Вход

Рекомбинантные вакцины

Реферат по биологии
Дата добавления: 06 апреля 2003
Язык реферата: Русский
Word, rtf, 2.4 Мб
Реферат можно скачать бесплатно
Скачать
Данная работа не подходит - план Б:
Создаете заказ
Выбираете исполнителя
Готовый результат
Исполнители предлагают свои условия
Автор работает
Заказать
Не подходит данная работа?
Вы можете заказать написание любой учебной работы на любую тему.
Заказать новую работу
ОГЛАВЛЕНИЕ Введение………………………………………………………………………………………… .3 1. Принц ипы конструирования рекомбинантных противовирусных вакцин………… ..4-24 1.1. Получение соответствующего фрагмента нуклеиновой кислоты……………....… .4 1.2. Выбор высокоактивной и хорошо изученной в иммунологическом отно - шении модели вектора-носи теля и клонирование соответствующего гена…… 9-21 1.2.1. Получение рекомбинантных ДНК…………………………………………… 9 1.2.2. Получение рекомбинантных РНК………………………………………… ...11 1.2.3. Стратегия клонирования генов………………………………………….… 13 1.2.4. Разнообразие векторных молекул………… ……………………………… 17 1.3. Выбор системы экспрессии клонированного гена , способной обеспечить максимальный выход и функциональную полноценность продукта…………… ..22 1.4. Создание достаточно удобных и по возможности универсальных векторов для целевой доставки генов в клетки и ткани организма………………………… 23 2. Вакцина против лейкемии кошек , изготовленная с помощью генной инженерии……………………………………………………………………………….… 24 Список литературы…………………………………………………………………………… .26 ВВЕДЕНИЕ Существую щие традиционные вакцины , несмотря на очевидный положительный эффект их широкого применения , обладают рядом недостатков . К ним относятся : наличие нежелательных биологически активных и балластных компонентов в препаратах , непо л ноценные иммунологические свой ства самих антигенов . Кроме того , существуют забол е вания , не вызывающие иммунитета , вакцины против которых вообще отсутствуют и не могут быть сконструированы на основе классических принципов . Все это вызывает нео б ходимость усовершенствования уже существующ их вакцин и создания принципиально новых типов вакцин . Одним из наиболее перспективных направлений в данной области является получение вакцинных препаратов на основе методов генной инженерии. Последним достижением генной инженерии и биотехнологии стало со здание р е комбинантных противовирусных вакцин , содержащих гибридные молекулы нуклеиновых кислот . Данные вакцины обладают целым рядом преимуществ . Они характеризуются о т сутствием (или значительным снижением ) балластных компонентов , полной безвредн о стью , низк ой стоимостью , которая связана с удешевлением промышленного производства вакцин . Экспрессируемый в клетках вакцинированного животного белок имеет конфо р мацию , близкую к нативной , и обладает высокой антигенной активностью. Таким образом , рекомбинантные прот ивовирусные вакцины являются новейшим поколением вакцин . Их очевидное преимущество обуславливает широкое применение данного типа вакцин в медицине и ветеринарии для вакцинации населения и сельскох о зяйственных животных . 1. ПРИНЦИПЫ КОНСТРУИРО ВАНИЯ РЕКОМБИНАНТНЫХ ПРОТИВОВИРУСНЫХ ВАКЦИН Важным условием получения эффективного вакцинного препарата является с о блюдение основных принципов его производства . Конструирование рекомбинантных пр о тивовирусных вакцин предполаг ает : 1) получение соответствующего фрагмента нукле и новой кислоты ; 2) выбор высокоактивной и хорошо изученной в иммунологическом о т ношении модели вектора-носителя и клонирование соответствующего гена (или генов ); 3) выбор системы экспрессии клонированного г ена , способной обеспечить максимальный выход и функциональную полноценность продукта ; 4) создание достаточно удобных и по возможности универсальных векторов для целевой доставки генов в клетки и ткани орг а низма. 1.1. ПОЛУЧЕНИЕ СООТВЕТСТВУЮЩЕГО ФРАГМЕНТА Н УКЛЕИНОВОЙ КИСЛОТЫ Для конструирования рекомбинантных РНК или ДНК необходимо получить фра г мент нуклеиновой кислоты , который в дальнейшем и будет встраиваться в векторную м о лекулу . Фрагменты ДНК для встраивания в вектор можно получить непосредственно из х ромосомной ДНК , расщепив ее рестриктазами или разрушив случайным образом (например , с помощью ультразвука ) на сегменты с примерно одинаковой длиной . Выд е ление генов с помощью "вырезания " из генома , как правило , состоит из четырех этапов : 1) получение клоно теки фрагментов генома ; 2) выявление фрагментов генома , содержащих необходимый ген , и точная локализация гена в данном фрагменте ; 3) вырезание гена из фрагмента (ов ) с помощью рестриктаз и сшивка участков гена с помощью ДНК-лигазы ф а га Т 4, если эти участки получены из различных фрагментов ; 4) амплификация гена в с о ставе векторной молекулы . Указанный способ получения генов является наиболее прие м лимым применительно к протозойным возбудителям , бактериям и для некоторых сложно устроенных ДНК-содержащих вирусов. Такие операции проводятся , в частности , при с о здании так называемых "библиотек генов ", то есть набора одинаковых векторных систем , в совокупности несущих в себе весь геном данного организма . Однако этот подход имеет ряд существенных недостатков . Во-первых , очень сложна задача подбора рестриктаз , по з воляющих вырезать из геномной ДНК или клонированного фрагмента генома цельный ген . Как правило , вместе с геном остаются фланкирующие его лишние нуклеотидные п о следовательности , что мешает дальнейшему использован ию этого гена , или же рестрикт а зы отрезают часть гена , делая его функционально неполноценным . Во-вторых , создание клонотеки генома возбудителя представляет специальную задачу и требует больших з а трат времени . Наконец , для ряда ДНК-содержащих вирусов (папов авирусы ) доказан сплайсированный характер структуры генов . Вполне понятно , что выделенные гены этих вирусов вследствие наличия интронных областей не будут проявлять функциональной а к тивности в бактериальных клетках и окажутся непригодными при решении задач по ко н струированию рекомбинантных противовирусных вакцин . В-третьих , если ген составляет незначительную долю от всей геномной ДНК , то возникают большие трудности с его из о ляцией и идентификацией. Наиболее распространенным является путь получения генов чер ез синтез ДНК-копий (кДНК ) информационных или каких-либо других (в оптимальном случае - индив и дуальных ) РНК путем их обратной транскрипции . Данный способ включает в себя три этапа : 1) выделение высокоочищенных мРНК , кодирующих индивидуальные структурные бе лки , либо выделение геномных РНК вирусов ; 2) синтез двухцепочечной ДНК (гена ) на матрицах РНК ; 3) амплификация гена с помощью методов молекулярного клонирования. Как отмечалось , первым этапом в получении генов с помощью методов обратной транскрипции служит выделение и очистка геномных РНК и мРНК . Геномные РНК выд е ляют главным образом из очищенных вирионов , а мРНК - из инфицированных клеток . Для выделения мРНК из инфицированных клеток используют различные способы . В о д ном из вариантов выделение мРНК из инф ицированных клеток проводят непосредственно из лизированных клеток (лизис осуществляют в денатурирующих средах в целях предо т вращения разрушающего действия нуклеаз на мРНК ) с последующей экстракцией фен о лом и хлороформом или центрифигурированием лизата чер ез подушку 5,7 M С sCl (для освобождения от клеточных ДНК ) и заключительной аффинной хроматографией на ол и го ( d Т )-целлюлозе (поли (У )-сефарозе ). Выделение мРНК можно проводить и из очище н ных полирибосом инфицированных клеток . В случае необходимости получения специфических мРНК , ко дирующих индивид у альные структурные белки возбудителя , исполь зуют следующий способ . Инфицирова н ные вирусом клетки разрушают механическим путем или химическими методами (испол ь зование неионных детергентов ). Клеточный лизат освобожда ют от ядер и митохондрий методом диф ференциального центрифугирования и подвергают хроматографии на ант и тельном сорбенте . При этой процедуре с антителами , специ фичными к определенному структурному белку возбудителя , связы ваются полисомы , осуществляющие с интез этого белка . Также может быть использован метод непрямой иммунопреципитации полисом , при котором комплекс антитело - полисома преципитируется из раствора добав лением второго антитела , специфичного к первому . В качестве второ го антитела чаще всего б ерут фиксированные формалином клетки Staphilococcus aureus , на поверхности которых нах о дится так назы ваемый белок А , имеющий сродство к Fc-фрагментам Ig . Из полисом , п о лученных одним из описанных способов , далее уже выделяют мРНК . Другой путь выделения и ндивидуальных мРНК базируется на свойстве мРНК вз а имо действовать с комплементарными ДНК , связанными с твердым носи телем (целлюлоза , сефароза , нитроцеллюлозные фильтры ). Этот ме тод отбора и очистки специфических мРНК является самым эффективным . Однако ег о применение возможно только при нал и чии соответст вующих комплементарных ДНК. Получение препарата очищенной мРНК позволяет перейти к ра ботам по синтезу гена с помощью обратной транскрипции , которую осуществляют с помощью ревертазы AMV в специально подобр ан ных условиях . В процессе обратной транскрипции матрицей служит мРНК , а затравкой олиго ( dT 12-18 ) (для мРНК , имеющих поли (А )-тракт ) или хим и чески синтезированный олигонуклеотид , комплемен тарный 3'-концу мРНК . После синтеза на мРНК компле ментарной цепи Д НК и разрушения РНК (чаще используется обра ботка щелочью ) осуществляют синтез второй цепи ДНК . В этой реакции матрицей служит пе р вая цепь ДНК . Реакция может катали зироваться как ревертазой , так и ДНК-полимеразой . После получения двухцепочечной кДНК след ует стадия получения гена , заключ а ющаяся в гидролизе одноцепочечного участка ДНК , соединяющего первую и вторую ц е пи , нуклеазой S 1 . Для получения необходимых участков РНК используют две группы способов : 1) расщепление полирибонуклеотидной цепи РНК в заданно м месте ; 2) синтез РНК (ферме н тативный на ДНК - или РНК-матрицах и химический ). Расщепление полирибонуклеотидной цепи РНК может осуществляться в прису т ствии различных ферментов . Для этой цели используют ферменты : рибонуклеазу H , ну к леазы , ковалентно связанн ые с олигонуклеотидами (например , стафилококковая нукл е аза ), рибозимы (например , рибозим L -19). Исторически первым способом направленной ферментативной фрагментации РНК (называемой также адресованной , сайт-направленной или сайт-специфической фрагме н тацией РНК ) является разработанный в Московском университете метод гидролиза РНК ферментом РНКазой H в присутствии комплементарных олигодезоксирибонуклеотидов . Этот метод до сих пор остается наиболее универсальным способом направленной фра г ментации РНК. Метод осн ован на свойстве РНКазы Н расщеплять полирибонуклеотидную цепь РНК в составе ДНК-РНК-гетеродуплекса . К участку РНК , по которому планируется пр о вести ее фрагментацию , синтези руется комплементарный олигодезоксирибонуклеотид длиной в 6-10 нуклеотидных остатк ов . Далее получают комплекс этого олигонуклеотида с РНК , который затем обрабатывают ферментом . В работе обычно используют РНКазу Н из Escherichia coli - вполне доступный фермент , который может быть довольно легко очищен от всех сопутствующих нуклеазных при месей . Этот метод нашел достаточно широкое применение для сайт-специфического расщепления вирусных и рибосомных РНК , а также для иден тификации продуктов процессинга некоторых РНК. Важным достоинством рассматриваемого метода