Биологическая роль, структура и выделение митохондрий из печени крыс

Биологи ческая роль , структура и выделение митохондри й из печени крыс . Содержание 1. Введение 1.1. История вопрос а 1.2. Перспективы исследовани й 2. Биологическая ро ль митохондрий 3. Ультраструктура митохонд рий 3.1. Общие принцип ы организации 3.2. Особенности ст роения мембраны митохондрий 4. Описание общих принципов разли чных методов выделения митохондрий 4.1. Гомогенизация материала 4.1.1. Механическая 4.1.2. На основе кавитации газов 4.1.3. Ультразвук 4.2. Разделение субклеточных компонентов 4.2.1. Центрифугирование 4.2.2. Разделение в двухфа зной системе , содержаще й два полимера 4.2.3. Электрофорез 4.2.4. Ферменты - маркеры м итохондрий 5. Методики 6. Заключение 7. Список литературы Введение История вопроса. Кёлликер одним из первых описал характерным образом ориентир ованные гранулы в саркоплазме поперечно-полосатой мышцы . Ему принадлежит так же честь первого выделения митохондрий из клеточных структур . В 1888 году он выделил эти гран улы из мышцы насекомых и показал , что они обладают мембраной и набухают в воде . Началом новой эры в цитологическом изуче нии митохондри й явилась работа Бенс ли и Хэрра , которые предприняли попытку вы делить митохондрий из взвеси разрушенных клет ок печени , применив метод дифференциального ц ентрифугирования . Из-за отсутствия подходящей сред ы для суспендирования и несовершенства метода центриф у гирования Бенсли не удал ось получить интактные митохондрий , но именно новаторская работа Бенсли определила слияние цитологических исследований митохондрий с ис следованиями дыхания. Перспективы исс ледований. В настоящее вре мя основная задача изучения митохо ндрий на молекулярном уровне сводится к выделе нию ферментативных компонентов окислительных цик лов , определения их молекулярной структуры и механизма действия , анализу их участия в полиферментных системах в митохондриях и картированию их локализации на стр у ктурах митохондрий . То обстоятельство , что ферменты дыхательной цепи составляют более 25 % белка митохондриальных мембран заставляют рассматривать эти ферменты не только как функциональные , но и как структурные элементы митохондрии . Биологическая роль м итохондрий . На пр отяжении ста с лишним лет , т . е . со времени первых работ Кёлликера (1850), наблюдавшего гра нулы в саркоплазме поперечнополосатых мышц , велись кропотливые морфологические исследования , которые постепенно подготавливали почву для всесторон него изучения природы митохондр ий . Но только в 1949 г . Кеннеди и Лениндже р установили , что в митохондриях протекает цикл окислительного фосфорилирования , т.е . что митохондрий служат местом генерирования энерги и . С этого момента начинается новая эра в изуч е нии мито хондрий — эра , в которой блистательные открытия сле дуют одно за другим . В короткий срок были открыты осмотическая , сократительная , регуляторная и генети ческая функции митохондрий и на йдены многие из тех молекулярных структур , которые служат пер в ичным субстрато м 'этих функций . Было показано также , что митохондрий обеспечивают интеграцию многочисленных процессов клеточного обмена . Эти исследовани я еще не , завершены , но они могут служи ть примером плодотвор ности нового подхода к изучению живого , то г о подхода , который отличает молекулярную биологию. В развитии моле кулярной биологии за последнее время наметилс я новый этап . До сих пор это были ис следования главным образом , на уровне однор одных молекул белков и нуклеиновых кислот , исследования , по свяще нные их структуре , функции и биосинтезу . Теперь же исследовате ль не довольствуется этим и переходит к изучению специфически организованных надмолекулярн ых комплексов , каковыми являются клеточные ор ганеллы . Некоторые функции этих органелл такж е мо гут быть истолкованы на уровн е индивидуальных моле кул , например молекул от дельных ферментов . Но глав ная особенность кле точных органелл — это интеграция ферментатив ных процессов . Так , благодаря наличию в со ставе митохондрий различных белков , липидов , н у клеиновых кислот и углеводов , соедине нию их между собой и упорядоченному разме щению в пространстве в виде трехслойных м ембран эти образования приобре тают свойства , которые исчезают при их расчленении на от дельные молекулы . Свойства эти : векторный хара ктер действия митохондриальных ферментов (в отличие от скалярного , т . е . не зависящего от направления , дей ствия растворимых ферментов ), способность к непосред ственному п реобразованию энергии окисления в осмоти ческую и механическую энергию , способность к авто номному синтезу белков и т . д . Каждое из этих свойств определяется не пр остой суммой реакций , катализируе мых отдельными ферментами , а обусловлено взаимо действием то чно ориентированных ферментных и нефер ментных макромолекул . Само собой разумеется , что глу бокое и сследование и познание приро ды клеточных органелл возможно лишь путем расчленения их на от дельные молекулы с последующей реконструкцией . Ультраструктура ми тохондрии Общие принципы организации . Внутренне пространство митохондрии окружено двумя непрерывны ми системами мембран , каждая из которых представляет собой замкн утый мешок ; эти мешки расположены так , что всю митохондрию можно представить себе , к ак мешок внутри мешка . Просвет внутреннего мешка не сообщается с пространством между двумя мембранами . Нару ж ная мембра на гладкая , а внутренняя образует многочислен ные впячивания , которые в самом простом сл учае имеют форму перегородок , но могут при нимать крайне сложные очертания . Палад назвал эти впячивания митохондриальными кристами . Д ругой характерный компоне н т структуры митохондрии - это матрикс , который заполняет просвет , окруженный внутренней мембраной . Извес тно , что он содержит много белка и нек оторое количество липидов ; по-видимому , он обла дает определенной организацией и более или менее жесткой структур о й . Наконец , митохондрии , фиксированные осмием часто содерж ат в матриксе ряд мелких гранул . Число , диаметр и плотность этих внутримитохондриальны х гранул изменяются в зависимости от сост ояния обмена веществ в тканях. Особенности стр оения мембраны митохондри и . Так как наибольшее практическое значение представляют внутренние мембраны митохондрии , содержащие дыхательные ансамбли , имеет смысл более детально познакомиться с ультраструктуро й митохондриальной мембраны . При детальном ан ализе было выявлено , что мито хондриальные мембраны содержат 35 -40 % липидов , преимущественно фосфатидов , и 60 - 65 % белка . Небольшие различия , к оторые иногда наблюдаются обусловлены различными условиями получения при использовании различ ных физических и химических способов разрушен и я структуры митохондрии. Митохондри и печени крысы содержат значительные количест ва фосфатидилэтаноламина , фосфатидилхолина , инозитфосф атидов , кардиолипина и фосфатидилсерина ; содержани е плазмалогена и сфингомиелина невелико , иног да они вовсе отсутствуют . Х арактерное содержание и количественное содержание липидов в митохондриальной мембране , вероятно обусловле ны необходимостью поддержания термодинамически у стойчивого двойного слоя липидов , образующего остов мембраны , который служит опорой для дыхательных ан с амблей . По-видимому , бол ьшое значение имеет тот факт , что практиче ски все липиды митохондриальной мембраны экст рагируются смесью хлороформ - метанол . Это указ ывает на наличие лишь незначительного числа ковалентных связей между липидами и белк овыми элемент а ми или даже на полное их отсутствие ; этот факт свидетельству ет о высокой степени стабилизации липидов и белков мембранных структурах . Крейн показ ал , что цитохром с соединяется с фосфатиди лэтаноламином , образуя устойчивый комплекс . Возмож но , что именно так о е взаимодействи е липид - белок совместно с гидрофобными с вязями и обеспечивает такую стабилизацию мемб ранной структуры . Криддл и сотрудники выделил и мономерную форму , которую они назвали ст руктурным белком митохондриальной мембраны . При нейтральном рН стр у ктурный белок находится в полимерной форме и не раст ворим в воде . Мономерная форма имеет молек улярный вес около 22000, но тенденция к полиме ризации нарушает точность седиментационных и электрофоретических исследований . Структурный белок способен соединять с я с чистыми цитохромами а , Ь , и ее образованием раство римых в воде комплексов в молярном отноше нии 1:1, причем условия этого взаимодействия для каждого случая различны . Предполагается , что в таких комплексах образуются преимущественн о гидрофобные связи . Д а лее , оказал