Гуморальный иммунный ответ в аспекте активной специфической иммунотерапии рака

Гуморальный иммунный ответ в аспекте активной специфической иммунотерапии рака

Пузанова О. П., Барышников А.Ю.

Российский онкологический научный центр им Н.Н. Блохина РАМН

Тел (495) 324-24-24, факс (495) 324-24-24

puzanova_o@mail.ru

HUMORAL IMMUNE RESPONSE IN ASPECT OF ACTIVE SPECIFIC IMMUNOTHERAPY OF CANCER

Puzanova O. P., Baryshnikov A. U.

Russian Center of Cancer Studies named after Blokhin (RCCS), Kashirskoe shosse Street 24 phone (495) 324-24-24, fax (495) 324-24-24

puzanova_o@mail.ru

Abstract

The wide experience of clinical used of the various antineoplastic vaccines was accumulated but the mechanisms of immunological effects of it are considered only as presumable, and the picture of functioning of immune system during the oncogenesis remains incomplete. Vivid example of it is that the regularity of induction humoral response at carrying out the active specific immunotherapy of cancer up to the end are unclear.

The protective role of the antibodies specific to tumor tumor-associated antigen TАА in immune response against cancer in vivo experimentally is not confirmed. However, some authors, at studying immunological effects of antineoplastic vaccines proceed from the statement about participation of both components of immune system in antitumor immune protection.[12,23,26,30,41]

Besides there are the experimental data testifying correlations humoral and the cellular immune answer at carrying out of vaccinotherapy. [1-13,22-28] In numerous works of modern researchers it is shown, that occurrence CTL and the antibodies specific to TAA correlates with clinical effect, under condition of successful immunization, and is the basic criterion immunological efficiency immunotherapy of cancer [12-17, 22,23-28]. Thus, studying of mechanisms of an induction the humoral immune response at carrying out immunotherapy of cancer allows to define{determine} the conditions providing its peak efficiency and promotes understanding of roles humoral factors in the antitumor immune response and principles of functioning of immune system as a whole.

Key words Humoral immune response, Active specific immunotherapy of cancer, Vaccination, Tumor associated antigens, Antibody-dependent cellular cytotoxicity, antibody-mediated complement-dependent cell lyzis

Реферат

В условиях накопления большого числа экспериментальных данных, демонстрирующих различные иммунологические эффекты противоопухолевых вакцин, механизмы развития которых до конца не ясны, картина функционирования иммунной системы при онкогенезе остается неполной.

Механизмы индукции гуморального ответа при проведении специфической иммунотерапии до конца не ясны. Протективная роль антител, специфичных к опухоль-ассоциированным антигенам ОАА, в противоопухолевой защите in vivo экспериментально не подтверждена. Однако, некоторые авторы, при изучении иммунологических эффектов противоопухолевых вакцин исходят из утверждения об участии обоих компонентов иммунной системы в противоопухолевой защите. Кроме того, имеются экспериментальные данные, свидетельствующие корреляции гуморального и клеточного иммунного ответа при проведении вакцинотерапии.(1-13,22,23) В многочисленных работах современных исследователей показано, что появление цитотоксических Т-лимфоцитов ЦТЛ и антител, специфичных к ОАА коррелирует с клиническим эффектом, при условии успешной иммунизации, и является основным критерием иммунологической эффективности противоопухолевой терапии (25,14, 16,17, 22,23).

Изучение механизмов индукции гуморального иммунного ответа при проведении активной специфической иммунотерапии и роли гуморальных факторов в противоопухолевом иммунном ответе позволяет определить условия, обеспечивающие его максимальную эффективность и способствует пониманию принципов функционирования иммунной системы в целом.

Ключевые слова Гуморальный иммунный ответ, Активная специфическая иммунотерапия рака, Вакцинация, Опухоль-ассоциированные антигены, Антителами опосредованные цитотоксические клеточные реакции, Антителами опосредованный комплемент- зависимый клеточный лизис

Введение

Изучение гуморального ответа к опухоль-ассоциированным антигенам ОАА привлекло внимание ученых еще в 1970 году, когда при использовании поликлональной сыворотки от онкологических больных было идентифицировано более 30 иммуногенных опухолевых пептида. Многочисленные антигены на клеточной поверхности, включая муцин, онкопротеины и карбогидрат антиген, индуцировали развитие гуморального иммунного ответа, в некоторых случаях, появление циркулирующих иммунных комплексов. Появление методов анализа с применением количественных и полуколичественных аналитических систем позволило идентифицировать специфические антитела ко многим внутриклеточным и поверхностным опухолевым белкам. Исследования, направленные на определение частоты развития гуморального иммунного ответа к определенному набору антигенов, путем обнаружения в сыворотке больных специфичных к ОАА антител, являются одним из шагов на пути к созданию уникальных панелей антигенов для различных типов опухолей, что могло бы способствовать определению высокого риска заболевания, а так же явиться одним из способов неинвазивной диагностики рака [16,17].

Следует отметить, что роль специфичных гуморальных факторов в противоопухолевом ответе неоднозначна. При изучении эффектов гуморальных факторов, специфичных к поверхностным опухолевым антигенам были выявлены как антителами-опосредованные ЦТЛ-реакции, комплемент-зависимый лизис опухолевых клеток in vitro, так и свидетельства участия анти-ОАА антител в ускользании опухоли от иммунного надзора (эффект маскировки) [27]. Анализ клинических данных при проведении оценки гуморального ответа позволил выявить корреляцию продукции антител к внутриклеточным антигенам с неблагоприятным прогнозом заболевания: появление анти- p53 антител часто ассоциировано с неблагоприятным прогнозом рака молочной железы [38].

