Вход

Изменения окислительно-восстановительного потенциала среды

Реферат по биологии
Дата добавления: 23 января 2002
Язык реферата: Русский
Word, rtf, 615 кб
Реферат можно скачать бесплатно
Скачать
Данная работа не подходит - план Б:
Создаете заказ
Выбираете исполнителя
Готовый результат
Исполнители предлагают свои условия
Автор работает
Заказать
Не подходит данная работа?
Вы можете заказать написание любой учебной работы на любую тему.
Заказать новую работу

Изменения оки слительно-восстановительного потенциала среды культив и рования устойчивой к тяжелым металлам бактерии Pseudomonas diminuta : взаимосвязь с выделением из клеток металлотионеинподобных белков Особое положение тяжелых металлов (ТМ ) среди загрязнителей связано как с возможностью их накопления организмами и передач и по пищевым цеп ям , так и с высокой токсичностью (Reddy, Prasad, 1990). Воз действие ТМ прежде всего сказывается на п ервичных продуцентах - микроводорослях и цианобакт ериях , которые наравне с гетеротрофными микро организмами могут использоваться для детокси к ации и извлечения ценных металло в , поскольку способны аккумулировать их из водной среды и донных отложений в коли честве , многократно превышающем потребность в них , как в компонентах минерального питания (Nagase et al., 1994). Наибольшей устойчивостью к ТМ отличаются микроорганизмы , выделенные в м естах , содержащих промышленные загрязнения , либо месторождения соответствующего металла (Горленко и др ., 1977). Ванадий , как один из широко распростра ненных ТМ , используется зелеными , желто-зелеными и бурыми водорос лями , содержится в альтернативных нитрогеназах некоторых почвенных бактерий , но не является необходимым элементо м для развития большинства прокариотных микро организмов , среди которых наиболее активными биоаккумуляторами ванадия являются бактерии рода Pseud omonas , а также ряд цианобактерий (Rehder, 1991). Его токсический э ффект обусловлен главным образом тем , что восстанавливаясь в клетках , он стимулирует об разование свободнорадикальных состояний О 2 (Popper et al., 1991). Ионы ТМ образуют меркаптиды с SH-гру ппами тиоловых соединений клеток : реакция обратима , но равновесие ее смещено в сторону слабодиссоциирующих металлтиолатов (Торчински й , 1977). Устойчивость фототрофных и других микроор ганизмов к действию ТМ в наибольшей степе ни обусловлена специфическим св я зыван ием основной части поглощенных клетками ТМ смежными остатками цистеина в молекуле спе циализированных белков - металлотионеинов (МТ ). Общи м для этих белков является молекулярная м асса до 10 кДа и высокое содержание тиоловы х групп . В спектре оптическог о п оглощения МТ в УФ-области около 250 нм , наблю даются типичные для металлтиолатных комплексов ши pокие полосы , которые исчезают п pи удалении металла (Ang, Wong, 1992). Цианобактерии , культивируемые в присутствии высоких концентраций ванадата синтезируют св я зывающий ионы мет алла МТ второго класса (Саванина и др ., 1995). В настоящей работе установлена корреляция между зависимым от ванадата накоплением в среде культивирования бактерий Ps. diminuta низкомолекулярных , богатых SH-группами белков и изменениями окис л ительно-восстановительного потенциала (E h ) среды. Материалы и методы В работе исп ользовали гетеротрофные бактерии , выделенные из придонного осадка ванадийсодержащего промышленного водоема и идентифицированные нами как Ps. diminuta (Саванина и др ., 1998). Бактерии культивировали при температур е 25-27° в конических колбах на