Рестрикционное картирование

Введение Картирование генома – быстро развивающаяся обл асть исследований. Для ученых, избравших ее своей специальностью, это од новременно и хорошо, и плохо. Хорошо, поскольку это освобождает нас от нео бходимости соблюдать узкую направленность в своей работе, а плохо, поско льку мы пока незнаем, какой способ картирования дает наиболее реальную к артину структуры генома и, следовательно, какие данные больше соответст вуют истине. Оглядываясь на путь, пройденный нами в исследованиях по кар тированию, мы с сожалением должны констатировать: если бы пришлось начин ать все сначала, мы вряд ли бы двигались в том же направлении. Картирование генома подразумевает создание систематизированной библ иотеки клонов, которая полностью представляет геном и содержит набор генетических ма ркеров, достаточный, чтобы строить физическую и генетическую карты. По х оду исследований мы постепенно приближаемся к истинной структуре. В иде але карты, полученные разными способами, должны быть идентичными. Изучен ие структуры генома не требует обязательного построения рестрикционно й карты, однако некоторые способы картирования автоматически приводят к ее получению. Цель картирования – облегчать процедуру клонирования известных генов и способствовать поиску в геноме интересующих клонов. Наличие карты поз воляет легко соотносить друг с другом результаты разрозненных экспери ментов по локализации в геноме различных клонов. 1 . Стратегия 1 .1 Сравнение клонов В любом методе картирования генома центрально й процедурой является сравнение клонов, позволяющее выявить частичные перекрывания. Наиболее просто перекрывания можно обнаружить с помощью гибридизации. Однако саму по себе гибридизацию нельзя считать удовлетв орительным критерием взаимного соответствия клонов, так как имеющиеся в геноме, особенно у эукариот, диспергированные повторы могут давать лож ноположительные ответы. Кроме того, прямое сравнение пар – процедура слишком трудоемкая, чтобы использовать ее для реализации программы, тре бующей сопоставления большого количества клонов. Более приемлемым пре дставляется такой подход, который позволяет постепенно накапливать ин формацию о каждом клоне, а затем анализировать ее. Большинство методов картирования в настоящее время основано на обрабо тке ДНК генома одной или несколькими рестриктазами с последующим опред елением размеров образующихся фрагментов. Для этой цели предложен ряд м етодик. Вначале мы бы хотели коснуться приема, использованного нами при анализе структуры генома нематоды Caenorhabdltis elegans . Он получил название «метод отпеч атков пальцев» и подра зумевает использование неупорядоченных и неполных наборов фрагментов , которые являются характеристикой клона, хотя и описывают его неполност ью: фрагменты разделяют с помощью электрофореза в тонкослойном полиакр иламидном геле. 1 .2 Векторы Стратегия картирования основывается на анализ е случайно отобранных клонов. Совершенно ясно поэтому, что при картирова нии необходимо иметь как можно более обширную библиотеку клонов. Желате льно также, чтобы размер клонированных вставок позволял их использоват ь в дальнейшем в биохимической генетике. Первоначально мы выбрали для экспериментов космиды из-за сравнительно крупных размеров акцептируемой ДНК . С тех пор как более 10 лет назад Коллинс и Хон ввели в практик у первый космидный вектор , было сконструировано большое количество новых векторов такого рода. Среди них используемый в картировании Caenorhabdltis , векторы серии Lorist , разработанные Литлом и Кросс ом . Последние два имеют интересные структурные особенности, в частности наличие постоянного ч исла копий и, что еще более важно для описываемых здесь методов, присутст вие элементов, увеличивающих представительность клональных библиотек : терминаторов транскрипции, предотвращающих влияние векторных генов, в озможное при транскрипции клонированных вставок. Эти векторы содержат также промоторные последовательности фагов SP 6 и Т7, облегчающие считыв ание. Методы конструирования, расщепления и дефосфорилирования вектор ных ДНК описаны Маниатисом . Я2001 – единственный Я-вектор, использов анный при картировании Caenorhabditis . И хотя в этом случае вставка с оставляет только половину последовательности космидной вставки, клоны оказываются более стабильными. Наконец, для некоторых областей генома о тмечено более полное представительство именно в А-библиотеке . Недавно был получен вектор, с помощью которого можно конструировать иск усственные дрожжевые хромосомы . Это открытие сулит переворот в картировании: появляется в озможность клонировать фрагменты ДНК, на порядок превышающие по размер ам космидные вставки. Вероятно также, что соответствующие геномные библ иотеки окажутся более представительными. Метод «отпечатков пальцев» пока пригоден лишь для маленьких YAC , но , используя гибридизацию, можно будет присоединять к космидам и большие фрагменты. Скорее всего , в б удущем для картирования генома будет применяться техника подбора пар, с пециально разработанная для YAC . 