Дополнением к идентификации гуморального ответа к ОАА явились исследования иммунологических эффектов противоопухолевых вакцин. В настоящее время имеются экспериментальные данные, свидетельствующие о корреляции гуморального и клеточного иммунного ответа при проведении вакцинотерапии[21,22,25,29-34].. Кроме того, ряд исследователей считает, что обязательным условием достижения максимальной эффективности противоопухолевой вакцинации является развитие гуморального ответа к ОАА [12,26,28]. В рекомендациях для иммунологических лабораторий, предложенных LICR в рамках программы клинических испытаний противоопухолевых вакцин (immunological reference laboratory for the LICR’s Clinical Trials Program) оценка гумогального и клеточного иммунного ответа (T cell and Serological Typing Group) рассматривается как неотъемлемый компонент проведения иммунологического контроля у пациентов, участвующих в испытании противоопухолевых вакцин. Однако, утверждения о протекторной роли гуморальных факторов в противоопухолевом ответе требуют доказательств, ведущим механизмом противоопухолевой защиты по-прежнему признается реализация CD8+ цитотоксического Т-клеточного ответа.

1. Гуморальный иммуннный ответ на опухолевые антигены

1.1 Спонтанный гуморальный ответ к опухолевым антигенам, корреляция с экспрессией ОАА.

Анализируя опыт своих коллег по изучению механизмов развития противоопухолевого ответа, Roshni Mitra и соавт пришли к выводу, что выраженность гуморального иммунного ответа к опухоль-ассоциированным антигенам ОАА определяется иммуногенностью опухолевых клеток [22]. Поскольку опухолевые антигены могут стимулировать или возможно блокировать иммунные реакции, их наличие на поверхности клеток может быть критическим фактором, влияющим на рост опухоли [36] .

В работах, опубликованных в 1991г. Portoukalian J, Carrel S было показано, что уровень специфических антител к ОАА меланомы MAGE-1, MAGE-3, SSX2, Melan A, and tyrosinase в сыворотке онкологических больных зависит от уровня экспрессии этих антигенов в организме опухоленосителя [32]. Позднее Jager E и соавт. исследовали гуморальный иммунный ответ к ОАА меланомы (MAGE-1, MAGE-3, SSX2, Melan A и tyrosinase) во взаимосвязи с клиническими данными. При проведении оценки уровня антител, специфичных к ОАА, методом твердофазного иммуноферментного анализа в сыворотке пациентов с меланомой после тотальной резекции опухоли без метастазов присутствие антител не было выявлено, в то время как высокие титры антител к меланома-ассоциированным антигенам МАА обнаруживались у пациентов с опухолевой прогрессией [19].

Ген NY-ESO-1, клонированный из опухоли пищевода, SEREX методом, экспрессия которого была показана для рака яичек, стал предметом многочисленных исследований в области экспериментальной иммунологии и онкологии, так как в отличие от других известных ОАА, распознаваемых ЦТЛ, гуморальный ответ против NY-ESO-1 часто обнаруживается при анализе сыворотки крови пациентов с опухолями различных типов, экспрессирующими NY-ESO-1 антиген. Предварительными данными показано, что гуморальный ответ зависит от уровня экспрессии антигена. При исследовании нормальных индивидов и онкологических больных антитела к NY-ESO-1 обнаруживались в 44-50% случаев только в группе последних при высокой экспрессии NY-ESO-1 [18]. Прогрессия заболевания, как правило, сопровождается увеличением экспрессии NY-ESO-1, а стабилизация титров антител NY-ESO-1 на протяжении длительного времени в течение трех лет наблюдалась у пациентов с постепенной регрессией большой массы опухоли [16].

Nakagava K. и соавт в 2005 опубликовали результаты работы, по изучению экспрессии транскриптов идентифицированного ими гена XAGE-1, обладающего характеристиками СТ-подобного антигена (cancer/testis-like antigens), у пациентов с аденокарциномой легких. В результате проведения оценки гуморального иммунного ответа методом ELISA и Western blot-гибридизации продукция анти-XAGE-1b антител была выявлена только у пациентов с XAGE-1b продуцирующим гистологическим типом опухоли [29].

По данным Enkhtsetseg Purev et al. гуморальный и клеточный иммунный ответ к мутантному рецептору фактора роста EGF-RvIII у больных раком молочной железы коррелировал с эксспрессией EGF-RvIII и не наблюдался у здоровых доноров. [34].

1.2. Спонтанный гуморальный ответ к ОАА: механизм реализации иммунорегуляторных функций.

Продукция идиотипических антител как способ иммуносупрессии в условиях злокачественного роста.

Многочисленные экспериментальные данные свидетельствуют о том, что продукция антител к ОАА при онкогенезе является одним из механизмов ускользания опухолевых клеток от иммунного надзора. IgG анти-ОАА антитела блокируют сигнальные молекулы антигенных пептидов составе ГКГ на поверхности опухолевых клеток, препятствуя тем самым распознаванию ОАА иммунокомпетентными клетками. Данный иммунологический механизм получил название "эффект маскировки".

Антитела направленно взаимодействующие с HLA-DR комплексами на плазматической мембране В-лимфоцитов и моноцитов человека, как было показано Muchmore AV, Megson M, Decker JM, in vitro подавляют клеточные и гуморальные иммунные реакции. При изучении эффектов антител с мононуклеарами периферической крови МПК в реакциях антиген-специфическикой пролиферации и поликлональной продукции иммуноглобулинов выявлена супрессия реакций в присутствии интактных IgG фракций кроличьей гетероантисыворотки (anti-P29,34), человеческой аллоантисыворотки (Ia 172), и мышиных моноклональных антител in vitro. Для выделенных F(ab')2 фрагментов антител данные эффекты в исследуемых концентрациях не были показаны. Полученные Muchmore AV, Megson M, Decker JM экспериментальные данные, позволяют сделать вывод о роли Fc доменов в присутствии ингибиторных свойств антител к HLA-DR молекулам. [28].