среде , сод ержащей в 100 мл водопроводной воды глюкозу и пептон в концентрации по 1 г /л (pH 7,2). Для определения в культуральной жидкости Ps. diminuta содержания низкомолекулярных белков и SH-групп пробы диализовали 24 час при 0о против 50 мМ Тр ис -HCl буфера , pH 7,6, включающего 10 мМ ЭДТА с испол ьзованием мембраны фирмы Serva (Германия ) с диаметр ом пор , пропускающих молекулы массой <10-15 кД . В присутствии ЭДТА , сульфгидрильные группы М Т и других SH-содержащих соединений освобождаются от большей части связанного ванадия и становятся реакционноспособными. Плотность клеточных суспензий определяли нефелометрически при 540 нм на спектрофотометре фирмы Hitachi (Япония ), модель U-2000. Для опре деления концентрации ванадия в биологическом материа ле и культуральной жидкости использовали цвет ную реакцию ванадия с 4-(2-пиридилазо )-резорцином . Клетки предварительно трижды отмывали от среды культивирования и озоляли азотной ки слотой . Оптическую плотн о сть измеряли на том же спектрофотометре при 520 нм и спользуя коэффициент молярной экстинкции 24500 М -1 см -1 . Содержание диализованных низкомол екулярных белков определяли по Лоури (Lowry et al., 1951). Ко нцентрацию тиоловых групп в этих белках и других соеди нениях определяли с реак тивом Элмана (5,5'-дитиобис (2-нитробензойная ) кислота ) в присутствии ЭДТА (Веревкина и др ., 1977) и регистрировали при длине волны 412 нм на том же спектрофотометре используя коэффициент молярной экстикции 11400 М -1 см -1 . Величины pH и E h среды култивирования измеряли на элект рометре фирмы Cole-Parmer (США ), модель DigipHase, pH определяли с помощью комбинированного стеклянного электрода с двойным Ag/AgCl электродом сравнения фирмы Radiometer (Голландия ); для определения E h использова ли Pt-электрод , а в качестве электрода сравнения - Ag/AgCl (оба эл ектрода Российского производства ); потенциал элект рода сравнения относительно нормального водородн ого электрода , измеренный как в работе (Barsky, Samuilov, 1979), составляет 225± 10 мВ . Таки м образ ом , истинная величина E h среды представляет собой сумму из меряемой величины E h и потенциала электрода сравнения. Рис . 1. Эффект ванадата на рост культуры Ps. diminuta ; 1 - контроль ; 2, 3 - в прису тствии 100 и 700 мг /л ванадата соответственно. Результаты и их обсуждение Клетки Ps. diminuta , изолированные из пробы придонного осадка промышл енного во доема , сбросовые воды которого содержат как отходы металлургического производства ванадий в концентрации 100-700 мг /л , хорошо растут как без ванадата , так и в его присутствии ; при этом максимальное количество клеток бактерий достигает 2x10 7 кл /мл среды через 12-16 суток кул ьтивирования (рис . 1). Ванадат в концентрации 700 мг /л снижает накопление биомассы Ps. diminuta на 30-40%. В дальнейших опытах ванадат добавляли в концентрации 100 мг /л , поскольку не оказывая заметного влияни я на рост бактерий , в анадат в этой концентрации значительно стимулировал выделение из клеток низкомолекулярных белков. Применение метода диализного (смешанно-раздель ного ) культивирования фототрофных микроорганизмов - цианобактерий или микроводорослей с гетеротро фными бактериям и рода Pseudomonas (Гусев и др ., 1988) позволило выявить ряд закономерностей рост а двух различных культур , разделенных полупро ницаемой мембраной . При культивировании фототрофн ого компонента в присутствии ванадата клетки активно выделяют в среду углеводы и гликолат . Эти соединения используются для роста гетеротрофным компонентом в ка честве субстратов окисления . При этом бактери и эффективно поглощают ванадат , существенно с нижая его концентрацию в среде (Саванина и др ., 1994; Гусев и др ., 1997). Рис . 