Вход

Аллергические заболевания органов дыхания у детей

Реферат по медицине и здоровью
Дата добавления: 25 июня 2006
Язык реферата: Русский
Word, rtf, 169 кб
Реферат можно скачать бесплатно
Скачать
Не подходит данная работа?
Вы можете заказать написание любой учебной работы на любую тему.
Заказать новую работу




Аллергические заболевания органов дыхания у детей

Полиморфизмы генов NO-синтаз и их ассоциация с бронхиальной астмой и патогенетическими признаками болезни у детей

Главными патогенетическими признаками бронхиальной астмы (БА) счита­ют атопию и состояние бронхиальной гиперреактивности. Оксид азота играет важную роль в развитии БА, поскольку он, являясь сигнальной молекулой, уча­ствует в механизмах формирования как атопии, так и гиперреактивности брон­хов [Barnes P.J., 1998; Lundberg J.O.N., Weitzberg E.,1996].

Синтез NO осуществляется семейством NO-синтаз (КФ 1.14.13.39): нейро-нальной (NOS-I), эндотелиальной (NOS-III) и индуцибельной (NOS-II). Все они являются продуктами различных генов, расположенных на разных хро­мосомах [GINА, 2002].

Наиболее вероятным кандидатом на участие в развитии БА является ген NOS-I [Grasemann H. et all., 1999]. Существуют исследования, показывающие связь полиморфных вариантов генов NO-синтаз с уровнем вырабатываемого (эндогенного) оксида азота, что в свою очередь зависит от активности мРНК генов NO-синтаз. Учитывая вышесказанное, можно ожидать значительный вклад полиморфизмов промоторной области генов NO-синтаз как факторов риска в развитие заболеваний, при которых отмечается нарушение нормаль­ной выработки NO, в частности при БА.

Цель данного исследования - изучение ассоциации полиморфизмов про­моторной области генов NO-синтаз у детей, больных БА, с клиническими и функциональными характеристиками болезни. Нами обследовано 88 детей в возрасте от 7 до 13 лет (мальчиков, девочек), больных БА, находившихся на лечении в отделении аллергологии Областной детской больницы в 2002-2003гг. Средний возраст больных составил 10,5±1,8 лет. Диагноз БА верифи­цировался в соответствии с положениями Национальной программы «Брон­хиальная астма у детей. Критерии лечения и профилактика». Средняя про­должительность заболевания к моменту обследования составила 3,3±0,5 года. Контрольную группу составили 26 практически здоровых детей того же воз­раста, проживающих в г.Томске.

Для оценки функции внешнего дыхания (ФВД) проводили анализ кривой поток-объем и показа­телей спирометрии. Исследование ФВД выполняли по стандартной методике на аппарате Master Lab Pro («Эрих Йегер», Германия). Степень реактивности дыхательных путей оценивали в мета-холиновом тесте (РС20). Измерение уровня общего сывороточного IgE было проведено с исполь­зованием твердофазного иммуноферментного анализа с использованием стандартного набора («Вектор Бест», г.Новосибирск). Выделение геномной ДНК из венозной крови обследуемых прово­дили методом фенол-хлороформной экстракции. Полиморфизм генов NO-синтаз в промоторной области определяли по следующей методике. Состав реакционной смеси (50 мкл): 67 мМ трис-НС1, рН 8,8; 16,7мМ сульфат аммония; 1,5 мМ хлорид магния; по 0,2 мМ каждого dNTP; 0,1 %

твин-20; 50-100 нг геномной ДНК человека; 2 ед. tag-полимеразы, по 5 пикомоль каждого из прай-меров, специфичных для NOS-I, NOS-II, NOS-II1:

NOS-I sense primer-5'-TTCGGCTGTGCTTTGATGGA-3'

NOS-I anti-sense primer-5'-GTTGACCGACTGGATTTAGGGCTCT-3'

NOS-II sense primer-(5'-GCCTTCTGGAACCTGGGATTT-3') и

NOS-II anti-sense primer-(5'-TTCGACTCGCTACAAAGTTAT-3');

NOS-III sense primer-5'-GCCAAGGGCACCGGCATCACCAGGA-3'

NOS-III anti-sense primer-5'-GTTACCAGCACCAGCGTCTCGT-3'

Условия проведения полимеразной цепной реакции (ПЦР): преднагрев: 95" С -5 мин.; основная про­грамма - 38 циклов: 95° С- 15 с (денатурация); 55" С - 15 с (отжиг); 72° С-40 с (синтез 2-й цепи); заключительная стадия: 72' С - 1мин. Термоциклер - «Терцик» (ДНК-Технология, г.Москва). В ре­зультате ПЦР получали фрагменты ДНК длиной 656, 500, 260 пар нуклеотидов соответственно для NOS-I, NOS-II, NOS-III. Для выявления полиморфизмов использовали анализ конформационного поли­морфизма одноцепочечных фрагментов ДНК (SSCP, single-strand conformational polymorphysm).