является и то , что в результате гидролиза РНК рибонуклеазой Н образуются фраг менты , у одного из которых на 5'-конце содержится фосфатная группа , а у другого 3'-конец свободен (нефосфорилирован ). Такие фрагменты можно прямо использо вать в реакции ферментативного лигирования. Серьезным ограничением этого метода является то , что участок РНК , с которым связывается комплементарный ему олигодезоксири бонуклеотид , должен иметь однотяж е вую конформацию и находиться на поверхности макромолекулы РНК , представляющей собой в усло виях расщепления к омпактную глобулу с развитой вторичной струк турой . В отдельных случаях это ограничение удается преодолеть , ис пользуя достаточно длинные олигодезоксирибонуклеотиды (15-20-членные ), которые предварительно отжигают с ч а стично или полно стью денатурированной РНК. Другое ограничение метода фрагментации полирибонуклеотидов РНКазой Н в присутствии комплементарных олигодезоксирибонуклеотидов заключается в том , что в общем случае предсказать , какая из фосфодиэфирных связей в гетеродуплексе (или в непосредственной близости от него ) подвергнется расщеплению , не удается . Более того , фермент зачастую гидролизует не одну , а несколько соседних межнуклеотидных связей . Ясно , что для последующего конструирования рекомбинантных РНК такие фрагменты могут оказаться непригодны м и. Расщепление РНК может проводиться и с участием нуклеаз , ковалентно связанных с олигонуклеотидами . Идея , лежащая в основе данного подхода к направленной фрагме н тации РНК , восходит к концу 60-х годов , когда Н . И . Гриневой и ее сотрудниками был предложен м етод олигонуклеотид-направляемой модификации нуклеиновых кислот . Принцип этого метода заключается в том , что с 5'- или 3'-концевым остатком олигону к леотида , комплементарного заданному району ДНК и РНК , связывают модифицирующий агент , который после образова ния дуплекса атакует одно из ближайших к нему основ а ний . Реагентами этого типа удалось направленно фрагментировать фенилаланиновую тРНК из дрожжей , РНК-компонент ( M 1 РНК ) РНКазы Р , а также 16 S рибосомную РНК E . coli . Однако , как и в случае РНКазы Н , расщеп ление РНК олигонуклеотид-нуклеазой зачастую проходит по нескольким межнуклеотидным связям , что несколько ограничивает возможности применения этого метода для получения рекомбинантных РНК. Для расщепления РНК применяют также рибозимы (природные РНК и синте тич е ские полирибонуклеотиды , способные катализировать целый ряд превращений у других РНК ). Первый рибозим , напоминающий по своим свойствам эндонуклеазы рестрикции , был получен Т . Чеком . В научной литературе его обозна чают как рибозим L -19. Этот р и бозим пр едставляет собой РНК длиной в 395 нуклеотидных остатков , в 5'-концевой обл а сти которой имеется гексануклеотидная последовательность GGAGGG , ответст венная за специфичность расщепления предшественника 26S РНК при самосплайсинге . Эта посл е довательность компл ементарна CUCUCU последовательности , расположенной на 3'-конце первого экзонного участка предшественника 26 S РНК . Если эту РНК заменить другой , но обязательно содержащей доступную для комплементарного связывания CUCUCUA п о следовательность , то рибозим L -19 в присутствии гуанозина или гуаниловых нуклеотидов со свободной 3'-гидроксильной группой расщепит ее . Источником необходимых участков РНК может служить такой способ , как синтез фрагментов РНК . Ферментативный синтез сегментов РНК осуществляют с использован и ем разнообразных генно-инженерных конструкций . Однако в настоящее время в подавл я ющем большинстве случаев для препаративного получения РНК используются РНК-полимеразы , закодированные в геномах ряда ДНК-содержащих бактериофагов (Т 3, Т 7 и SP 6). Они характер изуются очень высокой активностью и , в отличие от клеточных РНК-полимераз , состоят из одной полипептидной цепи . Важно также то , что инициация и те р минация синтеза РНК этими полимеразами происходит на одном определенном нукле о тидном остатке. Полученные одни м из способов фрагменты нуклеиновых кислот в дальнейшем встраивают в векторные молекулы. Подводя итог изложенному , можно сделать вывод , что получение генов протекти в ных белков возбудителей представляет собой достаточно сложную задачу . Однако ее р е шение нео бходимо для создания в конечном счете рекомбинантных противовирусных вакцинных препаратов. 1.2. ВЫБОР ВЫСОКОАКТИВНОЙ И ХОРОШО ИЗУЧЕННОЙ В ИММУНОЛОГИЧЕСКОМ ОТНОШЕНИИ МОДЕЛИ ВЕКТОРА-НОСИТЕЛЯ И КЛОНИРОВАНИЕ СООТВЕТСТВУЮЩЕГО ГЕНА 1.2.1. ПОЛУЧЕНИЕ РЕКОМБИ НАНТНЫХ ДНК Суть конструирования рекомбинантных ДНК заключается во встраивании фра г ментов ДНК , среди которых находится интересую щий нас участок ДНК , в так называемые векторные молекулы ДНК (или просто векторы ) - плазмидные или вирусные ДНК , кот о рые могут быть перенесены в клетки про - или эукариот и там автономно репли-цироваться . На следующем этапе проводится отбор тех клеток , кото рые несут в себе р е комбинантные ДНК (с помощью маркерных призна ков , которыми обладает сам вектор ), и затем индивидуальных кл онов с интересующим нас сегментом ДНК (используя признаки или пробы , специфичные для данного гена или участка ДНК ). При решении ряда научных и биотехнологических задач конст руирование реко м бинантных ДНК требует также создания систем , в ко торых обеспечивается максимальная экспрессия клонируемого гена. Существует три основных способа встраивания чужеродной ДНК в векторные м о лекулы . В первом случае 3'-концы фрагментов ДНК , среди которых находится интерес у ющий нас участок ДНК (ген или его сегм ент , регуляторный район ), с помощью фермента терминальной нуклеотидилтрансферазы наращиваются гомополинуклеотидной послед о вательностью (например , поли (Т )). 