2. Содержан ие ванадата в клетках (1) и в среде (2) в зависимости от возраста культуры Ps. diminut a . Действительно , ка к показывают наши опыты содержание ванадата в клетках Ps. diminuta , в течение первых 2 суток культивировани я быстро увеличивается от 0 до 5-6 мкг /млн клеток , а затем снижается приблизительно в 10 раз (рис . 2, кривая 1). Иная картина наб людается относительно концентрации ванадата в культуральной жидкости . За первые двое суток культивирования Ps. diminuta содержание ванадата в среде па дает от 100 до 10-12 мг /л , а затем начинает постепенно увеличиваться по мере развития культуры ; причем в с реду возвращается до 60% ванадата (рис . 2, кривая 2). Как видно , нако пление ионов ванадия в клетках коррелирует c его содержанием в культуральной жидкости : увеличение концентрации ванадата в клетках со провождается ее снижением в среде культивиров ания и на о борот. Столь значительное увеличение концентрации ванадата в среде по мере выхода кривой роста на стационарный уровень может быть обусловлено тем , что ванадат выделяется и з нативных и разрушенных клеток вместе с компонентами связывающими металл . Такими ком понентами прежде всего являются низкомоле кулярные богатые SH-группами белки ; могут быть и другие тиоловые соединения , к которым относятся глутатион , цистеин , тиогликолевая к ислота , дитиоэтанол , дитиопропанол и т.д. Известно , что специфическую устойчивость фототрофных микроорганизмов к действию ТМ обеспечивает наличие в клетках SH-содержащих белков с мол . м . до 10 кДа , связывающих большую часть поглощенных клетками ТМ (Obata et al., 1994). Содержание низкомолекулярных белков и корре лирующее с ним содержание SH-групп в клетках цианобактерий возрастает под дей ствием ванадата (Лебедева и др ., 1993). Выделенный из клеток Anacystis nidulans белок был идентифицирован к ак МТ II класса , связывающий ванадий (Саванина и др ., 1995). Известно , что МТ большинства про кари о т как правило состоят из одной полипептидной цепи с мол . м . до 7-10 кДа и высоким содержанием цистеина (в среднем до 30%) (Kagi, 1993). Клетки Ps. fluorescens выделяют в среду связывающие и оны Zn полипептиды с мол . м . 1-3,5 кДа . (Appana, Whitmore, 1995). П оскольку клетки Ps. diminuta выделены из ванадийсодержащего промыш ленного водоема и по данным рис . 1 устойчив ы к действию ванадата , представляет интерес определение содержания низкомолекулярных белков и SH-групп в культуральной жидкости Ps. diminuta в дина мике развития культуры. Рис . 3. Зависимо сть содержания низкомолекулярных белков (1, 2) и SH-групп (3, 4) в среде от возраста культу ры Ps. diminuta . 1, 3 - конт роль ; 2, 4 - в присутствии 100 мг /л ванадата. Как видно из рис . 3 в среде культивирования Ps. diminuta наблюдается накопление низкомолекулярных белков , содержание которых к 12 суткам со ставляет около 50 мкг /мл (кривая 1). В присутствии ванадата количество бе лка к этому периоду времени возрастает до 450 мкг /мл (кривая 2). Это согласуется с ра нее полученными данными о стимуляции синтеза МТ у цианобактерий (Лебедева и др ., 1993; С аванина и др ., 1995) и в клетках жив отных организмов (Gachot et al., 1994). Подобным образом ванадат стимулирует нако пление SH-групп низкомолекулярных белков и , возм ожно , других тиолсодержащих соединений в сред е культивирования Ps. diminuta (рис . 