Изменения оки слительно-восстановительного потенциала среды культив и рования устойчивой к тяжелым металлам бактерии Pseudomonas diminuta : взаимосвязь с выделением из клеток металлотионеинподобных белков Особое положение тяжелых металлов (ТМ ) среди загрязнителей связано как с возможностью их накопления организмами и передач и по пищевым цеп ям , так и с высокой токсичностью (Reddy, Prasad, 1990). Воз действие ТМ прежде всего сказывается на п ервичных продуцентах - микроводорослях и цианобакт ериях , которые наравне с гетеротрофными микро организмами могут использоваться для детокси к ации и извлечения ценных металло в , поскольку способны аккумулировать их из водной среды и донных отложений в коли честве , многократно превышающем потребность в них , как в компонентах минерального питания (Nagase et al., 1994). Наибольшей устойчивостью к ТМ отличаются микроорганизмы , выделенные в м естах , содержащих промышленные загрязнения , либо месторождения соответствующего металла (Горленко и др ., 1977). Ванадий , как один из широко распростра ненных ТМ , используется зелеными , желто-зелеными и бурыми водорос лями , содержится в альтернативных нитрогеназах некоторых почвенных бактерий , но не является необходимым элементо м для развития большинства прокариотных микро организмов , среди которых наиболее активными биоаккумуляторами ванадия являются бактерии рода Pseud omonas , а также ряд цианобактерий (Rehder, 1991). Его токсический э ффект обусловлен главным образом тем , что восстанавливаясь в клетках , он стимулирует об разование свободнорадикальных состояний О 2 (Popper et al., 1991). Ионы ТМ образуют меркаптиды с SH-гру ппами тиоловых соединений клеток : реакция обратима , но равновесие ее смещено в сторону слабодиссоциирующих металлтиолатов (Торчински й , 1977). Устойчивость фототрофных и других микроор ганизмов к действию ТМ в наибольшей степе ни обусловлена специфическим св я зыван ием основной части поглощенных клетками ТМ смежными остатками цистеина в молекуле спе циализированных белков - металлотионеинов (МТ ). Общи м для этих белков является молекулярная м асса до 10 кДа и высокое содержание тиоловы х групп . В спектре оптическог о п оглощения МТ в УФ-области около 250 нм , наблю даются типичные для металлтиолатных комплексов ши pокие полосы , которые исчезают п pи удалении металла (Ang, Wong, 1992). Цианобактерии , культивируемые в присутствии высоких концентраций ванадата синтезируют св я зывающий ионы мет алла МТ второго класса (Саванина и др ., 1995). В настоящей работе установлена корреляция между зависимым от ванадата накоплением в среде культивирования бактерий Ps. diminuta низкомолекулярных , богатых SH-группами белков и изменениями окис л ительно-восстановительного потенциала (E h ) среды. Материалы и методы В работе исп ользовали гетеротрофные бактерии , выделенные из придонного осадка ванадийсодержащего промышленного водоема и идентифицированные нами как Ps. diminuta (Саванина и др ., 1998). Бактерии культивировали при температур е 25-27° в конических колбах на среде , сод ержащей в 100 мл водопроводной воды глюкозу и пептон в концентрации по 1 г /л (pH 7,2). Для определения в культуральной жидкости Ps. diminuta содержания низкомолекулярных белков и SH-групп пробы диализовали 24 час при 0о против 50 мМ Тр ис -HCl буфера , pH 7,6, включающего 10 мМ ЭДТА с испол ьзованием мембраны фирмы Serva (Германия ) с диаметр ом пор , пропускающих молекулы массой <10-15 кД . В присутствии ЭДТА , сульфгидрильные группы М Т и других SH-содержащих соединений освобождаются от большей части связанного ванадия и становятся реакционноспособными. Плотность клеточных суспензий определяли нефелометрически при 540 нм на спектрофотометре фирмы Hitachi (Япония ), модель U-2000. Для опре деления концентрации ванадия в биологическом материа ле и культуральной жидкости использовали цвет ную реакцию ванадия с 4-(2-пиридилазо )-резорцином . Клетки предварительно трижды отмывали от среды культивирования и озоляли азотной ки слотой . Оптическую плотн о сть измеряли на том же спектрофотометре при 520 нм и спользуя коэффициент молярной экстинкции 24500 М -1 см -1 . Содержание диализованных низкомол екулярных белков определяли по Лоури (Lowry et al., 1951). Ко нцентрацию тиоловых групп в