3'-концы ли нейной формы векторной ДНК тем же способом наращиваются комп лементарной ей гомополинук леотидной последовательн о стью (то есть по ли (А )). Это позволяет соединить две молекулы ДНК путем комплемен тарного спаривания искусственно полученных "липких " концов. Во втором случае "липкие " концы создаются с помощью расщеп ления молекул ДНК (как вектор ной , так и содержащей интересующий нас фрагмент ) одной из энд о нуклеаз рестрикции (рестриктаз ). Рестриктазы характеризуются исключительно высокой специ фичностью . Они "узнают " в ДНК последовательность из нескольких нуклеотидных остатков и расщепляют в них с трого определенные межнуклеотидные связи . Поэтому д а же в ДНК больших размеров рестриктазы вносят ограниченное число разрывов . Третий способ представляет собой комбинацию двух первых , когда липкие концы ДНК , образованные рестриктазой , удлиняются синтетичес кими последовательностями (рис . 1). Концы фрагментов ДНК можно превратить в "липкие ", наращи вая их двутяжевыми олигонуклеотидами ("линкерами "), в состав кото рых входит участок узнавания рестрикта- Рисунок 1 . Схема конструирования рекомбинантной ДНК с помощью рестриктаз PstI и поли ( G )- поли (С )-линкера. зой . Обработка такого фраг мента данной рестриктазой делает его пригодным для встра и вания в векторную м олекулу ДНК , расщепленную той же рестриктаэой . Часто в качестве "линкера " применяются полинуклеотидные фрагменты , ко торые содержат специфические участки сразу для нескольких рестриктаз (их называют "полилинкерами "). После встраивания чужеродной ДНК в вект ор их ковалентное сшивание осущест в ляется ДНК-лигазой . Если же размер бреши в рекомбинированной молекуле превышает одну фосфодиэфирную связь , она застраивается in vitro с помощью ДНК-полимеразы или in vivo с помощью репарирующих систем клетки. 1.2.2. ПОЛУ ЧЕНИЕ РЕКОМБИНАНТНЫХ РНК Получение рекомбинантных РНК обычно осуществляют методами ферментативн о го или химического лигирования РНК . Кроме того , недавно появилась принципиально но вая возможность встраивания сегмента РНК в заданное положение других молекул РНК с помощью рибозимов. Ковалентное сшивание отдельных сегментов РНК при получении рекомбинантных молекул , как правило , осуществляют с помощью Т 4 РНК-лигазы . Т 4 РНК-лигаза закоди рована в геноме бактериофага Т 4. Ее выделяют из клеток E . coli , зараженных э тим фагом . Фермент сшивает друг с другом однотяжевые олиго - и полирибонуклеотиды . Для работы Т 4 РНК-лигазы необходим источник энергии - аденозинтрифосфат . На рис . 2 приведена схема ферментативного лигирования двух коротких олигонуклеотидов . Как видно из э т ой схемы , акцептором в реакции лигирования служит пол ностью дефосфорилированный , а донором - полностью фосфорилированный по концевым нуклеотидным остаткам олиг о нуклеотид . Это предотвращает возможность сшивания однотипных олигонуклео тидов. Эффективность ф ерментативного лигирования достаточно длинных полирибону к леотидов сильно варьирует и ее трудно предсказать исходя только из нуклеотидной п о следовательности сегментов РНК . Наилучшие результаты получены в тех случаях , когда сшиваемые концы полирибонуклеотидо в были пространственно сближены за счет ко м плементарного связывания соседних с ними участков РНК. Недавно было установлено , что протяженные сегменты РНК (длиной в 200-300 остатков ) могут быть с высоким выходом сшиты Т 4 ДНК-лигазой . При этом "стыковка " сегм ентов осуществляется с по мощью олигодезоксирибонуклеотида , комплементарного 3'-концу одного сегмента и 5'-концу другого. Метод химиче ского лигирования основан на активации концевой фосфатной гру п пы одного из двух сшиваемых сегментов РНК водораство римым карбодиимидом или Рисунок 2 . Схема сшивания двух олигорибонуклеотидов с помощью Т 4 РНК-лигазы. BrCN . В случае BrCN реакция про текает очень быстро и не сопровождается модификац и ей нуклеотид ных остатков , хотя под действием карбодиимидов фосфодиэфирная связь образуется с более высоким выходом . Для того , чтобы обеспечить сближенность сшива е мых концевых нуклеотидных остатков в фрагментах РНК , было предло жено использовать олигодезоксирибонуклеотиды , комп лементарные обоим фрагментам в месте их стыка . Химическое лигирование РНК , как правило , проходит с существенно меньшим выходом , чем ферментативное . Однако оно позволяет получать рекомбинантные РНК с необ ычными типами межнуклеотидной связи (например , пирофосфатной ) и необычными нуклеотидными остатками в месте стыка двух фрагментов. Получение рекомбинантных РНК с помощью рибозимов основано на обратимости реакции самосплайсинга (при отсутствии гуанозина или гуаниловых нуклеотидов ). Это предоставляет возможность для встраивания интронной РНК в заданный участок другого сегмента РНК (рис . 3). Фрагмент РНК , в который производится встраивание , должен с о держать нуклеотидную последовательность , идентичную нуклеотидн ой последова тельности 3'-концевого участка 5'-экзонного района 26 S РНК и соот ветственно компл е ментарную той нуклеотидной последовательности в интроне , которая отвечает за спец и фичность прямой реакции . Фраг мент , в который производится встраивание , беретс я в и з бытке. В настоящее время описанная здесь цепь реакций может быть реализована только для интронной РНК , получаемой из предшест венника 26S РНК тетрахимены . Однако можно думать , что конструи рование новых рибозимов может существенно расширить возможнос ти этого подхода. 