1 .3 Селекция клонов Если создан банк клонов и разработана техника п одбора пар, остается только выбрать стратегию селекции для дальнейшего анализа клонов. Для небольших геномов более эффективно первоначально п одбирать клоны случайным образом. Затем, когда эта возможность исчерпыв ается, необходимо заполнить оставшиеся пробелы в карте с помощью гибрид изацион-ных или других методов. 2 . Экспериментальная часть Поскольку именно космидная библиотека является основ ой нашей работы, мы решили подробно описать здесь ее создание. Выделение геномной ДНК Представленный здесь пример – экстракция ДНК из нема тод. Этот метод универсален и включает минимум необходимых манипуляций. Червей выращивают в жидкой питательной среде , отмывают, быстро замораживаю т и хранят в жидком азоте, в аликвотах по 1 г. 1. Размельчите одну аликвоту до порошкообразного состо яния в ступке, охлажденной в жидком азоте, затем осторожно смешайте ее с 30 мл раствора, содержащего 100 мМ этил ен-диаминотетрауксусной кислоты , рН 8,0, 0, 5 % додецилсульфата натрия и 50 мкг/мл протеиназы К- 2. Инкубируйте 2 ч при 50 °С . 3. Охладите на льду, добавьте равный объем фенола и экстрагируйте 15 мин при 4 °С , медленно перемешивая. От центрифугируйте и осторожно удалите водный слой пипеткой с широким нос иком. 4. Добавьте два объема 9 5 % -ного спирта и осторожно намотайте ДНК на толстую ст еклянную палочку. Отмойте три раза 7 0 % -ным спиртом, высушите на воздухе и сус пендируйте в 3 мл раствора, содержащего 10 м м трис- HCl рН 7,4, 0,1 мМ ЭДТА . Для последующего эффективного получения космид не об язательно использование градиента CsCl . Приготовление фрагментов Чтобы избежать ошибок в процессе картирования путем п одбора пар по методу «отпечатков пальцев», важно не использовать при при готовлении фрагментов лигазную обработку. Мы предпочитаем двумерную э лектрофоретическую очистку выделению в градиенте плотности сахарозы, так как это дает более ясную картину распределения по размерам и достато чный выход эффективно клонируемых фрагментов. Для предотвращения ошибок, связанных с «концевыми эфф ектами», желательно при анализе библиотеки, полученной на основе частич ного гидролиза геномной ДНК, вводить ту же рестриктазу и в анализирующую рестрикционную систему. Так, например, частичная 5 а « ЗА1 - б иблиотека, анализируемая с помощью mdIII и S a « 3 AI , не будет давать артефак тов. Что касается космидных клонов, у которых фингерпринтные картины мог ут состоять из 20 – 30 полос, эт о требование необязательно, однако при картировании клонов концевые эф фекты вызывают серьезные затруднения. 1. Подберите необходимые условия для частичного гидрол иза . Выберите четыре ва рианта усиления жесткости обработки так, чтобы получались фрагменты тр ебуемого размера . 2. Гидролизуйте 4 аликвоты по 40 мкг свежеэкстрагированной ДНК. Образцы зам орозьте. 3. Перед проведением пре паративного электрофореза сравните небольшое количество образца с K / Hindlll - м аркерами, проведя электрофорез в 150 мл 0, 3 % -ного ага розного геля HGT ТАЕ , 1 В/см в течение 16 ч . Для корректного измерения размеров фрагментов все последующие определени я должны быть проведены в тех же условиях. 4. После требуемого гидролиза объедините аликвоты ДНК, проведите фенольн ую экстракцию и спиртовое осаждение. 5. Растворите в 180 мкл раствора ТЕ. Добавьте 60 мкл неде-натурирующего красит еля, нанесите в 16 лунок 0, 4 % -но го агарозного геля LGT ТАЕ . 6. Нанесите в качестве маркеров ТП и интактную ЯДНК- В препаративном геле э то не укажет вам точно размеры фрагментов, но поможет аккуратно отрезать полоски геля. Проведите электрофорез в течение 20 ч при 1 В/см и окрасьте ге ль бромидом этидия. 7. Результат электрофореза вы можете увидеть, поместив гель под длинново лновую ультрафиолетовую лампу . Отрежьте полоски по 2 мм шириной от всех 16 дорожек для отделения гидролизованного материала. 