В модели плазмоцитомы, когда опухолевые В-клетки неспособны экспрессировать ГКГ 2 класса, Bogen B и соавт продемонстрировано развитие толерантности CD4⁺ T-клеток к опухолевым Ig идиотипам. Позднее было показано, толерантность опосредована клональной делецией Т-клеток, специфичных к идиотипам, и дозо-зависимо индуцируется при повышении концентрации Ig опухолевых белков в сыворотке крови. [30]

2. Гуморальный иммунный ответ, индуцированный противоопухолевой иммунотерапией.

Предметом многочисленных исследований конца 90х явилось изучение экспрессии ОАА у онкологических больных во взаимосвязи с гуморальным и клеточным иммунным ответом, а так же характером течения заболевания [15-20,34-45].

2.1 Корреляция гуморального и клеточного иммунного ответа при проведении противоопухолевой вакцинации.

Многочисленные экспериментальные данные свидетельствуют о развитии специфичного к ОАА антигенам гуморального иммунного ответа в результате иммунизации различными клеточными вакцинами [11,25-27], вирусными рекомбинантами, пептидными [19-21,33] и ДНК-вакцинами [27,43,45], который часто сопровождается клиническим эффектом. [17,22,37-45]. По мнению исследователей Alexander Knuth, Dirk J?ger, Elke J?ger, анализ клинических данных по результатам проведения иммунизации онкологических больных за прошедшие годы позволит сделать вывод о применимости оценки интенсивности гуморального ответа к ОАА как критического параметра, определяющего иммунологическую эффективность вакцинации [17].

Аллогенные вакцины на основе опухолевых клеток

Morton DL, Habal N и соавт. исследовали гуморальный и клеточный иммунный ответ у больных диссеминированной меланомой III и IV стадии, иммунизированных аллогенной клеточной вакциной CancerVax на основе клеток меланомы трех линий (M10-V, M24-V, and M101-V), разработанной в Институте Рака Джона Вейна John Wayne Cancer Institute (JWCI), при совместно проводимой БЦЖ адьювантной терапией. В работах Morton DL и Takahashi T показано, что иммунные факторы, специфичные к клеткам вакцины, могут перекрестно реагировать с опухолевыми клетками реципиента, экспрессирующими иммуногенные ОАА, такие как gangliosides (GD2, GM2, GD3, and GM3), glycoproteins (fetal antigen, TA90), and/or pro- teins (MAGE-1, MAGE-3). При этом, различные ОАА индуцируют оба - и гуморальный и клеточный ответ - против аллогенных опухолевых клеток.[25,26,42]. При исследовании IgG и IgM гуморального иммунного ответа к TA90, одного из ОАА клеток аллогенной вакцины CancerVax, как было показано Habal N, у 26 из 56 обследуемых пациентов (46%) наблюдалось достоверное увеличение титров anti TA90 IgM, anti TA90 IgG антител (post-immune level) по отношению к исходному уровню (pre-immune level). IgM ответ к ТА90 коррелировал с увеличением продолжительности жизни иммунизированных вакциной пациентов, иногда сопровождался регрессом опухоли (при титрах IgМ свыше 800 средняя выживаемость составила 12.74 месяца; P 5 = .003), [12]

Пептидные вакцины

Экспериментальные данные, представленные в работах Elke J?ger, Yasuhiro Nagata, Sacha Gnjatic по изучению иммунологических эффектов пептидной противоопухолевой вакцины свидетельствуют о корреляции гуморального и клеточного иммунитета к NY-ESO-1 при проведении специфической иммунотерапии: CD8⁺ T клеточный ответ к HLA-A2-презентированным NY-ESO-1 пептидам был выявлен у пациентов с анти-NY-ESO-1 антителами и не был обнаружен у пациентов с недостаточно выраженным гуморальным ответом к данному антигену, а так же при низкой экспрессии NY-ESO-1 . [15-18]

В 2003 г калифорнийскими учеными были опубликованы результаты исследований по изучению гуморального иммунного ответа у онкологических больных, иммунизированных аллогенной вакциной на основе клеток меланомы, экспрессирующих gp43 комплекс ОАА (из 810 антигенов). Группа обследуемых включала 44 пациента с регионарной метастатической меланомой, разделенных на две группы по 22 человека. Первая группа - пациентов, у которых период ремиссии продолжался в течение 1 года после вакцинации, у остальных 22 – в течение 5 лет. После проведения предварительной оценки связывания IgM-человеческих моноклональных антител L92 и цитотоксических Т-лимфоцитов с gp43 опухоль-ассоциированным антигенным пептидом была проведена оценка IgG, IgM ответа к 810 антигенному пептиду gp43 методом твердофазного ИФА. Выявлено значительное увеличение IgM на четвертую неделю (после первой прививки). Уровень IgM был значительно высоким у пациентов, проживших более 5 лет [38].

Вирусные рекомбинанты и ДНК-вакцины

Puisieux I и соавт. показали, иммунизация мышей вакциной на основе вирусных рекомбинантов, кодирующих CEA индуцировала эффективный клеточный и гуморальный ответ к СЕА, спровождающийся положительными реакциями ГЗТ у животных с СЕА-экспрессирующими опухолями.[33] .E. Jager, J. Karbach, S. Gnjatic и соавт. показано, иммунизация онкологических больных вакциной к NY-ESO-1 антигену, на основе рекомбинантого вируса ветряной оспы домашней птицы, индуцирует гуморальный и клеточный иммуный ответ к NY-ESO-1 [19]. Однако, по мнению Rosenberg SA значительным недостатком ДНК-вакцин, как способа невирусного переноса генов для иммунизации, является их способность активировать ТН2 –лимфоциты, индуцируя преимущественно гуморальный ответ.[35]

Вакцины на основе идиотипических антител

В работах J. S. De Bono и соавт показано, иммунизация онкологических больных моноклональными крысиными антителами к MUC1 опухоль-ассоциированному антигену BrevaRex^® mAb-AR20.5 индуцирует как клеточный, так и гуморальный имммунный ответ к MUC1. [2]. По данным Morton D L , высокие титры anti-MUC-1 IgG антител при проведении вакцинотерапии крысиными анти-MUC1 идиотипическими антителами являются фактором благоприятного прогноза для пациентов с раком поджелудочной железы и другими MUC1 экспрессирующими опухолями. У пациентов с высоким уровнем IgG антител против муцин сиалил Tn (STn) эпитопов отмечается увеличение продолжительности жизни, а так же повышение уровня anti-STn IgM антител является независимым критерием благоприятного прогноза рака толстой кишки [29].