1.2.3. СТРАТЕГИЯ КЛОНИРОВАНИЯ ГЕНОВ Векторные молекулы в обязательном порядке содержат маркерные гены , которые после переноса вектора в клетки-реципиенты сообщают им новые свойства . Это может быть устойчивость к антибиотику , которой до трансформации клетки не обладали , или образование фермента , синтез которого в клетках-реципиентах не происходил . Благодаря таким вновь приобретенным признакам клетки с векторными ДНК могут быть легко найдены в популяции исходных клеток . Одновременно могут быть отобраны те клетки , которые содержат векторы со встроенными в них чужеродными ДНК (рекомбинантные ДНК ). Для этого встраивание чужеродной ДНК в вектор производится таким образом , чтобы один из маркерных признаков вектора нарушался . Так , например , если бактериал ь ный вектор несет устойчивость к двум антибиотикам , то чужеродную ДНК встраивают в один Рисунок 3 . Схема прямого и обращенного процесса самосплайсинга. из генов антибиотической устойчивости . И тогда бактерии с рекомбинантной ДНК , в о т личие от бактерий с исходным вектором , могут расти в присутствии только одного из а н тибиотиков. Другой весьма распространенный пример связан с наличием в векторной Д НК наряду с генами , сообщающими клетке устойчивость к антибиотикам , фрагмента лакто з ного оперона , обеспечивающего об разование в клетках-реципиентах активного фермента -галактозидазы . Колонии клеток с таким признаком легко обн аруживаются при выращ и вании их на твердом агаре , содержащем в качестве субстрата -галактозидазы 5-бром -4-хлор -3-индолил- -галактозид ( X - gal ), по скольку его расщепление приводит к образов а нию бромх лориндола - красителя , окрашенного в голубой цвет . Если же в ген -галактозидазы этого вектора встроена чужеродная ДНК таким образом , что этот ген ок а зался нарушенным , то трансформированные им клетки будут обра зовывать бесцвет ные колонии . Само же присутствие рекомбинантного вектора в клетках может быть зафикс и ровано по их устойчивости к антибиотику. На следующем этапе среди популяции клеток с рекомбинантными векторами нео б ходимо отобрать индивидуальные клоны , содержа щие только интересующие нас гены или их фрагменты . Само собой разумеется , что это в принципе возможно только в том случае , если в исходные клетки проникло в среднем по одной молекуле рекомбинантной ДНК . Способ же отбора клонов в значительной степени зависит от прир о ды клонируемого гена. По-видимому , самым простым является случай , когда клониру емый ген способен комплементировать ауксотрофную мутацию в штамме-реципиенте . В этом случае клетки высеваются на среду , ли шенную вещества , необходимого для роста данного штамм а , и только клетки , содержащие рекомбинантную ДНК с искомым геном , способны расти на этой среде . Из таких клонов получают гомогенную культуру клеток , которую используют для получения искомого сегмента ДНК , проделывая все операции в обратном порядке (то е с ть из клеток выделяют вектор , из него вычленяют необходимый фрагмент ДНК и так далее ). Гораздо чаще для отбора необходимых клонов приходится при бегать к методу ДНК-ДНК - или ДНК-РНК-гибридизации . Для этого необходимо располагать "зондами " (индивидуальными молекула ми ДНК или РНК или их фрагментами ), комплементарными нуклеотидной последовательности клонируемого гена . Это могут быть специ ально синт е зированные олигодезоксирибонуклеотиды длиной в 15-20 остатков , последовательность которых выбрана на основании полно стью или частично известной первичной структуры гена или закодиро ванного в нем белка . Это могут быть кДНК , синтезированные на инди видуальных РНК-копиях данного гена (как таковые или в виде отклонированных , то есть существенно умноженных в количест в е фрагментов ДНК ). Наконец , это могут быть сами индивидуальные РНК , закодированные в данном гене . Ясно , что во всех случаях "зонды " должны нести радиоактивную метку (обычно 32 Р ) с достаточно высокой удельной акти в ностью . Если же индивидуальный "зонд " недо ступен , то применяют методы , которые из большого числа рекомбинантов (10 6 ) позволяют выбрать сравнительно небольшую группу (около 10 2 ), включающую рекомбинант с искомым геном . Эта группа подразделяется на подгруп пы (например , на 10) по 10 рекомбинантов . И з каждой подгруппы выделяется ДНК , которую используют для синтеза мРНК и последу ющей трансляции ее с целью о б наружения соответствующего продукта искомого гена. Трансляция мРНК может быть осуществлена в бесклеточной системе . Однако в случае эукариотических генов мРНК часто перено сят в ооциты лягушки (ксенопуса ) с п о мощью техники микроинъек ции , где она транслируется . Продукт трансляции обычно о б наружива ют с помощью антител. Далее в подгруппе , где обнаружен искомый ген , тем же методом исследуется ка ж дый кл он. При наличии зонда с чашки Петри , на которой выращены колонии клеток , делается отпечаток (реплика ) на нитроцеллюлозном фильтре . Клеткам дают вырасти на фильтре , затем их разрушают , подвергают ДНК щелочной денатурации и фильтр прогревают при 80°С , после чего ДНК необратимо с ним связывается . Фильтр отмыва ют от примесей и обрабатывают радиоактивным "зондом " в условиях , оптимальных для ДНК-ДНК - или ДНК-РНК-гибридизации . После удаления избытка "зонда " методом ауторадиографии определяют поло жение клеточног о клона , содержащего участок ДНК с нуклеотидной п о следовательностью , комплементарной "зонду ". Этот клон становит ся затем источником клеток для получения искомого гена или его фрагмента. Для селекции клонов , несущих необходимый ген , достаточно широко примен яются и иммунологические методы . Принцип отбора на первых этапах тот же , что и при испол ь зовании ДНК - и РНК-зондов . Далее с колоний с рекомбинантными ДНК делается реплика с помощью полимерной пластинки , на которой закреплены антитела к продукту искомого ге на . Положение клонов , вырабатывающих этот белок , опре деляется также с помощью антител , но уже меченных радиоактивным йодом ( 125 I ). 