8 . Расплавьт е агарозный гель, нагревая в течение 10 мин тре буемые образцы при 68 °С в пластиковых пробирках . Проведите фен ольную экстракцию, сконцентрируйте изобутанолом до 0,3 мл, переосадите сп иртом и проанализируйте фрагменты, как указано выше. 9. Проведите повторн о препаративный LGT - г ель-электрофорез для очистки выбранной вами фра кции, экстрагируйте ее из требуемой полоски геля и окончательно проанал изируйте минимальную аликвоту в аналитическом варианте. Ожидаемый вых од – 2 – 4 мкг ДН К из 160 мкг материала. 10. Растворите в 20 мкл ТЕ. Смеси для упаковки космид В продаже имеется большое количество упаковочных сме сей, но из соображений экономии можно готовить их самим. Для этих целей мы с успехом использовали штаммы Escherichia coli : NS 428 и NS 433 . Упаков очные смеси, полученные нами, позволяли получить до 10 6 космидных рекомбинантов на 1 мкг вставочной ДНК- Получены сведения, что Есо К-активность в упаковочных смесях может влиять на репрезе нтативность Я-библиотек , однако нет данных, что это возможно и для космидных. Имеютс я в продаже коммерческие Есо К-упаковочные смеси . Соединение фрагментов с вектором Предлагаемый метод пригоден для лигирования частичны х гидролизатов Sau 3 Al в вектор Lorist 2. 1. Добавьте вместе 1 мкл BamHI - о бработанного де-фосфорилирова нного Lorist 2; 2 мкл приготовленных 5аиЗА1 - ф р агментов; 2 мкл 10 X лигазного буферного раствора; 2 мкл 10 мМ АТР, рН 7,4; 2 мкл 0,1 М дитиотрей-тола; 10 мкл воды и 1 мкл лигазы . Для достижения максимально возможного лигиров ания поместите смесь в закрытый капилляр. 2. Инкубируйте 16 ч при 14 °С . 3. Осторожно упакуйте, руководствуясь соответствующей методикой. 4. Храните библиотеку при 4 °С под хлороформом. 5. Разведите 5 мкл упакованной библиотеки в 0,1 мл раствора для разведения . Добавьте 0,2 мл стационарной культуры клеток. Мы использ уем для этих целей линию 1046 . Ее следует регулярно пересевать через отдельные колонии, контролируя признак reck . Инкубируйте 20 мин при 37 °С . Добавьте 0,5 мл раствора CY и проинкубируйте дополнительно 50 мин . Высейте разные объемы на чашки с канамицином . Ожидаемый выход – 10 5 – 10 6 рекомб инантов на 1 мкг вставочной ДНК. Заключение В настоящее время около 9 0 % генома С. elegans клонировано в космидах. Количес тво клонов, благодаря космидным стыковкам упало с 900 до 700 и снизилось еще при использовании YAC - с тыковок. Одна треть кажущихся ра зрывов между космидными цепочками на самом деле представляет собой еще невыявленные небольшие петли; существует большое количество реальных разрывов, для которых космидные клоны очень редки или недоступны для пол учения. В этом случае многие исследователи надеются решить проблему с по мощью больших цепочек . Мы осознаем всю важность и актуальность скорейшего заполнения разрыво в. Наш опыт подсказывает, что использование космид для картирования геном ов эукариот не лишено недостатков, хотя этот метод оказался очень удачны м, по крайней мере для одного прокариота . Весьма вероятно, что быстрое заполнение разрывов в кар те будет обеспечено методом YAC . Скорее всего , удастся получить Я-клоны, необходимые для более точного з аполнения брешей в космидной карте. Прописи растворов 1. ТЕ: 10 мМ трис- HCl рН 7,4, 0,1 мМ ЭДТА. 2. 10 X лигазный буфер: 0,5 М трис- HCl рН 7,4, 0,1 М MgCl 2 . 3. 10 X средне-солевой рестр икционный буфер: 500 мМ NaCl , 100 мМ трис- HCl рН 7,4, 100 мМ MgCl 2 , 10 мМ дитиотрейтола. 4. 10 X ТВЕ в г/л: 108 г . трис-основания, 55 г . борной кислоты, 9,3 г ЭДТА. 5. 50 X ТАЕ: 242 г . трис-основания, 57,1 мл ледяной уксусной кислоты, 100 мл 0,5 М ЭДТА рН 8,0, вода до 1 л . 6. 4 % -ный денатурирующий гель: 480 г . мочевины, 38 г . акриламида, 2 г бисакриламида, воды пр имерно 800 мл. Растворить при незначительном нагревании. Добавить 20 г . смолы Ам берлит МВ - 3 , медлен но перемешивать 1 ч . Профильтровать через стекл янный фильтр N2. Добавит ь 100 мл 10х ТВЕ и воды до 1 л . 7. Краситель с формамидо м : 100 мл деионизованного формамида, 0,1 г ксиленц ианола FF , 0,1 г бромфенолового синего, 0,3 г ЭДТА. 8. Прокипяченная РНКаза: 100 мг РНКазы А, 10 мл 10 мМ трис- HCl рН 7,4, 15 мМ NaCl . Инкубировать при 10 0 °С 15 мин . Охла дить, разлить по пробиркам, хранить образцы при – 2 0 °С . 9. 2Х TY - с реда в г/л: 16 г . триптона, 10 г . дрожжевого экстракта, 5 г NaCl . Довести рН до 7,4 . 10. CY - с реда в г/л: 10 г . казаминокислот, 5 г дрожжевого экстракта, 3 г NaCl , 2 г КС1. Довести рН до 7,0. 11. 20Х SSPE : 104 г . NaCl , 15,6 г NaH 2 P 0 4 X 2 H 2 0; 3,7 г ЭДТАх2Н 2 0; 25 мл 4 М NaOH и воды до 500 мл. 12. Буфер для разведения фага К: 10 мл 1 М трис- HCl рН 7,4, 5 мл 1 М MgS 0 4 , 11,7 г NaCl , 1 г желатины, воды до 1 л .