этих белках и других соеди нениях определяли с реак тивом Элмана (5,5'-дитиобис (2-нитробензойная ) кислота ) в присутствии ЭДТА (Веревкина и др ., 1977) и регистрировали при длине волны 412 нм на том же спектрофотометре используя коэффициент молярной экстикции 11400 М -1 см -1 . Величины pH и E h среды култивирования измеряли на элект рометре фирмы Cole-Parmer (США ), модель DigipHase, pH определяли с помощью комбинированного стеклянного электрода с двойным Ag/AgCl электродом сравнения фирмы Radiometer (Голландия ); для определения E h использова ли Pt-электрод , а в качестве электрода сравнения - Ag/AgCl (оба эл ектрода Российского производства ); потенциал элект рода сравнения относительно нормального водородн ого электрода , измеренный как в работе (Barsky, Samuilov, 1979), составляет 225± 10 мВ . Таки м образ ом , истинная величина E h среды представляет собой сумму из меряемой величины E h и потенциала электрода сравнения. Рис . 1. Эффект ванадата на рост культуры Ps. diminuta ; 1 - контроль ; 2, 3 - в прису тствии 100 и 700 мг /л ванадата соответственно. Результаты и их обсуждение Клетки Ps. diminuta , изолированные из пробы придонного осадка промышл енного во доема , сбросовые воды которого содержат как отходы металлургического производства ванадий в концентрации 100-700 мг /л , хорошо растут как без ванадата , так и в его присутствии ; при этом максимальное количество клеток бактерий достигает 2x10 7 кл /мл среды через 12-16 суток кул ьтивирования (рис . 1). Ванадат в концентрации 700 мг /л снижает накопление биомассы Ps. diminuta на 30-40%. В дальнейших опытах ванадат добавляли в концентрации 100 мг /л , поскольку не оказывая заметного влияни я на рост бактерий , в анадат в этой концентрации значительно стимулировал выделение из клеток низкомолекулярных белков. Применение метода диализного (смешанно-раздель ного ) культивирования фототрофных микроорганизмов - цианобактерий или микроводорослей с гетеротро фными бактериям и рода Pseudomonas (Гусев и др ., 1988) позволило выявить ряд закономерностей рост а двух различных культур , разделенных полупро ницаемой мембраной . При культивировании фототрофн ого компонента в присутствии ванадата клетки активно выделяют в среду углеводы и гликолат . Эти соединения используются для роста гетеротрофным компонентом в ка честве субстратов окисления . При этом бактери и эффективно поглощают ванадат , существенно с нижая его концентрацию в среде (Саванина и др ., 1994; Гусев и др ., 1997). Рис . 2. Содержан ие ванадата в клетках (1) и в среде (2) в зависимости от возраста культуры Ps. diminut a . Действительно , ка к показывают наши опыты содержание ванадата в клетках Ps. diminuta , в течение первых 2 суток культивировани я быстро увеличивается от 0 до 5-6 мкг /млн клеток , а затем снижается приблизительно в 10 раз (рис . 2, кривая 1). Иная картина наб людается относительно концентрации ванадата в культуральной жидкости . За первые двое суток культивирования Ps. diminuta содержание ванадата в среде па дает от 100 до 10-12 мг /л , а затем начинает постепенно увеличиваться по мере развития культуры ; причем в с реду возвращается до 60% ванадата (рис . 2, кривая 2). Как видно , нако пление ионов ванадия в клетках коррелирует c его содержанием в культуральной жидкости : увеличение концентрации ванадата в клетках со провождается ее снижением в среде культивиров ания и на о борот. Столь значительное увеличение концентрации ванадата в среде по мере выхода кривой роста на стационарный уровень может быть обусловлено тем , что ванадат выделяется и з нативных и разрушенных клеток вместе с компонентами связывающими металл . Такими ком понентами прежде всего являются низкомоле кулярные богатые SH-группами белки ; могут быть и другие тиоловые соединения , к которым относятся глутатион , цистеин , тиогликолевая к ислота , дитиоэтанол , дитиопропанол и т.д. Известно , что специфическую устойчивость фототрофных микроорганизмов к действию ТМ обеспечивает наличие в клетках SH-содержащих белков с мол . м . до 10 кДа , связывающих большую часть поглощенных клетками ТМ (Obata et al., 1994). Содержание низкомолекулярных белков и корре лирующее с ним содержание SH-групп в клетках цианобактерий возрастает под дей ствием ванадата (Лебедева и др ., 1993). Выделенный из клеток Anacystis nidulans белок был идентифицирован к ак МТ II класса , связывающий ванадий (Саванина и др ., 1995). Известно , что МТ большинства про кари о т как правило состоят из одной полипептидной цепи с мол . м . до 7-10 кДа и высоким содержанием цистеина (в среднем до 30%) (Kagi, 1993). Клетки Ps. fluorescens выделяют в среду связывающие и оны Zn полипептиды с мол . м . 