1.2.4. РАЗНООБРАЗИЕ ВЕКТОРНЫХ МОЛЕКУЛ Под понятием "вектор " понимается молекула нуклеиновой кислоты , способная п о сле вве дения в клетку к автономному существованию за счет наличия в ней сигналов р е пликации и транскрипции . Векторные молекулы должны обладать следующими свой ствами : 1) способностью автономно реплицироваться в клстке-реципиенте , то есть быть самостоятельным реп ликоном ; 2) содержать один или несколько маркерных генов , благодаря экспрессии которых у клетки-реципиента появляются новые призна ки , позволяющие отличить трансформир о ванные клетки от исходных ; 3) содержать по одному или , самое большее , по два участка (са йта ) для различных рестриктаз в разных районах (в том числе в составе маркерных генов ), но не в области , ответственной за их репликацию. В зависимости от целей эксперимента векторы можно условно разделить на две группы : 1) используемые для клонирования и а мплификации нужного гена ; 2) специал и зированные , применяемые для экспрессии встроенных чужеродных генов . Вторая группа векторов объединяет векторы , призванные обеспечить синтез белковых продуктов клон и рованных генов . Векторы для экспрессии содержат последо вательности ДНК , которые необходимы для транскрипции клонированных копий генов и трансляции их мРНК в штаммах клеток. В качестве прокариотических векторов используются плазмиды , бактериофаги ; в качестве эукариотических векторов применяют вирусы животных и растений , векторы на основе 2 мкм дрожжей и митохондрий и ряд искусственно сконструированных векторов , способных реплицироваться как в бактериальных , так и в эукариотических клетках (че л ночные векторы ). Плазмиды - это внехромосомные генетические элементы п ро - и эукариот , которые автономно реплицируются в клетках . Большинство плазмидных векторов получено на о с нове природных плазмид ColE 1, pMB1 и p15A. Бактериальные плазмиды делят на два класса . Одни плазмиды (например , хорошо изученный фактор F , определяю щий пол у E . coli ) сами способны переходить из клетки в клетку , другие такой способно стью не обладают . По ряду причин , и прежде всего для предотвращения неконтролируемого распространения потенциально опасного генети ческого материала , подавляющее большинст во бактериальных плазмидных векторов с о здано на базе плазмид второго класса . Многие при родные плазмиды уже содержат гены , определяющие устойчивость клеток к антибиотикам (продукты этих генов - ферменты , модифици рующие или расщепляющие антибиотические вещ ества ). Кроме того , в эти плазмиды при конструировании векторов вводятся дополнитель ные гены , определяющие устойчивость к другим антибиотикам. На рис . 4 показан один из самых распространенных плазмидных векторов E . coli - pBR 322. Он сконструирован на базе детально изученной плазмиды E . coli - колициноге н ного фактора ColE 1 - и содер жит ориджин репликации этой плазмиды . Особенность пла з миды ColE1 (и pBR322 соответственно ) состоит в том , что в присутствии ингибитора си н теза белка антибиотика хлорамфеникола (оп осредо ванно ингибирующего репликацию х о зяйской хромосомы ) ее число в E . coli возрастает от 20-50 до 1000 молекул на клетку , что позволяет получать большие количества клонируемого гена . При конструирова нии вект о ра pBR322 из исходных плазмид был делегирован целый ряд "лишних " сайтов для р е стриктаз. В настоящее время наряду с множеством удобных векторных систем для E . coli сконструированы плазмидные векторы для ряда дру гих грамотрицательных бактерий (в том числе таких промышленно важных , как Pseudomonas , Rhiz obium и Azotobacter ), гра м положительных бактерий ( Bacillus ), низших грибов (дрожжи ) и растений. Плазмидные векторы удобны для клонирования относительно небольших фрагме н тов (до 10 тыс . пар оснований ) геномов небольших размеров . Если же требуется получить к лонотеку (или библиотеку ) генов высших растений и животных , общая длина генома к о торых достигает огромных размеров , то обычные плазмидные векторы для этих целей н е пригодны . Проблему создания библиотек генов для высших эукариот удалось решить с использован ием в качестве клонирующих векторов производных бактериофага . Среди фаговых векторов наиболее удобные системы были созда ны на базе геномов бактериофагов и М 13 E . coli . ДНК этих фагов содержит протяженные области , которые можно делегировать или за менить на чужеродную ДНК , не затрагивая их способности реплицироваться в клетках E . coli . При конструировании семейства векторов на базе ДНК фага из нее сначала (путем д елений коротких участков ДНК ) были удалены многие са й ты рестрикции из области , не сущест венной для репликации ДНК , и оставлены такие са й ты в области , предназначенной для встраивания чужеродной ДНК . В эту же область часто встраивают маркерные гены , позволя ющие отличить рекомбинантную ДНК от исходного вектора . Такие векторы широко использу ются для получения "библиотек генов ". Раз меры замещаемого фрагмента фаговой ДНК и соответственно встраи ваемого участка чужеро д ной ДНК ограничены 15-17 тыс . нуклеотидных остатков , так как рекомбинантный фаго - Рисунок 4 . Детальная рестрикционная карта плазмиды pBR 322. вый геном , который на 10% больше или на 75% меньше генома дикого фага , уже не м о жет быть упа кован в фаговые частицы. Таких ограничений теоретически не существует для векторов , сконструированных на базе нитчатого бактериофага М 13. Описаны случаи , когда в геном этого фага была встроена чужеродная ДНК длиной около 40 тыс . нуклеотидных остатков . Изве стно , одн а ко , что фаг М 13 становится нестабильным , когда длина чужеродной ДНК пре вышает 5 тыс . нуклеотидных остатков . Фактически же векторы , полу ченные из ДНК фага М 13, и с пользуются главным образом для секвенирования и мутагенеза генов , и размеры встра и в аемых в них фрагментов намного меньше. Эти векторы конструируются из реплекативной (двутяжевой ) формы ДНК фага М 13, в которую встроены "полилинкерные " участки (пример такой конструкции показан на рис . 