3, кривые 3 и 4); з ависимости сод ержания SH-групп в среде от возраста культу ры имеют колоколообразный характер с максимум ом , приходящимся на 8-9 сутки . Кажущееся несоотве тствие характеров накопления SH-групп и белка в среде (наличие спада в содержании SH-гр упп , тогда как по белку такого спада нет ), может быть обусловлено окислением SH-групп кислородом , которое должно значительно усиливаться при значениях pH выше 7, как это показано ранее для цистеина (Barsky et al., 1984). Действител ьно , в соответствии с нашими данными pH ку л ьтуры Ps. diminuta с возрастом увеличивается от 7 до 8,5; в присутствии ванадата величины pH на 0,3-0,5 единицы выше , чем в контроле. Рис . 4. Изменени я величины E h среды в динамике развития культуры Ps. diminuta . 1 - контроль ; 2 - в присутствии 100 мг /л ванадата. Колоколообразная зависимость накопления SH-групп в среде от возраста культуры Ps . diminuta сопровождается сходной зависимостью снижения E h среды . По мере развития культуры величина E h уменьшается и до стигает минимума (180-200 мВ ) к 6-8 суткам , а затем вновь возрастает (рис . 4, кривая 1). В присутст вии ванадата минимальное значение E h достигает 80 - 90 мВ (крив ая 2). Столь низкие значения E h в аэробных условиях могут быть обусловлены только наличием в среде значительных количеств тиолсодержащих соединений , стандартный редокс-потенциал которых в анаэробных условиях существенно ниже 0 мВ. Так , например , 1,4-дитиотреитол , эффективно восстанавливающий SH-группы ферментов и кофакторов , имеет ста ндартный потенциал -330 мВ при pH 7; сходными окислит ельно-восстановительными свойствами обладают тиоглико левая кислота , 2-меркаптоэтанол , димеркапто п ропанол и др . (Досон и др ., 1991). В отличие от тиолов такие соединения , как органические кислоты , имеют стандартные редокс-потенциалы в интервале от 50 до 250 мВ . Согласно нашим данным (рис . 5) для достижен ия величины E h о коло 200 мВ содержание аскорбата в среде в аэробных условиях должно составлять неск олько мМ (кривая 2), а в случае гликолата его концентрация при E h около 300 мВ достигает 200-400 мМ (кривая 3). Рис . 5. Зависимо сть величины E h от концентрации SH-групп цистеина , инкуби руемого в 20 мМ буфере морфолинопропансульфонате (pH 7,0). На рис . 5 также показана зависимость величины E h б уферного раствора от концентрации SH-групп цистеина (кривая 1). Ви дно , что величинам E h около 200 и 100 мВ соответствуют концентраци и SH-групп около 20 и 120 мкМ . Эти значения с огласуются с величинами E h (рис . 4) и концентрациями SH-групп (рис . 3) в культу ральной жидкости Ps. diminuta . Таким образом , полученная корреляции межд у содержанием ванадата в клетках и культу ральной жидкости Ps. diminuta , накоплением низкомолекулярных белков и SH-групп и изменениями E h среды культивирования бактерий позвол яют полага ть , что ионы ванадия , поглощ енные клетками Ps. diminuta стимулируют образование тионеинподобных бе лков , связываются с ними с участием SH-групп и выделяются из клеток вместе с белк ами , продуктами их деградации или с другим и тиоловыми соединениями. Список ли тературы 1. Веревкина И.В ., Точилкин А.И ., Попова Н.А . 1977. Современные методы в биохимии , М . 2. Горленко В.М ., Дубинина Г.А ., Кузнецов С.И . 1977. Экология водных микроорг анизмов , М . 3. Гусев М.В ., Вольберг М.М ., Лебедева А.Ф ., Савельев И.Б . 1988. Испол ь зование метода диализного культивирования для подбора симбиотических альгобактериальных пар // Биол . науки , № 1, 103-106. 