ось , что структурный белок соединяется с ф осфолипидами . Таким образом , структурный белок способен к взаимодействию с двумя другими основными молекулярными элементами мембраны - с переносчиками электронов и с фосфолипидами . Склонность цитохромов, флавопротеидов и структурного белка к существованию в моном ерной и полимерной формах указывает на вы раженную тенденцию этих молекул к образованию очень устойчивых макромолекулярных ансамблей , имеющих пластинчату ю структуру. Так ка к для будущих исследовани й наибольший интерес представляет цитохром с , то следует уделить особое внимание именно этому фер менту. Этот цитохром о тличается от остальных тем , что он легко экстрагируется из митохондрий в растворимой форме с помощью кислот и нейтральных растворов солей . Молекулярный вес кристал лического фермента 12000, изоэлектрическая точка при высоком рН ; в молекулу входит одна же лезопорфириновая группа , которая представлена про изводным протопорфирина и соединена (ковалентно ) с двумя цистеиновыми остатками пептидной ц епи , посредством двух тиоэфирных связей. При рН 7,0 ато мы железа в положениях 5 и 6, очевидно , коорд инированы с остатками гистидина ; при нейтраль ных значениях рН цитохром с не имеет тенденции реагировать с кислородом . Известно , что третичная структура цито хрома с резко изменяется , как функция состояния окисления - восстановле ния. Цитохром с восстанавливается тиолами , аскорбатом , хинола ми , и восстановленными цитохромами b и с 1, а восстановленный цитохром с окисляется феррициа нидом , некоторыми красителями и ц итохромо м а. Было показано , что в водных растворах цитохром с способен к полимеризации ; удал ось получить его димер и очистить так же тример и тетрамер . Вторичная и трети чная структура цитохрома с изучается методом рентгеностру ктурного анализа . Цитохром с л егко сое диняется с липидами , в частности с фосфати дилэтаноламином он образует комплекс , названный липоцитохромом с. Описание общих принципов различных методов выделения митохонд рий. Митохондрии и после выделения сохраняют свой вид , не смотря на то , что м ембраны их неск олько повреждаются и контуры сглаживаются . В сущности , в наше время их выделяют те м же самым способом , которым пользовался е ще Варбург . Прежде всего ткани гомогенизируют , используя для этого изотонический или ги пертонический раствор сахароз ы (сахароза способствует сохранности митохондрий , стабилизир уя митохондриальную мембрану ). Затем методом д ифференциального центрифугирования отделяют ядра и неразрушенные клетки , а полученную надосадо чную жидкость вновь центрифугируют при более высоких ско р остях . Митохондрий ос едают при этом на дно , образуя плотный буроватый осадок . Промыв этот осадок нескол ько раз можно получить довольно чистую ми тохондриальную фракцию . Таким путем очищенные фракции митохондрий были выделены из самых различных клеток живот н ого и р астительного происхождения и даже из некоторы х простейших. В более ранних исследованиях митохондрий , как правило , получ али из печени животных , так как её кле тки очень легко разрушить , а так же по тому , что она богата митохондриальной фракцие й . После того , как было обнаружено , чт о бактериальная протеиназа разрушает клетку , не повреждая митохондрий , был разработан прос той и быстрый метод получения мышечных ми тохондрий . Сахароза способствует сохранности мито хондрий , стабилизируя митохондриальную мембран у . Гомогенизация материала . Методы гомогенизации : • Разрушение клеток (гомогениз атор Даунса 5-12 мл + плотно прилегающий пестик ). Гипотонический шок + гомогенизатор. • Метод основанный на кавитации газов ( клеточная суспензия обогащенная газообразным азотом на 15-30 минут выдерживается при давлении до 65 атм ., при быстром понижении давления до атмосферного , вследствие выделения азота про исходит разрушение клеток . Органеллы остаются интактными ). • Ультр азвук. Состав среды в которой разрушают клетки оп ределяется применяемым методом гомогенизации . Для разрушен ия тканей используют изоосмотический раствор сахарозы из расчета 100 мл на 10 г сырого веса ткани , при этом нестрашно если раство ра сахарозы будет немного больше , особенно при центрифугировании в р о торе с большим объемом . Гипотоническая среда спосо бствует разрушению клеток , но , если обработка