5). В фаговую частицу ДНК включается в виде однотяжевой молекулы . Таким о б разом , этот вектор позволяет получать клонированный ген или его фрагмент как в двут я жевой , так и в однотяжевой форме . Однотяжевые формы рекомбинантных ДНК широко используются в настоящее время при опреде лении нуклеотидной последовательн ости ДНК методом Сэнгера и для олигодезоксинуклеотид-направленного мутагенеза генов. Перенос чужеродных генов в клетки животных осуществляется с помощью вект о ров , полученных из ДНК ряда хорошо изученных вирусов животных - SV40, некоторых аденовирусов , вир уса папиломы быка , вируса оспы и так далее . Конструирование этих векторов проводится по стандартной схеме : удаление "лишних " сайтов для рестриктаз , введе ние маркерных генов в области ДНК , не существенные для ее репликации (напр и мер , гена тимидин-киназы ( t k ) из HSV (вируса герпеса )), введение регуляторных районов , повышающих уровень экспрессии ге нов. Удобными оказались так называемые "челночные векторы ", спо собные реплицир о ваться как в клетках животных , так и в клетках бактерий . Их получают , сшивая друг с другом большие сегменты век торов животных и бактерий (например , SV40 и pBR 322) так , чтобы районы , ответственные за репликацию ДНК , остались незатронутыми . Это позвол я ет проводить основные операции по конструированию век тора в бактериальной клетке (что т ехнически намного проще ), а затем полученную рекомбинантную ДНК использовать для клонирования генов в животной клетке. Рисунок 5 . Рестрикционная карта вектор а М 13 mp8. 1.3. ВЫБОР СИСТЕМЫ ЭКСПРЕССИИ КЛОНИРОВАННОГО ГЕНА , СПОСОБНОЙ ОБЕСПЕЧИТЬ МАКСИМАЛЬНЫЙ ВЫХОД И ФУНКЦИОНАЛЬНУЮ ПОЛНОЦЕННОСТЬ ПРОДУКТА Полученные рекомбинантные молекулы переносятся в определенные группы кл е ток , которые должны обеспечить экспре ссию этих генов , то есть синтез соответствующих белков в количествах , экономически рентабельных по сравнению с обычной технологией их производства. Обычно для данной цели используют бактериальные или дрожжевые культуры клеток , а также системы экспрессии на основе эукариотических клеток. Из бактериальных клеток наиболее изученной в молекулярно-генетическом отн о шении является грамотрицательная бактерия Escherichia coli , поэтому для нее можно с наибольшей определенностью планировать генноинженерные конструкции . Однако E . c oli слабо освоена промышленностью . Кроме того , она относится к условно-патогенным для человека микроорганизмам , что может создать трудности при получении на ее основе фармацевтических препаратов. Отмеченные недостатки E . coli легко преодолеваю тся при конструировании мет о дами генной инженерии штаммов-продуцентов на основе клеток Bacillus subtilis . Данная почвенная бактерия безопасна для человека и животных и прекрасно освоена микроби о логической промышленностью . Бактерия B . subtilis по степени из ученности следует за E . coli . Важное отличие ее от E . coli - способность эффективно секретировать во внешнюю среду целый ряд белков , поэтому особенно интересны работы по созданию штаммов-продуцентов B . subtilis , секретирующих чужеродные белки из клеток . Од нако данная ба к терия имеет свои недостатки : рекомбинантные плазмиды в B . subtilis характеризуются н е стабильностью , выражающейся в перестройках и делециях ДНК ; бациллы секретируют в культуральную среду большое количество протеаз , что существенно усложняет в опрос максимализации генноинженерного получения целевого белка на основе бацилл-продуцентов. Среди эукариотических микроорганизмов наиболее изученным является низший эукариот Saccharomyces cerevisiae . Одно из преимуществ S . cerevisiae как экспериме н тальной системы - простота и надежность ее генетического анализа . В клетках дрожжей имеется ферментативная система гликозилирования белков , которая обеспечивает во з можность синтеза в них полноценных белков высших эукариот . Аналогичных систем процессинга белков в бактериальных клетках нет . Многие штаммы дрожжей освоены микробиологической промышленностью . Доказана их безвредность для человека и ж и вотных . Именно на S . cerevisiae создан первый штамм-продуцент поверхностного антиг е на вируса гепатита Б , позволивший полу чить и испытать вакцину против данного виру с ного заболевания человека. С появлением генной инженерии внимание многих исследователей привлекла с и стема культивируемых клеток животных . Особый интерес к культурам клеток животных стал проявляться после обнаруже ния того , что часть эукариотических генов раздроблена и лишь в системе клеток высших эукариот можно достичь правильной экспрессии таких г е нов . Кроме того , многие белки животных и их вирусов синтезируются первоначально в виде более высокомолекулярных предш ественников , которые в результате специфич е ского протеолитического процессинга переходят в так называемую зрелую форму . Такой процессинг данных белков , по-видимому , можно ожидать лишь в системе клеток живо т ных . Все это убедительно доказывает важность разра ботки экспрессирующей системы на основе клеток животных . Для обеспечения наиболее эффективной экспрессии клонированных генов в ве к торные молекулы встраивают определенные фрагменты ДНК , позволяющие увеличить выход чужеродного белка . Так , для достижения бол ее высокого уровня экспрессии гена HBsAg в клетках E . coli были использованы различные по силе промоторы (промоторы генов cat , ka n , bla , trp и тандемно расположенных промоторов генов kan и trp ). Уровни синтеза последовательностей H В sAg (нативного и в соста ве химерных белков ) составляли в зависимости от используемых конструкций векторов от 100 до 100000 молекул на кле т ку . 