Тотальную РНК выделяли с помощью коммерческого набора TRIZOL™ (GibcoBRL, Life Technologies). ПолиА-PHK получали на колонках с олиго-dTцеллюлозой (ICN, США) и проводили обратную транскрипцию в течение 1 ч при 37' С. кДНК амплифицировали с праймерами, специфич­ными для мРНК NOS-I, NOS-II, NOS-III, синтезированными на ДНК-синтезаторе ASM 800:

мРНК NOS-I sense-5'-ATGGCTTGCCCCTGGAAGTT-3'

мРНК NOS-I anti sense-5'-GCCACAACAGTGGCAACAT-3'

мРНК NOS-II sense-5'-AGTTTGACCAGAGGACCCAG-3'

мРНК NOS-II anti sense-5'-CGAGGAGGCTGCCCTGCAGA-3'

мРНК NOS-III sense-5'-GTTGATGCGGAGGGAACCGA-3'

мРНК NOS-III anti sense-5'-GAACTGGAAGTAACGTGCCG -3'

Глицеральдегид 3-фосфат дегидрагепаза (ГАФД) использована как положительный контроль экспрессии мРНК. Показатели экспрессии выражали в процентах относительно активности ГАФД, которая принималась за 100%. ГАФД:

Sense primer - (5'-GAAGCTCACTGGCATGGCCTTCC-3');

Anti-sense primer - (5'-CATGTGGGCCATGAGGTCCA-3').

Оценку специфичности продуктов амплификации проводили с помощью «nested-ПЦР». Оценку нормальности распределения полученных результатов по каждой величине проводили с помощью критерия Колмагорова-Смирнова. Статистическую обработку результатов для признаков с нор­мальным распределением проводили с использованием t-критерия Стьюдента, для признаков, не соответствующих нормальному закону распределения, применяли U-mecma Манна-Уитии. Корре­ляционный анализ проводили с использованием критерия Пирсона. Сравнение распределения частот паттернов в группах обследованных проводили с использованием точечного критерия Фишера. Относительный риск (RR-Relative Risk) вычисляли по формуле:

RR=(a+0,5).(d+0,5)/(b+0,5Hc+0,5)

где а - число больных с наличием данного паттерна; b - с отсутствием данного паттерна; cud- число здоровых, с наличием и отсутствием данного паттерна соответственно; параметр 0,5 в этой формуле используется как поправка на малочисленность выборки. При оценке результатов было принято, что RR>1 рассматривали как положительную ассоциацию заболевания с данным полиморфным вариантом («фактор риска»), a RR<1 как отрицательную ассоциацию («фактор устойчивости»).

Результаты: При изучении уровня экспрессии NO-синтаз у детей, больных БА различной степени тяжести, установлена высокая активность матричной РНК (мРНК) NOS-I при тяжелой и среднетяжелой БА (р<0,05). В свою оче­редь активность мРНК NOS-III у всех больных детей, вне зависимости от тяжести заболевания, была достоверно выше (р<0,05), чем в группе контроля. Следует отметить, что при тяжелой БА активность мРНК NOS-II была досто­верно выше, чем при БА легкой и средней степени тяжести, а также почти в 10 раз превышала уровень экспрессии NOS-II в контрольной группе (табл. 1).