1-3,5 кДа . (Appana, Whitmore, 1995). П оскольку клетки Ps. diminuta выделены из ванадийсодержащего промыш ленного водоема и по данным рис . 1 устойчив ы к действию ванадата , представляет интерес определение содержания низкомолекулярных белков и SH-групп в культуральной жидкости Ps. diminuta в дина мике развития культуры. Рис . 3. Зависимо сть содержания низкомолекулярных белков (1, 2) и SH-групп (3, 4) в среде от возраста культу ры Ps. diminuta . 1, 3 - конт роль ; 2, 4 - в присутствии 100 мг /л ванадата. Как видно из рис . 3 в среде культивирования Ps. diminuta наблюдается накопление низкомолекулярных белков , содержание которых к 12 суткам со ставляет около 50 мкг /мл (кривая 1). В присутствии ванадата количество бе лка к этому периоду времени возрастает до 450 мкг /мл (кривая 2). Это согласуется с ра нее полученными данными о стимуляции синтеза МТ у цианобактерий (Лебедева и др ., 1993; С аванина и др ., 1995) и в клетках жив отных организмов (Gachot et al., 1994). Подобным образом ванадат стимулирует нако пление SH-групп низкомолекулярных белков и , возм ожно , других тиолсодержащих соединений в сред е культивирования Ps. diminuta (рис . 3, кривые 3 и 4); з ависимости сод ержания SH-групп в среде от возраста культу ры имеют колоколообразный характер с максимум ом , приходящимся на 8-9 сутки . Кажущееся несоотве тствие характеров накопления SH-групп и белка в среде (наличие спада в содержании SH-гр упп , тогда как по белку такого спада нет ), может быть обусловлено окислением SH-групп кислородом , которое должно значительно усиливаться при значениях pH выше 7, как это показано ранее для цистеина (Barsky et al., 1984). Действител ьно , в соответствии с нашими данными pH ку л ьтуры Ps. diminuta с возрастом увеличивается от 7 до 8,5; в присутствии ванадата величины pH на 0,3-0,5 единицы выше , чем в контроле. Рис . 4. Изменени я величины E h среды в динамике развития культуры Ps. diminuta . 1 - контроль ; 2 - в присутствии 100 мг /л ванадата. Колоколообразная зависимость накопления SH-групп в среде от возраста культуры Ps . diminuta сопровождается сходной зависимостью снижения E h среды . По мере развития культуры величина E h уменьшается и до стигает минимума (180-200 мВ ) к 6-8 суткам , а затем вновь возрастает (рис . 4, кривая 1). В присутст вии ванадата минимальное значение E h достигает 80 - 90 мВ (крив ая 2). Столь низкие значения E h в аэробных условиях могут быть обусловлены только наличием в среде значительных количеств тиолсодержащих соединений , стандартный редокс-потенциал которых в анаэробных условиях существенно ниже 0 мВ. Так , например , 1,4-дитиотреитол , эффективно восстанавливающий SH-группы ферментов и кофакторов , имеет ста ндартный потенциал -330 мВ при pH 7; сходными окислит ельно-восстановительными свойствами обладают тиоглико левая кислота , 2-меркаптоэтанол , димеркапто п ропанол и др . (Досон и др ., 1991). В отличие от тиолов такие соединения , как органические кислоты , имеют стандартные редокс-потенциалы в интервале от 50 до 250 мВ . Согласно нашим данным (рис . 5) для достижен ия величины E h о коло 200 мВ содержание аскорбата в среде в аэробных условиях должно составлять неск олько мМ (кривая 2), а в случае гликолата его концентрация при E h около 300 мВ достигает 200-400 мМ (кривая 3). Рис . 5. Зависимо сть величины E h от концентрации SH-групп цистеина , инкуби руемого в 20 мМ буфере морфолинопропансульфонате (pH 7,0). На рис . 5 также показана зависимость величины E h б уферного раствора от концентрации SH-групп цистеина (кривая 1). Ви дно , что величинам E h около 200 и 100 мВ соответствуют концентраци и SH-групп около 20 и 120 мкМ . Эти значения с огласуются с величинами E h (рис . 4) и концентрациями SH-групп (рис . 