1.4. СОЗДАНИЕ ДОСТАТОЧНО УДОБНЫХ И ПО ВОЗМОЖНОСТИ УНИВЕРСАЛЬНЫХ ВЕКТОРОВ ДЛЯ ЦЕЛЕВОЙ ДОСТАВКИ ГЕНОВ В КЛЕТКИ И ТКАНИ ОРГАНИЗМА Важным моментом при конструировании ДНК-вакцин является проблема целен а правленной доставки генов в необходимые клетки и защиты вводимых ДНК от действия нуклеаз крови . В результате экспериментальной работы были созданы разнообразные конструкции , позволяющие достав лять целевые гены в клетки-мишени. Одной из подобных конструкций является модель молекулярного вектора для д о ставки генов в такие клетки , как лимфоциты и кераноциты . В качестве модельного был использован ген , кодирующий гибридный белок : фактор некроза опух олей-альфа - инте р ферон-гамма . В центре вектора находится интактная плазмидная ДНК , содержащая д о ставляемый ген , а на поверхности располагаются антитела к клеткам-мишеням . Конъюгат полиглюкина со спермидином и антителами применяется для связи компонентов ( пол о жительно заряженный спермидин обеспечивает связывание конъюгата с плазмидной ДНК ). Описанный молекулярный вектор позволяет целенаправленно доставлять гены в клетки-мишени , сводя до минимума их попадание в другие виды клеток , защищать д о ставляемые гены от нуклеаз крови и использовать положительно заряженный комплекс спермидин-полиглюкин в качестве стимулятора проникновения ДНК в клетки. В настоящее время также создана векторная модель для доставки в клетки костного мозга гена , кодирующего гранулоцитарный колониестимулирующий фактор человека (чГ-КСФ ). Данный белок относится к семейству гемопоэтических факторов роста и явл я ется одним из физиологических регуляторов , специфически и высокоэффективно стим у лирующих пролиферацию и дифференцировку гемопоэтических предшественников нейтрофилов . чГ-КСФ увеличивает продолжительность жизни клеток костного мозга , усиливает функциональную активность зрелых нейтрофилов . Созданный вектор пре д ставляет собой многослойную конструкцию . "Центральным ядром " конструкции является плазмида pGGF 8, содержащая ген чГ-КСФ . Ее окружает полисахаридная оболочка , кот о рая состоит из полиглюкина и спермидина . Внешний белковый слой содержит смесь с ы вороточного альбумина и белка доставки - трансферина . Эффективность описанной ве к торной модели была доказана опытным путем. Итак , при конструировании рекомбинантных противовирусных вакцин немалова ж ное значение имеет создание специального вектора-носителя , обеспечивающего адресную доставку генов и их защиту от действия нуклеаз крови. 2. ВАКЦИНА ПРОТ ИВ ЛЕЙКЕМИИ КОШЕК, ИЗГОТОВЛЕННАЯ С ПОМОЩЬЮ ГЕННОЙ ИНЖЕНЕРИИ Возбудителем лейкемии кошек является ретровирус типа С . Вирус лейкемии кошек ( FeLV ) имеет в качестве генетического материала молекулу РНК . Заболеваемость и смертность среди домашних кошек в Швейц арии довольно высока . Вакцина против FeLV , изготовленная традиционным путем , была разработана несколько лет тому назад и находится в продаже в Швейцарии . Высокая цена современных вакцин и отсутствие ув е ренности в отношении длительности эффекта и надежност и вакцины вызвали необход и мость создания вакцины с помощью генной инженерии . При конструировании рекомбинантной вакцины оболочечный протеин вируса ( env -ген ) клонировался в пивных дрожжах ( Saccharomyces cerevisiae ). Env -ген вначале лигир о вался с промотором дрожжей (пируваткиназный промотор ), а затем клонировался в так называемом " Shuttle "-векторе . Вектор " Shuttle " (челночный вектор ) может размножаться как в бактерии E . coli , так и в пивных дрожжах S . cerevisiae .Он содержит с одной стороны репликационные ори гины как для дрожжей , так и для E . coli , а с другой стороны селекц и онный маркер для дрожжей ( leu 2 ген ) и для E . coli (резистентность к ампицилину ). Из ли т ра дрожжевой культуры выделяют множество миллиграмм env -протеина и затем тестир у ют в опыте по вакцинаци и . Результат вселяет надежду : 10 кошек были иммунизированы env -протеином , причем 4 дали ответ антителами . Через 2 недели провели заражение FeLV . Теперь все животные давали ответ антителами. Таким образом , полученная вакцина оказалась эффективным средством для борьбы с данным заболеванием . СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 1. Грен Э . Я ., Пумпен П . П . Рекомбинантные вирусные капсиды - новое поколение иммуногенных белков и вакцин // Журнал ВХО . - 1988. - т . II , № 5. - с . 531-536. 2. Дмитриев Б . А . Проблемы и перспективы создания синтетических вакцин // Иммунология . - 1986. - № 1. - с . 24-29. 3. Лебедев Л . Р ., Сизов А . А ., Масычева В . И ., Карпенко Л . И ., Рязанкин И . А . Молекулярный вектор для доставки генов в клетки-мишени // Биотехнология . - 2001. - № 1. - с . 3-12. 4. Мертвецов Н . П ., Беклемишев А . Б ., Савич И . М . Современные подходы к ко н струированию молекулярных вакцин . - Новосибирск : Наука , 1987, 210 с. 5. Сизов А . А ., Лебедев Л . Р ., Масычева В . И ., Кашперова Т . А ., Одегов А . М . Ра з работка вирус -подобной конструкции для рецептор-опосредованного транспо р та гена чГ-КСФ в клетки костного мозга in vivo // Биотехнология . - 2001. - № 1. - с . 13-18. 6. Шабарова З . А ., Богданов А . А ., Золотухин А . С . Химические основы генетич е ской инженерии . - М .: Изд-во МГУ , 1994, 224 с . 7. Щелкунов С . Н . Клонирование генов . - Новосибирск : Наука , 1986, 232 с. 8. Юров Г . К ., Народицкий Б . С ., Юров К . П . Конструирование и использование ДНК-вакцин // Ветеринария . - 1998. - № 12. - с . 25-27. 9. Hubscher U . Генная инженерия и ветеринария . Вакцины , изготовленные с п о мощью генной инженерии , и анализ высоковариабельных участков ДНК . - Schweiz . Arch . Tierheilk ., 1987, 129, № 11, 553-564.
© Рефератбанк, 2002 - 2017