длится слишком долго , при этом может происходить разрушение клеточных органелл . Осталь ные параметры среды трудно обобщить и каж дый мембранный препарат требует и нд ивидуального подхода . Разделение субклеточных компонентов . • Центрифугирова ние. Основан на разл ичиях по скорости седиментации (определяется весом , размером и формой частиц ). Вещество , используемое для приготовления градиента должно быт ь легко растворимо в воде , физ иологически безвредно и химически инертно ; ег о раствор должен быть невязким , прозрачным в видимой и УФ-областях спектра , должен создавать низкое осмотическое давление . Обычно разделение субклеточных компонентов проводят в гра д иенте плотности сахарозы . Он удовлетворяет большинству указанных требований , но при высоких концентрациях он весьма вязок . Как правило разделение осуществляется за 3-4 часа или в течение ночи при 80.000 д или выше в роторе с подвесными ст аканчиками. Обрабо тка гомогената из печени крысы 10 мМ фосфатом калия увеличивает скорость седиментац ии митохондрий , не влияя на осаждение лизо сом , что позволяет очищать последние в гра диенте плотности перколла. • Разделение в двухфазной системе , содержащей два полимера. Полезным и быст рым способом выделения мембран является разде ление их в водной двухфазной системе декс тран - полиэтиленгликоль (ПЭГ ), особенно если от сутствуют необходимые ультрацентрифуги и роторы . Метод , продуктивность которого может быть легко повышена, основан на использов ании целого ряда свойств мембран , включая электрический заряд , плотность , массу и гидроф обность . Различие в этих свойствах обуславлив ает разное распределение компонентов смеси ме жду верхней и нижней фазами и поверхность ю раздела . По ср о дству к верхн ей фазе компоненты животной клетки располагаю тся в следующем порядке : эндоплазматический р етикулум / митохондрий / лизосомы / аппарат Гольджи / плазматические мембраны Успех в применении фазовых систем зависит от адекватности выб ора их состав а . Качество разделения зависит не только от конкретного полимер а (пока число их ограничено - в основном используют декстран и ПЭГ ), но и от других параметров : молекулярной массы полимера , концентрации солей , рН , химической модификации полимера. • Электрофор ез. С помощью в ысоковольтного электрофореза в свободном потоке можно получить препараты субклеточных мембра н и органелл высокой степени чистоты . Подл ежащую разделению смесь компонентов подают то нкой струйкой в разделяющий буфер , который движется в электрич еском поле ; мембраны , несущие разный электрический заряд перемеща ются в разделяющей ячейке со скоростью , оп ределяемой их зарядом , при этом достигается 100 %-ное разрешение . Это мягкий способ выделен ия мембран с высоким препаративным выходом . Методику элек т рофореза в свободном потоке впервые применили для выделения л изосом и митохондрий из печени крысы. Таблица 1. Фермент ы - маркеры митохондрий Фракция М аркерный фермент Митохондрии Внутренняя мембрана Сук цинатдегидрагеназа , Цитохромкидаза , Ротеном-нечувст вительная NADH – цитохром с – редуктаза Митохондрии Н аружная мембрана Моноаминооксидаза , Кинуренин -3-гидроксилаза В таблице 1 приведены ферментные маркеры , к которым относятся сравнительно стабильные ферменты , активность которых достаточно высо ка и ее удобно измерять . Обычно эти измерения проводят как можно быстрее пос ле выделения ; образец при этом хранят при 40С и не замораживают . Отмечено , что та кой фермент , как цитохром с - редуктаза мож ет оказаться лабильным и терять активность в замороженных препа р атах мембран из печени . Для правильной оценки распреде ления фермента-маркера весьма существенным являет ся пространственное расположение субстрат-связывающег о сайта . Методики Субфракционирование мембран и компонентов матрикса митохондрий. Митохондрии выд еляют из многочисленных источников станда ртными методами . Субфракционирование их для п олучения внутренних и наружных мембран и компонентов матрикса проводят после замораживани я - оттаивания препарата и / или обработки у льтразвуком стандартного осадка мито х ондрий , суспендированных в среде , содержащей 1.2 М сахарозы и 2 мМ АТР (10 мг мембранного б елка на 1 мл ). При этом происходит разрушени е митохондрий , а после центрифугирования в ступенчатом градиенте