3) в культу ральной жидкости Ps. diminuta . Таким образом , полученная корреляции межд у содержанием ванадата в клетках и культу ральной жидкости Ps. diminuta , накоплением низкомолекулярных белков и SH-групп и изменениями E h среды культивирования бактерий позвол яют полага ть , что ионы ванадия , поглощ енные клетками Ps. diminuta стимулируют образование тионеинподобных бе лков , связываются с ними с участием SH-групп и выделяются из клеток вместе с белк ами , продуктами их деградации или с другим и тиоловыми соединениями. Список ли тературы 1. Веревкина И.В ., Точилкин А.И ., Попова Н.А . 1977. Современные методы в биохимии , М . 2. Горленко В.М ., Дубинина Г.А ., Кузнецов С.И . 1977. Экология водных микроорг анизмов , М . 3. Гусев М.В ., Вольберг М.М ., Лебедева А.Ф ., Савельев И.Б . 1988. Испол ь зование метода диализного культивирования для подбора симбиотических альгобактериальных пар // Биол . науки , № 1, 103-106. 4. Гусев М.В ., Лебедева А.Ф ., Саванина Я.В ., Барский Е.Л . 1997. Устойчивость культур цианобактерии Anacystis nidulans и микроводоросли Dunaliella maritima к токсическому действию в анадия : влияние фосфата , железа и цистеина //Вестн . МГУ . Сер . Биология , № 3, 12-17. 5. Досон Р ., Эллиот Д ., Эллиот У ., Джонс К . 1991. Справочник биохимика , М . 6. Лебедева А.Ф ., Саванина Я.В ., Савельев И.Б . 199 3. Распр eделение ван адия в клетках цианобактерий Anacystis nidulans и Nostoc muscorum : взаимосвязь с SH-содержащими низкомолеку лярными белками //Вестн . МГУ . Сер . Биология , № 4, 58-61. 7. Саванина Я.В ., Лебедева А.Ф ., Савельев И.Б . 1994. Смешанно-раздельное кул ьтивирование цианобактерий Anacystis nidulans и Nostoc muscorum и бактерий рода Pseudomonas в присутствии в анадия //Вестн . МГУ . Сер . Биология , № 2, 29-34. 8. Саванина Я.В ., Адани А.Г ., Лебедева А.Ф ., Савельев И.Б ., Гусев М.В . 1995. Образование ванадий- тионеина клетками Anacystis nidulans при высоких ко нцентрациях металла //Вестн . МГУ . Сер . Биология , № 1, 38-46. 9. Саванина Я.В ., Пахомкина Б.С ., Лебедева А.Ф ., Дольникова Г.А . 1998. Смешанн о-раздельное культивирование цианобактерий Anacystis nidulans , Ana baena variabilis и Nostoc muscorum с бактериями , выделенными из ванадийсодержащего промышленного водоема . Тез . докл . на V Международной конференции "Новые инфо рмационные технологии в медицине и экологии " Гурзуф . 10. Торчинский Ю.М . 1977. Сера в белках , М. 11. Ang S.G., Wong V.W. 1992. Chromatographic analysis of low-molecularmass copper-binding ligands from the crab-spesies Scylla serrata and Portunus pelagicus //J. Chromatogr., 599, № 1-2, 21-24. 12. Appana V.D., Whitmore L. 1995. Biotransformation of zi nc by Pseudomonas fluorescens //Microbios., 82, № 332, 149-155. 13. Barsky E.L., Samuilov V.D. 1979. Blue and red shifts of bacteriochlorophyll absorption band around 880 nm in Rhodospirillum rubrum //Biochim. Biophys. Acta, 548, 448-457. 14. Barsky E.L., Kamilova F.D., Samuillov V.D. 1985. Do cyanobacteria contain a membrane bound cysteine oxidase?//Z. Naturforsch, 40 c, 176-178. 15. Gachot B., Tauc M., Wanstoc F., Morat L., Poujeol Ph. 1994. Zinc transport and metallothionein induction in primary cultures of rabbit kidney proximal cells//Biochem. Biophys. Acta, 1191, № 2, 291-298. 16. Kagi J.N.R. 1993. Purification and primary struct ure of snail metallothionein. Similarity of the N-terminal sequence with histones H 4 and H 2 A//Eur. J. Biochem., 216, № 3, 739-746. 17. Lowry O., Rosenbourg R., Farr A., Randal R. 1951. Protein measurement with Folin phenol reagent//J. Biol. Chem., 193, 26 5-275. 18. Nagase H., Inthorn D., Miuamoto K. 1994. Use of photosynthetical organisms in biological purification//Jap. J. Toxicol. and Environ. Health, 40, № 6, 479-485. 19. Obata H., Inoue N., Imai K., Umebauashi M. 1994. Cadmium tolerance of calli indu ced from roots of plants with differences in cadmium tolerance//Soil. Sci. and Plant. Nutr., 40, № 3, 351-354. 20. Popper H.H., Woldrich A., Grigar E. 1991. Comparison of chromate and vanadate toxicity and its relationship to oxigen radical formation//Zen tralb. Hyg. und Umweltmed, 194, № 4, 373-379. 21. Reddy G.N., Prasad M.N.V. 1990. Heavy metal binding proteine. Polypeptide: occurence, structure, synthesis and function//Environ. Exp. Bot. 30, N 3. 251-264 Rehder D. 1991. Bioorganisme Chemie des Vanadium s//Angev. Chem., 103, № 2, 152-172.