4. Гусев М.В ., Лебедева А.Ф ., Саванина Я.В ., Барский Е.Л . 1997. Устойчивость культур цианобактерии Anacystis nidulans и микроводоросли Dunaliella maritima к токсическому действию в анадия : влияние фосфата , железа и цистеина //Вестн . МГУ . Сер . Биология , № 3, 12-17. 5. Досон Р ., Эллиот Д ., Эллиот У ., Джонс К . 1991. Справочник биохимика , М . 6. Лебедева А.Ф ., Саванина Я.В ., Савельев И.Б . 199 3. Распр eделение ван адия в клетках цианобактерий Anacystis nidulans и Nostoc muscorum : взаимосвязь с SH-содержащими низкомолеку лярными белками //Вестн . МГУ . Сер . Биология , № 4, 58-61. 7. Саванина Я.В ., Лебедева А.Ф ., Савельев И.Б . 1994. Смешанно-раздельное кул ьтивирование цианобактерий Anacystis nidulans и Nostoc muscorum и бактерий рода Pseudomonas в присутствии в анадия //Вестн . МГУ . Сер . Биология , № 2, 29-34. 8. Саванина Я.В ., Адани А.Г ., Лебедева А.Ф ., Савельев И.Б ., Гусев М.В . 1995. Образование ванадий- тионеина клетками Anacystis nidulans при высоких ко нцентрациях металла //Вестн . МГУ . Сер . Биология , № 1, 38-46. 9. Саванина Я.В ., Пахомкина Б.С ., Лебедева А.Ф ., Дольникова Г.А . 1998. Смешанн о-раздельное культивирование цианобактерий Anacystis nidulans , Ana baena variabilis и Nostoc muscorum с бактериями , выделенными из ванадийсодержащего промышленного водоема . Тез . докл . на V Международной конференции "Новые инфо рмационные технологии в медицине и экологии " Гурзуф . 10. Торчинский Ю.М . 1977. Сера в белках , М. 11. Ang S.G., Wong V.W. 1992. Chromatographic analysis of low-molecularmass copper-binding ligands from the crab-spesies Scylla serrata and Portunus pelagicus //J. Chromatogr., 599, № 1-2, 21-24. 12. Appana V.D., Whitmore L. 1995. Biotransformation of zi nc by Pseudomonas fluorescens //Microbios., 82, № 332, 149-155. 13. Barsky E.L., Samuilov V.D. 1979. Blue and red shifts of bacteriochlorophyll absorption band around 880 nm in Rhodospirillum rubrum //Biochim. Biophys. Acta, 548, 448-457. 14. Barsky E.L., Kamilova F.D., Samuillov V.D. 1985. Do cyanobacteria contain a membrane bound cysteine oxidase?//Z. Naturforsch, 40 c, 176-178. 15. Gachot B., Tauc M., Wanstoc F., Morat L., Poujeol Ph. 1994. Zinc transport and metallothionein induction in primary cultures of rabbit kidney proximal cells//Biochem. Biophys. Acta, 1191, № 2, 291-298. 16. Kagi J.N.R. 1993. Purification and primary struct ure of snail metallothionein. Similarity of the N-terminal sequence with histones H 4 and H 2 A//Eur. J. Biochem., 216, № 3, 739-746. 17. Lowry O., Rosenbourg R., Farr A., Randal R. 1951. Protein measurement with Folin phenol reagent//J. Biol. Chem., 193, 26 5-275. 18. Nagase H., Inthorn D., Miuamoto K. 1994. Use of photosynthetical organisms in biological purification//Jap. J. Toxicol. and Environ. Health, 40, № 6, 479-485. 19. Obata H., Inoue N., Imai K., Umebauashi M. 1994. Cadmium tolerance of calli indu ced from roots of plants with differences in cadmium tolerance//Soil. Sci. and Plant. Nutr., 40, № 3, 351-354. 20. Popper H.H., Woldrich A., Grigar E. 1991. Comparison of chromate and vanadate toxicity and its relationship to oxigen radical formation//Zen tralb. Hyg. und Umweltmed, 194, № 4, 373-379. 21. Reddy G.N., Prasad M.N.V. 1990. Heavy metal binding proteine. Polypeptide: occurence, structure, synthesis and function//Environ. Exp. Bot. 30, N 3. 251-264 Rehder D. 1991. Bioorganisme Chemie des Vanadium s//Angev. Chem., 103, № 2, 152-172.

© Рефератбанк, 2002 - 2018