Вакцины на основе анти-идиотипических антител

Антиидиотипические антитела теоретически могут стимулировать "спящие" клоны иммунных клеток, нереактивных по отношению к псевдоантигенам, и тем самым индуцировать гуморальный и возможно клеточный иммунный ответ.

При проведении 1/2 фазы клинических испытаний вакцины на основе антиидиотипических антител к МАА высокой моллекулярной массы (HMW)-MAA, в соединении с БЦЖ как адьювантом, анализ гумморального иммунного ответа к HMW-MAA выявил наличие антител против HMW-MAA у 60 % пациентов с меланомой IV стадии [40]. При чем, данные анти-HMW-антитела обоих IgM и IgG изотипов способствовали развитию ЦТЛ-опосредованного иммунного ответа к антиидиотипам, и сопровождались увеличением продолжительности жизни пациентов . [21] Анализ результатов клинических испытаний этой вакцины у пациентов с колоректальным раком Colorectal cancer (CRC) показал, что активация Т-хелперов и продукция антител не сопровождались выраженным клиническим эффектом. В результате проведения вакцинотерапии анти-идиотипическими моноклональными антителами у всех 32 пациентов с колоректальным раком был выявлен поликлональный IgG гуморальный ответ к карцинома-эмбриональному антигену- carcinoembryonic antigen (CEA), 17 из которых с CRC IV стадии. У семи из восьми пациентов с метастазами в регионарные лимфоузлы наблюдалась стабилизация процесса в течение 12-33 месяцев. Восемь из девяти пациентов с неоперабельными опухолями отвечали на терапию прогрессией заболевания.[17].

В то же время при иммунизации антиидиотипическими антителами к эмбриональному антигену CEA по данным, появление IgM антител к CEA является благоприятным фактором в прогнозе колоректального рака [1].

Часто гуморальный ответ при вакцинации сопровождается Т-клеточным ответом к ОАА и коррелирует с клиническим эффектом. Однако, роль IgG и IgM гуморальных факторов неоднозначна.[15,17,39,40]. Показано, что именно продукция IgM антител к ОАА, индуцированная введением вакцины, в большинстве случаев сопровождается клиническим эффектом. Таким образом, хотя экспериментальные данные свидетельствуют о развитии гуморального и клеточного иммунного ответа при проведении вакцинотерапии, роль гуморальных факторов в развитии противоопухолевого ответа остается невыясненной.

2.2. Возможные механизмы противоопухолевой защиты при участии гуморальных факторов.

Накопление положительного опыта использования анти-идиотипических антител в терапии рака молочной железы и В-клеточной лимфомы за последние годы вновь привлекло интерес исследователей к изучению роли гуморальных факторов в противоопухолевом иммунном ответе.

При изучения механизмов реализации цитотоксических реакций при участии гуморальных факторов Carter P и соавт. показали: антитела не оказывали прямое цитотоксическое воздействие на клетки, инфецированные вирусом, или опухолевые клетки per se, но блокировали вирусные сигнальные молекулы на поверхности или осуществляли реализацию второго эффекторного механизма, индуцировали антителами-опосредованные ЦТЛ-клеточные реакции antibody-dependent cellular cytotoxicity (ADCC) или комплемент-зависимую цитотоксичность complement-dependent cytotoxicity (CDC).[4]

Протекторная роль отдельных изотипов иммуноглобулинов может быть выяснена исходя из их основных функций. Для пентамера IgМ наиболее характерна эффективная активация системы комплемента, для мономера IgG – опсонизация и ЦТЛ-опосредованная цитотоксичность.

Нейтрализация

Один из гипотетических механизмов позитивного влияния ОАА на эффективность развития противоопухолевого, в том числе и гуморального ответа при вакцинации, основывается на способности поверхностных гликопротеинов функционировать как молекулы клеточной адгезии. Многие ОАА представляют собой молекулы с большим молекулярным весом (ТА90, CEA, МUС1) и выраженными адгезионными свойствами и, обеспечивая эффективное прикрепление, играют ключевую роль в метастазировании.

Если ОАА оказываются вовлечены в клеточную адгезию, то возможным механизмом протективного действия антител, специфичных к ОАА, является способность блокировать молекулы эпитопов клеточной адгезии.

Повысить эффективность противоопухолевой вакцинации можно и модифицируя некоторые регуляторные взаимодействия между клетками иммунной системы. Так, блокада CTLA-4 Т-клеточного рецептора усиливает иммунный ответ на опухолевые антигены. Этот рецептор, как и СD28, связывается с В7.1 и В7.2 молекулами дендритных клеток, обладая при этом большей аффинностью подавлять Т-клеточный иммунный ответ. В экспериментальных исследованиях показано, что применение анти-CTLA-антител существенно усиливает иммунный ответ, что коррелирует с противоопухолевым эффектом. Начаты клинические испытания таких антител совместно с вакцинацией против меланомы, рака яичников и простаты [30].

