(HLA+/-) (IgM ?/ IgG-) Диаграмма 3. melKor (HLA-/-) (IgM -/ IgG-)

Гистограмма1. Гистограмма 2. Гистограмма3.

Группа-2А

Диаграмма 4. melIbr(HLA+/+)(IgM ?/ IgG ?) Диаграмма 5. melP(HLA+/-)(IgM ?/ IgG ?) Диаграмма 6. melKor(HLA-/-)(IgM?-/ IgG ?)

Гистограмма 4. Гистограмма 5. Гистограмма 6.

В- пациенты с периодом наблюдения от 4 до 10 мес., с выживаемостью более 10 мес.— 5 пациентов из 12

Группа- 1В

Диаграмма7. melIbr (HLA+/+) (IgM ?/ IgG-) Диаграмма8. melP(HLA+/-) (IgM ?/ IgG?) Диаграмма9. melKor(HLA-/-) (IgM ?/ IgG-)

Гистограмма 7. Гистограмма 8. Гистограмма 9.

Группа- 2 В, с "отсроченным" ответом на melIbr(HLA+/+), melP(HLA+/-),

Диаграмма10. melIbr (HLA+/+) (IgM ?/ IgG ?) Диаграмма11. melP (HLA+/-) (IgM ?/ IgG ?) Диаграмма12. melKor(HLA-/-)(IgM?/IgG-)

Гистограмма 10. Гистограмма 11. Гистограмма 12.

Группа- 3В

Диаграмма13. melIbr(HLA+/+) (IgM +/ IgG-) Диаграмма14. melP(HLA+/-) (IgM -/ IgG-) Диаграмма15. melKor (HLA-/-) (IgM ?/ IgG?)

Гистограмма 13. Гистограмма 14. Гистограмма 15.

Группа- 4В, без IgM IgG ответа на melIbr(HLA+/+), melP(HLA+/-), mel Kor(HLA-/-)

Диаграмма16. melIbr(HLA+/+) (IgM ?/ IgG-) Диаграмма17. melP (HLA+/-) (IgM -/ IgG-) Диаграмма18. melKor(HLA-/-) (IgM -?/ IgG-)

Гистограмма 16. Гистограмма 17. Гистограмма 18.

С -Пациенты с периодом наблюдения до 4 мес., с выживаемостью не более 4 месяцев.—5 из12 пациентов

Группа 1С, с IgM ответом на mel Kor(HLA-/-)

Диаграмма19. melIbr(HLA+/+) (IgM -/ IgG-), Диаграмма20. melP(HLA+/-) (IgM -/ IgG-), Диаграмма 21. melKor (HLA-/-) (IgM ?/ IgG-)