Уровень экспрессии мРНК генов NO-синтаз у больных бронхиальной астмы различной степени тяжести

Уровень экспрессии мРНК генов NO-синтаз у больных бронхиальной астмой и в контрольной группе


Уровень экспрессии мРНК

NOS1

NOS2

NOS3

Уровень экспрессии мРНК (контрольная группа)

4,4+0,18%

16,37±0,61%

1,48±0,16%

Уровень экспрессии мРНК (БА легкой степени тяжести)

4,0±0,22%

29,0±2,72%*

5,0±0,34%*

Уровень экспрессии мРНК (БА средней степени тяжести)

13,0±0,25%

71,0+6,83%*

2,0±0,3%

Уровень экспрессии мРНК (БА тяжелой степени)

14,0±0,39%*

156,0±3,86%*

4,0±0,26%*

Примечание: * - р<0>



Уровень экспрессии мРНК

NOS-1

NOS-2

NOS-3

паттерны

11

12

13

21

22

23

24

31

32

33

34

Уровень экспрессии МРНК (БА)

6,29 ±0,33

6,77 ±0,49

6,31 ±0,5

92,3 ±4,08*

94,5 ±2,5*

86,7 ±2,36*

151,25 ±2,3*

3,9 ±0,29

4,5 ±0,01

2,75 ±0,26

4,47 ±0,58*

Уровень экспрессии мРНК (контроль)

3,86 ±0,09

4,75 ±0,25

5,8 ±0,2

15,8 ±1,46

19,3

±1,67

15,7 ±0,63

1,48 ±0,19

2,6 ±0,42

2,5 ±0,26

1,0 ±0,01

Примечание: * р<0>


Методом корреляционного анализа установлена обратная связь между уровнем экспрессии NOS-II и показателями, характеризующими функцию легких, такими как ОФВ1(г=-0,5; р=0,0001), ФЖЕЛ (г=-0,4; р=0,001), ПВС% (г=-0,2; р=0,04). Наиболее высокий коэффициент корреляции получен между активностью мРНК NOS-I и изменениями, характерными для бронхиальной обструкции (ОФВ! (г=-0,6; р=0,0001), ОФВ/ ФЖЕЛ (г=-0,24; р=0,025)).

В рамках проводимого исследования было обнаружено три полиморф­ных варианта (паттерна) в промоторной области гена NOS-I: NOS-11, NOS-12 и NOS-13. В группе больных БА средней степени тяжести частота встреча­емости паттерна NOS-13 была достоверно выше (р<0,05), чем в группе кон­троля и в группах с легкой и тяжелой БА.

В промоторной области гена NOS-II было идентифицировано четыре вида паттернов: NOS-21, NOS-22, NOS-23 и NOS-24. У больных среднетяжелой БА паттерн NOS-21 встречался в 1,5 раза чаще, чем в других группах (р<0,05). Обнаружено, что у здоровых детей и у детей с легкой Б А отсутство­вал паттерн NOS-24, тогда как при тяжелой и среднетяжелой БА частота его встречаемости составляла 4,5% и 4,8% соответственно.

Для промоторной области гена NOS-III было получено четыре поли­морфных варианта: NOS-31, NOS-32, NOS-33 и NOS-34. Установлено, что при БА легкой и средней степени тяжести значительно чаще встречался пат­терн NOS-34 (30,4% и 23,8% соответственно против 11,5% в группе контроля). При тяжелой БА достоверно возрастала частота паттерна NOS-33 (р<0>

При наличии паттернов NOS-34 и (или) NOS-24 обнаружено достоверное повышение экспрессии мРНК по сравнению другими вариантами полимор­физмов в этих генах (р<0,05) (табл.2). Относительный риск (RR) для данных паттернов составлял 1,53 и 2,17 соответственно. Полученные результаты в данном случае доказывают наличие положительной ассоциации заболевания с полиморфными вариантами NOS-24 и NOS-34 («фактор риска»).

Наряду с этим у больных БА установлена положительная зависимость между уровнем IgE и наличием паттерна NOS-34 (г=0,2; р=0,04) и отрица­тельная при наличии NOS-31 (г=-0,2; р=0,04). Следует также отметить, что в контрольной группе частота обнаружения паттерна NOS-31 была досто­верно выше, чем у детей с БА (80,8% и 68,6% соответственно) (р<0,05), a RR составил 0,64, что может рассматриваться как отрицательная ассоциация паттерна NOS-31 с данным заболеванием («фактор устойчивости»).

Таким образом, наличие у детей определенных полиморфных вариантов промоторной области генов NO-синтаз может оказывать влияние на феноти-пические проявления БА и важных патогенетических признаков болезни. В развитие астматического синдрома включено множество генов разных локу-сов, каждый из которых может вносить небольшой вклад в общую подвер­женность заболеванию. Гены NO-синтаз являются лишь одними из множества генов предрасположенности к БА, взаимодействующих между собой и с окру­жающей средой.

© Рефератбанк, 2002 - 2017