Стимуляция выработки идиотипических антител к ОАА — как способ вакцинотерапии

G17DT- (синтетический гастриноподобный пептид, связанный с дифтерийным токсином) иммуноген, используется как стимулятор продукции нейтрализующих антител против гастрина, который, в свою очередь, является ростовым фактором GI злокачественных опухолей. При анализе клинических результатов иммунотерапии G17DT-вакциной, на основе синтетического гастриноподобного пептида, связанного с дифтерийным токсином, выявлено увеличение продолжительности жизни пациентов с продвинутым раком поджелудочной железы по сравнению с плацебо . Появление anti-G17 гуморального ответа, как было показано, сопровождалось клиническим эффектом и являлось критерием благоприятного прогноза заболевания.[28].

Механизм антителами опосредованной цитотоксичности.

Неуклонно пополняется количество экспериментальных данных, свидетельствующих об участии гуморальных факторов в распознавании опухолевых антигенов.

Elisabeth Stockert и соавт. было показано, в сыворотке больных меланомой обнаруживаются антитела, специфичные для опухолевых антигенов, которые являются в свою очередь мишенями для распознавания цототоксических Т-лимфоцитов, к таким антигенам относятся MAGE и тирозиназа, обнаруживаемые в сыворотке пациентов, больных меланомой, а так же ЦТЛ специфичны для NY-ESO-1, антиген рака яичка, инициирующего образование аутологичных антител, которые были недавно идентифицированны.[14,18]

В отногшении NY-ESO-1, в сыворотке больных к которому выявлены специфичные антитела, были идентифицированы три HLA-A2-презентируемых пептида, распознаваемые СTL двух различных линий.[14].

Антителозависимый Т-клеточный цитолиз осуществляется экстрацеллюлярно в отсутствии комплемента и обеспечивается киллерными клетками Т-системы, имеющими рецептор к Fc-фрагменту IgG. В-лимфоциты не обладают такой цитотоксичностью, а эффективность Т-киллеров выше, чем активность фагоцитов. Данный механизм имеет значение в противоопухолевом иммунитете, реакции отторжения трансплантата, хроническом прогрессирующем гепатите и др.[8]

Комплемент-зависимый лизис опухолевых клеток, опосредованный анти - ОАА IgM антителами.

Результатом специфического связывания IgM антител с антигеном на поверхности клетки является взамодействие Fcфрагментов иммуноглобулинов с компонентом системы комплемента C1q (классический путь активации системы комплемента), запускающее каскад протеолитических реакций, которое приводит в итоге к формированию "мембранного атакующего комплекса" на поверхности клетки мишени. Многочисленные продукты последовательной активации компонентов системы комплемента, анафилактогены, осуществляют амплификацию сигнала, способствуют опсонизации и фагоцитозу.

Таким образом, возможным результатом специфического связывания IgM-антител с ОАА на поверхности опухолевых клеток может являться активация системы комплемента.

В экспериментальной модели in vitro Hunt KK, Shibata M, Gupta RK, Morton DL. продемонстрировали IgM-опосредованный комплемент-зависимый лизис опухолевых клеток на примере ТА90-специфичных реакций. Выделенные из сыворотки пациентов, иммунизированных вакциной на основе аллогенных клеток меланомы, поликлональные анти-ТА90 IgM, но не анти ТА90 IgG антитела, в присутствии комплемента морской свинки осуществляли лизис от 36% до 71% культивируемых опухолевых клеток различных линий, включая меланому, рак молочной железы, нейробластому. Было выявлено отсутствие цитотоксичности после предварительной абсорбции сыворотки на клетках меланомы различных линий, но не на аутологичных лимфобластах.[26,43]

Результаты исследований по изучению IgG и IgМ продукции при вакцинации во взаимосвязи с клиническими данными свидетельствуют о преимущественной роли IgМ в реализации противоопухолевого ответа.[42]. Таким образом, IgМ опосредованная активация комплемента против опухолевых клеток может являться одним из возможных компенсаторных механизмов противоопухолевого действия гуморальных факторов.

3 . Экспериментальные модели изучения гуморального ответа к ОАА меланомы, индуцированного вакцинотерапией. Системы мониторинга гуморального иммунного ответа у опухолевых больных.

Работы по изучению иммуногенности ОАА меланомы, а именно гуморального иммунного ответа к данным антигенам у опухолевых больных появились уже в конце 60х годов двадцатого века. Принцип определения поликлонального гуморального ответа к ОАА в реакции поверхностной иммунофлюоресценции, одним из первых описанный в работах Morton et al., Surgery 1968, лег в основу экспериментальных моделей по изучению иммунологических эффектов противоопухолевых аутологичных и аллогенных вакцин на основе опухолевых клеток.

Для оценки гуморального иммунного ответа у пациентов с меланомой IIIА, IV стадии при проведении клинических испытаний противоопухолевой вакцины "MCV" на основе аллогенных клеток меланомы Ravindranath, Euhus и соавт (Ravindranath et al., Cancer Res 1989; 49:3891-3897; Euhus et al., Cancer Immunol Immunother 1989; 29:247-254) определяли уровень анти ММА IgM и IgG антител в сыворотке иммунизированных больных по реакции поверхностной флюоресценции при окраске FITC конъюгированными F(ab)²goat anti-human IgМ, F(ab)²goat anti-human IgG антителами по методике, описанной Morton et al., Surgery. Сыворотка, после предварительной абсорбции на аутологичных лимфобластах для удаления антител, специфичных к HLA антигенам (Saxton et al., Int J Cancer 1987), тестировалась против М14 линии меланомы, экспрессирующей все шесть иммуногенных МАА: ганглиозиды (GD2, GM2 и O-acetyl GD3), липопротеин меланомы и два гликолипида М-фетальный и М-мочевой антиген. Sidell et al., Cancer Immunol Immunother 1979. Ранее Euhus et al., Cancer (Immunol Immunother 1989) было показано, что ганглиозиды GD2, GM2 и O-ацетил GD3 индуцируют IgM ответ, остальные МАА индуцируют продукцию обоих, IgM и IgG, подклассов антител.

