СОДЕРЖАНИЕ Общие сведения о добыче полезных ископаемых……………………………… 3 Нефть и ее состав. Основные факторы загрязнения………………………….. 4 Общая характеристика почвы……………………………………………………. 7 Естественная трансформация нефти в почве…………………………………… 9 Нефтяное загрязнение…………………………………………………………….. 15 Восстановление загрязненных почв……………………………………………... 17 Избранные материалы из Автореферата диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук Драчук Сергея Владимировича на тему: «Фотогетеротрофные пурпурные бактерии в почвах, загрязненных углеводородами» под научным руководством к.б.н., проф. Фирсова Н.Н…… 20 Избранные материалы из статьи на тему «Характеристика некоторых представителей углеводородокисляющей микрофлоры Усинского нефтяного месторождения» автора к.б.н. М. Маркаровой…………………………………. 31 Избранные материалы из публикации Мукашевой Т.Д. и Шигаевой М.Х. на тему «Микроорганизмы в почвах Казахстана с разной степенью загрязнения нефтью»……………………………………………………………………………. 35 Заключение………………………………………………………………………... 37 Список используемой литературы………………………………………………. 38 ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ О ДОБЫЧЕ ПОЛЕЗНАЫХ ИСКОПАЕМЫХ. Добыча полезных ископаемых, их переработка и транспортировка тяжело сказываются на состоянии и плодородии почвенного покрова Земли. Общеизвестно, что хорошие почвы - это обильное плодородие. Но почвы на нашей планете играют и другую, менее известную, но не менее важную роль. В почвенном покрове Земли и ее гумусовой оболочке сосредоточена основная доля живого вещества суши и его биогенной энергии. Отсюда экологическая система “ почва - организмы “ оказывается одним из главнейших механизмов формирования всей биосферы, ее стабильности и продуктивности в целом. (В. Ф. Барабанов 1992 ). Мы привыкли наслаждаться мыслью о необозримости наших просторов. Действительно страна у нас огромная! Ее территория 2227, 6 млн. га. Но важнейшие сельскохозяйственные угодья - пашни, сенокосы, пастбища - на этих просторах занимают примерно лишь одну четверть, а три четверти приходиться на тундру, тайгу, пустыни. Превратить их в плодородные земли дело немыслимое. Не говоря уже о том, что человечество ежегодно теряет около 50 - 70 тыс. км2 земельных ресурсов (Ю. И. Скурлатов, Г. Г. Дука 1994). Куда же деваются наши почвы? Для примера, в 1986 году из недр нашей планеты было извлечено 250 млн. т железной руды, 615 млн. т нефти, 751 млн. т угля, миллионы тонн минеральных удобрений и руд цветных металлов. Но при этом попутно в результате горных работ извлечены и сброшены в отвалы более 8 млрд. т различных горных пород. Если их рассыпать слоем в один метр, он покроет всю площадь, занимаемую ныне Аджарией. И это “результат” лишь одного года работы добывающей промышленности. (В. Ф Барабанов. 1989) . О хватить весь комплекс проблем, связанных с загрязнением почвенных биоценозов, задача очень сложная и многообразная. В почве, населенной мириадами организмов, - от бактерий до млекопитающих, включительно, - процессы обмена столь многообразны и сложны, что мы еще только подходим к их пониманию. В связи с этим, данный реферат представляет очень актуальную и насущную проблему загрязнения почв нефтью и нефтепродуктами. Не секрет, что энергетическая программа России на длительную перспективу предусматривает увеличение добычи “черного золота”, а это, в свою очередь, ведет к расширению сети трубопроводов, возрастает количество перевозок нефти и нефтепродуктов. Таким образом, невозможно полностью исключить вероятность новых аварий, разливов нефти и нефтепродуктов. В то же время нормативы контроля природопользования становятся с каждым годом все жестче, соответственно возрастают размеры штрафов. Для полного понимания и раскрытия представленной проблемы были обработаны некоторые научно - исследовательские работы, которые могут помочь в решении столь сложной и многоплановой задачи, как загрязнение почв нефтью и нефтепродуктами. Предлагаемый реферат рассматривает наиболее важные работы, ведущиеся в указанном направлении. Для того, чтобы рассматривать любую экологическую проблему, необходимо прежде всего знать “ участников “ этой проблемы. В нашем случае “ участниками “ этой проблемы являются: нефть и почва. НЕФТЬ И ЕЁ СОСТАВ. ОСНОВНЫЕ ФАКТОРЫ ЗАГРЯЗНЕНИЯ. Нефть - это жидкий природный раствор, состоящий из большого числа углеводородов (УВ) разнообразного строения и высокомолекулярных смолисто-асфальтеновых веществ. В нем растворено некоторое количество воды, солей, микроэлементов. Главные элементы: С - 83-87%, Н - 12-14%, N, S, O - 1-2%, реже 3-6% за счет S. Десятые и сотые доли процента нефти составляют многочисленные микроэлементы. В качестве эколого-геохимических характеристик основного состава нефти приняты [Ю.