плотность сахарозы наруж ные мембраны концентрируются в п оло се 0,45-1,12 М сахарозы , внутренние мембраны и ко мпоненты матрикса собираются в осадке , под нижним слоем с концентрацией сахарозы 1,2 М , а промежуточная везикулярная фракция - между двумя предыдущими , в полосе 1,12-1,20М. Маркерами внутр енних митохондри альных мембран служат фер менты - переносчики электронов . Наружная митохондри альная мембрана , которая при фрагментации обр азует везикулы , сходные по плотности и мор фологии с везикулами из плазматической мембра ны содержит моноаминооксидазу . Описан также м ет о д выделения наружных митохондриаль ных мембран из печени крыс . Метод противоточного распределения митохондр ий. Препараты митохо ндрий , выделенные из печени крысы , были ис следованы Эрикссоном с помощью метода противо точного распределения . Митохондрий , вход ящие в состав каждого из этих препаратов , мо жно разделить на две основные популяции . О днако элетронно-микроскопическое исследование не позволило обнаружить никаких различий в струк туре этих частиц. Рабочая методик а выделения митохондрий из печени крыс. • Среда выдел ения : 0,25 М раствор сахарозы , содержащий 0,001 М Э ДТА , рН 7,4 • Сахароза - 0,25 М раствор • НС 1 - 1 н и 0,1 н растворы • КОН - 1 н и 0,1 н растворы Все реактивы готовятся на бидистиллированной воде. Изолированную печень крысы погружают в 30 мл ледяной среды выделения . После 2 х - Зх кратного промывания ткань измельчают ножницами на чашке Петри , стоящей на ль ду . Кашицу вновь помещают в стаканчик со свежей средой выделения и тщательно пром ывают . После оседания кусочков ткани на дн о , жидкост ь осторожно сливают и промывание повторяют еще дважды . Ткань перено сят в гомогенизатор , добавляют 40 мл среды в ыделения и измельчают в течение 30 - 40 секунд . К гомогенату добавляют 40 мл среды выделения , перемешивают медленно вращающимся пестиком и разлив а ют его в 2 центрифужных стакана . Центрифугируют в течение 10 минут пр и 0-2 ОС , при 600 д для удаления обломков кл еток и ядерной фракции. Супернатант осторожно сливают и хранят на льду , остатки объединяют и вновь гом огенизируют 20 секунд в 20 мл среды выдел ения . Гомогенат центрифугируют при 600 д 10 минут , супернатант объединяют с полученным ранее. Для осаждения митохондрии , объединенный с упернатант центрифугируют в двух стаканах при 14000 g в течение 10 минут . Остатки объединяют в одном стакане и тщательно суспендируют с помощью пипетки на 1 мл в небольшом объеме среды выделения (около 0,5 мл ). .Маленькими по рциями , при осторожном встряхивании добавляют 10 мл среды выделения и осаждают митохондрии (14000 g, 10 минут ). Осадок суспендируют в 0,25 М сахароз е , н е содержащей ЭДТА , и вновь центрифугируют (14000 g, 10 минут ). Супернатант сливают , н а полученный осадок митохондрии осторожно нас лаивают 0,2 - 0,3 мл 0,25 М сахарозы . Легким встряхивание м смывают верхний рыхлый слой осадка . Проц едуру повторяют еще дважды и получ енный плотный осадок митохондрии тщательно су спендируют с помощью пипетки в 0,4 - 0,5 мл 0,25 М сахарозы . Густую суспензию митохондрии перенося т в пробирку и хранят на льду . Заключение В данн ой работе предложены различные методики выдел ения ми тохондрии из печени крыс , но использоваться будет метод с применением у льтрацентрифугирования , как наиболее приемлемый и удовлетворяющий критериям простоты работы и необходимой степени чистоты продукта. В дальнейшем планируется фотометрическое изучение вли яния этидиум бромида на а ктивность цитохрома с из митохондрии печени крыс . Данная работа представляет практически й интерес , так как цитохром с является индуктором апоптоза - программированной гибели клеток . Механизмы этого процесса в настоящее время предс т авляют большой интер ес (для лечения онкологических заболеваний ). Список литерату ры 1. Альбертсон Пер-Оке "Разделение клеточных частиц и макромолекул ", Москва , 1974 2. Боуэн Т . "Введение в ультрацентрифугирование ", Москва , 1973 3. Под ред . Гилярова М. С . "Биология . Большой энцикл опедический словарь ", Москва , 1998 4. Ленинджер А . "Митохонрия " Москва "Мир ", 1966 5. Решетников В.Н . и др . "Техника биохимического исследован ия субклеточных структур и биополимеров " т .2, Минск , 1977 6. Эванз У . Г . "Биологиче ские мембраны . Методы ", Мо сква , 1990