Подобное исследование сыворотки крови иммунизированных МСV пациентов было проведено на аутологичных клетках меланомы, предварительно выделенных, ослабленных обработкой ферментом (Chang et al., J Clin Lab Analysis 1:326-331(1987)), культивированных в течение 2 – 4 дней в RPMI 1640, содержащей 5 % человеческой сыворотки пуповины, для постановки реакции иммунофлюоресценции. Учет результатов проводился на проточном цитофлюориметре FACscan (Becton Dickinson, Calif.). Анализ полученных результатов, показал корреляцию гуморального ответа к ОАА с положительными реакциями на ГЗТ, а так же с клиническим эффектом вакцинотерапии.

Экспериментальная модель исследования гуморального иммунного ответа у пациентов с диссеминированной меланомой, вакцинированных "CancerVax" аллогенной противоопухолевой вакциной на основе клеток меланомы, в the John Wayne Cancer Institute (JWCI) включала определение титров IgG, IgM антител к очищенному TA90 гликопротеину, ОАА меланомы, и неочищенному PPD, не являющемуся ОАА, для оценки эффективности адьювантной терапии при иммунизации БЦЖ.. Модифицированная методика твердофазного ИФА сделала возможным исследование у пациентов IgG и IgM гуморального иммунного ответа к TA90. Для оценки гуморального ответа к ОАА использовались Anti-TA90 IgG and IgM антитела и очищенный TA90 гликопротеин, как мишень для определения титров IgG и IgM антител.[12]

Очищенный TA90 гликопротеин был мобилизован в гель в концентрации 50 нг в лунке, 100 мкл образцов сыворотки крови инкубировали в лунках планшета, после чего в лунки были добавлены Goat antihuman IgG (1:500) или antihuman IgM (1:1000) антитела коньюгированные с алкалинфосфатом.

Было показано, что гуморальный иммунный ответ к ТА90 , но не к PPD, коррелирует с Т-клеточным ответом и клинической эффективностью вакцинотерапии.

Elisabeth Stockert et al была разработана система скрининга гуморального иммунного ответа к аутоиммуногенным опухолевым антигенам у онкологических больных с применением следующего набора рекомбинантных белков NY-ESO-1, MAGE-1, MAGE-3, SSX2, Melan-A и тирозиназы для твердофазного иммуноферментного анализа. Было показано, что уровень специфических антител к ОАА меланомы в сыворотке онкологических больных зависит от уровня экспрессии этих антигенов в организме опухоленосителя [37].

Zhang J-Y, Casiano C A., Peng X-X проведены исследования по изучению возможностей применения минилучевого ELISPOT анализа для обнаружения антител, специфично связывающих определенные группы антигенов на опухолевых клетках, так называемых ОАА. В предложенной авторами экспериментальной модели mini-array анализ ОАА включал определение полноразмерных рекомбинантных пептидов экспрессируемых cDNA, кодирующей протоонкогены c-myc, p53, cyclin B1, p62, Koc, IMP1 и, тем самым, сигналы выживания. У всех 527 исследуемых больных частота обнаружения антител была различной и определялась типом антигена, но не превышала 15-20%. Однако, следует отметить, что исследовались пациенты с опухолями различной локализации и стадией заболевания. Кроме того, в дополнении к суммарной оценке гуморального ответа к общему числу антигенов, при проведении пошаговой оценки к каждому из опухолевых антигенов в отдельности частота положительных реакций с антителом увеличивалась до уровня 44-68%. Для рака молочной железы, легких и простаты показано наличие индивидуального профиля реактивности, что достигается путем уникальной конструкции антигенов mini-array. Для колоректального рака, гепатоцеллюлярной карциномы и рака желудка с выбранными семи ОАА индивидуальный профиль антител не был показан.[46]

По мнению Michele Maio исследование гуморального ответа к заданному набору опухолевых антигенов методом твердофазного иммуноферментного анализа- an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)- открывает новые возможности ранней диагностики рака и может явиться одним из способов мониторинга гуморального иммунного ответа при проведении активной специфической иммунотерапии.[18].

Заключение

Таким образом, мониторинг гуморального иммунного ответа у опухолевых больных необходим не только для установления характера течения и прогноза заболевания, но и служит неотъемлемым компонентом оценки эффективности противоопухолевой вакцинотерапии. Исследования гуморального иммунного ответа в различных экспериментальных моделях открывают новые возможности в выявлении перспективных мишеней вакцинотерапии и служат основой в понимании механизмов функционирования противоопухолевого иммунитета и иммунной системы в целом.

Список литературы

1. Albanopoulos K, Armakolas A, Konstadoulakis MM et al. Prognostic significance of circulating antibodies against carcinoembryonic antigen (anti-CEA) in patients with colon cancer. //Am J Gastroenterol 2000; 95: 1056–1061. .

2. Bonol J. S, Rha S. Y., Stephenson J., Schultes B. C., Monroe P., Eckhardt G. S., Hammond L. A., Whiteside T. L., Nicodemus C. F., Cermak J. M., Rowinsky E. K.and A. W. Tolcher. Phase I trial of a murine antibody to MUC1 in patients with metastatic cancer: evidence for the activation of humoral and cellular antitumor immunity. // Annals of Oncology 2004 15(12):1825-1833

3. Canevari S, Pupa SM, Menard S 1975-1995 revised anti-cancer serological response: biological significance and clinical implications. //Ann Oncol 1996 Mar;7(3):227-32

4. Carter P. Improving the efficacy of antibody-based cancer therapies.// Nat Rev Cancer- 2001; 1: 118-129.

5. Chen Y-T,. G?re A O, Tsang S, Stockert E, J?ger E, Knuth A, and L J. Old. Identification of multiple cancer/testis antigens by allogeneic antibody screening of a melanoma cell line library (human cancer immunology / serological analysis of recombinant cDNA expression libraries).// Immunology, April 7, 1998 Vol. 95, Issue 12, 6919-6923

6. Cui J.-w.,. Li W.-h, Wang J., Li A.-l., Li H.-y.,. Wang H.-x, He K., Li W., Kang L.-h., Yu M., Shen B.-f., Wang G.-J., and Zhang X.-m.Proteomics-based Identification of Human Acute Leukemia Antigens That Induce Humoral Immune Response.// Mol. Cell. Proteomics, November 1, 2005; 4(11): 1718 - 1724.

7. Denkers E Y. and Gazzinelli R T.. Regulation and Function of T-Cell-Mediated Immunity during Toxoplasma gondii Infection.//Clin Microbiol Rev. 1998 October; 11(4): 569–588.

8. Disis ML, Pupa SM, Gralow JR, et al. High-titer HER-2/neu protein-specific antibody can be detected in patients with early-stage breast cancer. //J Clin Oncol. 1997;15:3363–3367.

9. Finkelman F D, Holmes J, Katona I M, Urban J F, Beckmann M P, Park L S, Shooley K A, Coffman R L, Mosmann T R, Paul W E. Lymphokine control of in vivo immunoglobulin isotype selection.// Annu Rev Immunol. 1990;8:303–333.

10. Foshag LJ, Morton DL, Nizze JA, Chawla SP: Response to chemotherapy in melanoma patients after active specific immunotherapy (ASI) with melanoma cell vaccine.// Proc Annu Meet Am Soc Clin Oncol 1993;12:A1355..

11. Habal N. et al. CancerVax, An Allogeneic Tumor Cell Vaccine, Induces Specific Humoral and Cellular Immune Responses in Advanced Colon Cancer.//Ann Surg Oncol, Vol. 8, No. 5, 2001

12. Hintzen RQ, de JR, Lens SM, van LR. CD27: marker and mediator of T-cell activation. //Immunol Today 1994; 15: 307-311.

13. Huskinson J, Stepick-Biek P N, Araujo F G, Thulliez P, Suzuki Y, Remington J S. Toxoplasma antigens recognized by immunoglobulin G subclasses during acute and chronic infection.// J Clin Microbiol. 1989;27:2031–2038

14. Jager E, Chen YT, Drijfhout JW, et al. Simultaneous humoral and cellular immune response against cancer-testis antigen NY-ESO-1: definition of human histocompatibility leukocyte antigen (HLA)-A2-binding peptide epitopes. //J Exp Med. 1998;187:265–270. doi: 10.1084/jem.187.2.265.

15. Jager E., Karbach J., Gnjatic S., Neumann A., Bender A., Valmori D., Ayyoub M., Ritter E., Ritter G., Jager D., Panicali D., Hoffman E. Recombinant vaccinia/fowlpox NY-ESO-1 vaccines induce both humoral and cellular NY-ESO-1-specific immune responses in cancer patients.// PNAS, September 26, 2006; 103(39): 14453 - 14458.

16. Jones PC, Sze LL, Liu PY, et al: Prolonged survival for melanoma patients with elevated IgM antibody to oncofetal antigen. //J Natl Cancer Inst 1981;66:249-254

17. Knuth A, Wolfel T et al. Cellular and humoral immune responses against cancer: implications for cancer vaccines. //Curr Opin Immunol- 1991 Oct;3(5):659-64.

18. Maio M., Coral S., Sigalotti L, Elisei R, Romei C, Rossi G, Cortini E, Colizzi F, Fenzi G, Altomonte M, Pinchera A and M Vitale. Analysis of Cancer-Testis Antigens in Sporadic Medullary Thyroid Carcinoma: Expression and Humoral Response to NY-ESO-1.// The Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism Vol. -88, No.- 2, p. 748-754

19. Marshall JL, Hawkins MJ, Tsang KY, et al. Phase I study in cancer patients of a replication-defective avipox recombinant vaccine that expresses human carcinoembryonic antigen.// J Clin Oncol. 1999;17:332–337.

20. McAneny D, Ryan CA, Beazley RM, Kaufman HL. Results of a phase I trial of a recombinant vaccinia virus that expresses carcinoembryonic antigen in patients with advanced colorectal cancer.// Ann Surg Oncol . 1996;3:495–500.

21. Mitchell MS, Jakowatz J, Harel W, et al: Increased effectiveness of interferon alfa-2b following active specific immunotherapy for melanoma.// J Clin Oncol 1994;12:402-411.

22. Mitra R, Singh S. and A. Khar. Antitumour immune responses. [Expert Reviews in Molecular Medicine (2003), 5: 1-22] Published online by Cambridge University Press 13Feb2004

23. Mittelman A, Chen ZJ et al. Kinetics of the immune response and regression of metastatic lesions following development of humoral anti-high molecular weight-melanoma associated antigen immunity in three patients with advanced malignant melanoma immunized with mouse antiidiotypic monoclonal antibody MK2-23.// Cancer Res.-1994 Jan 15;54(2):415-21.

24. Monji M., Nakatsura T., Senju S., Yoshitake Y., Sawatsubashi M., Shinohara M., Kageshita T., Ono T., Inokuchi A., and Y. Nishimura Identification of a Novel Human Cancer/Testis Antigen, KM-HN-1, Recognized by Cellular and Humoral Immune Responses.// Clin. Cancer Res., September 15, 2004; 10(18): 6047 - 6057.

25. Morton D L., Barth A. Vaccine Therapy for Malignant Melanoma//CA Cancer J Clin july/august 1996. Vol. -46, No.- 4, p. 225-244

26. Morton DL, Foshag LJ, Hoon DS, et al: Prolongation of survival in metastatic melanoma after active specific immunotherapy with a new polyvalent melanoma vaccine. //Ann Surg 1992;216

27. Mosolits S., Ullenhag G. and H. Mellstedt. Therapeutic vaccination in patients with gastrointestinal malignancies. A review of immunological and clinical results.// Annals of Oncology April 13, 2005 16(6):847-862.

28. Muchmore AV, Megson M, Decker JM, Knudsen P, Mann DL, Broder S. Inhibitory activity of antibodies to human Ia-like determinants: comparison of intact and pepsin-digested antibodies//. J Immunol 1983 Aug;131(2):725-30

29. Nakagawa K, Nogguchi Y, Uenaka A, Sato S, Okumuro H, Tanaka M. XAGE-1 expression in non : Small cell lung cancer and antibody response in patients //Clinical cancer research   ISSN 1078-0432  2005, vol. 11, no15, pp. 5496-5503

30. O'Carroll K S, Sotomayor E, Montgomery J, Borrello I, Hwang L, Fein S, Pardol D, Levitsky H. Induction of antigen-specific T cell anergy: An early event in the course of tumor progression// Immunology-1998. Feb3-V.-95, p. 1178-1183

31. Ochsenbein. A F Principles of tumor immunosurveillance and implications for immunotherapy// Gene therapy of Cancer. 2002(12), V- 9, no-12, P. 1043-105531

32. Portoukalian J, Carrel S et al. Humoral immune response in disease-free advanced melanoma patients after vaccination with melanoma-associated gangliosides. EORTC Cooperative Melanoma Group.// Int J Cancer. 1991 Dec 2;49(6):893-9.

33. Puisieux I, Odin L, Poujol D, et al. Canarypox virus-mediated interleukin 12 gene transfer into a murine mammary adenocarcinoma induces tumor suppression and long-term antitumoral immunity.// Hum Gene Ther. 1998;9:2481–2492.

34. Purev E, Cai D, Miller E, Swoboda R, Mayer T, Klein-Szanto A, Marincola F M.. Immune Responses of Breast Cancer Patients to Mutated Epidermal Growth Factor Receptor (EGF-RvIII, EGF-R, and de2–7 EGF-R)// The Journal of Immunology, 2004, 173: 6472-6480.

35. Rosenberg SA, Zhai Y, Yang JC, et al. Immunizing patients with metastatic melanoma using recombinant adenoviruses encoding MART-1 or gp100 melanoma antigens. //J Natl Cancer Inst. 1998;90:1894–1900.

36. Sahin U, Tureci O, Chen YT, et al. Expression of multiple cancer/testis (CT) antigens in breast cancer and melanoma: basis for polyvalent CT vaccine strategies. //Int J Cancer. 1998;78:387–389.

37. Stockert E, E J?ger, Y-T Chen, MJ. Scanlan, I Gout, J Karbach, M Arand, A Knuth, and L J. Old. Survey of the Humoral Immune Response of Cancer Patients to a Panel of Human Tumor Antigens.// J. Exp. Med., Volume 187, Number 8, April 20, 1998 1349-1354

38. Takahashi T, Conforti A, Kikumoto Y, Hoon D. S.B., Morton D L. and R. F.Irie. Melanoma - IgM antibody - peptide antigen – prognosis.//The Lancet Oncology. February 2003 Vol- 4, Issue 2 , Pages 104-109

39. Theresa V Strong1 Gene therapy for carcinoma of the breast: Genetic immunotherapy.//Breast Cancer Res. 2000; 2(1): 15–21. Published online 1999 December 17. doi: 10.1186/bcr24.

40. Ullenhag GJ, Frodin JE et al. Durable carcinoembryonic antigen (CEA)-specific humoral and cellular immune responses in colorectal carcinoma patients vaccinated with recombinant CEA and granulocyte-macrophage colony-stimulating factor. //Clin Cancer Res. 2004 May 15;10(10):3273-81.

41. Weinberg AD, Rivera MM, Prell R et al. Engagement of the OX-40 receptor in vivo enhances antitumor immunity.// J Immunol 2000; 164: 2160-2169.

42. Wong JH, Gupta RK, Morton DL. Demonstration of a well-characterized tumor-associated antigen on melanoma cell surface. //J Surg Oncol. 1988 Jul;38(3):147-50.

43. Xiaoling G , Ying L, Jing L, Huifang L, Xia Z, Qingqing F and Ping Z . Induction of anti B-cell malignance CTL response by subfamily-shared peptides derived from variable domain of immunoglobulin heavy chain.// Cancer Immunology, Immunotherapy. November, 2005, Vol 54, no 11.

44. Yakirevich E., Sabo E., Lavie O., Mazareb S., Spagnoli G. C. and M. B. Resnick Expression of the MAGE-A4 and NY-ESO-1 Cancer-Testis Antigens in Serous Ovarian Neoplasms.// Clin. Cancer Res., December 15, 2003; 9(17): 6453 - 6460.

45. Ye Z., Hellstrom I., Hayden-Ledbetter M., Dahlin A., Ledbetter J. A., Hellstrom K. E.. Gene therapy for cancer using single-chain Fv fragments specific for 4–1BB.// Nat. Med. 2002. 8:343

46. Zhang J-Y, Casiano C A, Peng X-X, Koziol J A, Chan E K. L, Tan E M. Enhancement of antibody detection in cancer using panel of recombinant tumor-associated antigens.// Cancer epidemiology, biomarkers & prevention 2003, vol.12,no2,pp.136-143

Таблица1. Аллогенные вакцины на основе клеток меланомы
Исследование гуморального иммунного ответа

Рис 1. Роль гуморальных факторов в противоопухолевом иммунном ответе
Экспериментальные модели in vitro