И. Пиковский, 1988] содержание легкой фракции (начало кипения 2000С), метановых УВ (включая твердые парафины), циклических УВ, смол, асфальтенов и сернистых соединений. Легкая фракция нефти. Включает низкомолекулярные метановые (алканы), нафтеновые (циклопарафиновые) и ароматические УВ - наиболее подвижная часть нефти. Большую часть легкой фракции составляют метановые УВ (алканы с С5-С11 - пентан, гексан ). Метановые УВ, находясь в почвах, водной или воздушной средах, оказывают наркотическое и токсическое действие на живые организмы. Особенно быстро действуют нормальные алканы с короткой углеводородной цепью. Они лучше растворимы в воде, легко проникают в клетки организмов через мембраны, дезорганизуют цитоплазменные мембраны организма. Большинством микроорганизмов нормальные алканы, содержащие в цепочке менее 9 атомов С, не ассимилируются, хотя и могут быть окислены. Вследствие летучести и более высокой растворимости низкомолекулярных алканов их действие обычно не бывает долговременным. В соленой воде нормальные алканы с короткими цепями растворяются лучше и, следовательно, более ядовиты. Многие исследователи [В. П. Середина 1984, М. А. Глазовская 1980] отмечают сильное токсическое действие легкой фракции на микробные сообщества и почвенных животных. Легкая фракция мигрирует по почвенному профилю и водоносным горизонтам, значительно расширяя ареал первичного загрязнения. С уменьшением содержания легкой фракции токсичность нефти снижается, но возрастает токсичность ароматических соединений, относительное содержание которых растет. Путем испарения из почвы удаляется от 20 до 40% легких фракций [McGill, 1977]. Метановые УВ. В нефтях, богатых легкой фракцией, существенную роль играют более высокомолекулярные метановые УВ (С12-С27), состоящие из нормальных алканов и изоалканов в соотношении 3:1. Метановые УВ с температурой кипения выше 2000С практически нерастворимы в воде. Их токсичность выражена гораздо слабее, чем у УВ с более низкомолекулярной структурой. Содержание твердых метановых УВ (парафинов) в нефти - важная характеристика при изучении нефтяных разливов на почвах. Парафины не токсичны для живых организмов и в условиях земной поверхности переходят в твердое состояние, лишая нефть подвижности. Алканы ассимилируются многими микроорганизмами (дрожжи, грибы, бактерии). Легкие нефтепродукты типа дизельного топлива при первоначальной концентрации в почве 0,5% за 1,5 месяца деградируют на 10-80% от исходного количества в зависимости от содержания летучих УВ. Более полная деградация происходит при рН 7,4 (64,3-90%), в кислой среде (рН 4,5) деградируют лишь до 18,8% [Ю. И. Пиковский 1988]. Твердый парафин очень трудно разрушается, с трудом окисляется на воздухе. Он надолго может “запечатать” все поры почвенного покрова, лишив почву возможности свободного влагообмена и дыхания. Это, в первую очередь, приводит к полной деградации биоценоза. Циклические УВ К ним в нефти относятся нафтеновые и ароматические УВ. Нафтеновые УВ составляют от 35 до 60 % О токсичности нафтенов сведений почти не имеется. Вместе с тем имеются данные о нафтенах как о стимулирующих в-вах при действии на живой организм.( лечебная нефть Нафталанского мест-я в Азербайджане).Биологически активным фактором этой нефти служат полициклические нафтеновые структуры. Основные продукты окисления нафтеновых УВ- кислоты и оксикислоты. К ароматическим УВ (аренам) относятся как собственно ароматические структуры - 6-ти членные кольца из радикалов -СН-, так и “гибридные” структуры, состоящие из ароматических и нафтеновых колец. Содержание в нефти ароматических УВ от 5 до 15 %, чаще всего от 20 до 40 %. Основная масса ароматических структур составляют моноядерные УВ - гомологи бензола. Полициклические ароматические УВ (ПАУ) с двумя и более ароматическими кольцами содержатся в нефти от 1 до 4 %. Среди голоядерных ПАУ большое внимание обычно уделяется 3,4-бензпирену как наиболее распространенному представителю канцерогенных веществ. Ароматические УВ - наиболее токсичные компоненты нефти. В концентрации всего 1 % в воде они убивают все водные растения. Нефть содержащая от 30 до 40 % ароматических УВ значительно угнетает рост высших растений. Моноядерные УВ - бензол и его гомологи оказывают более быстрое токсическое воздействие на организмы чем ПАУ так как ПАУ медленнее проникают через мембраны клеток. Однако, в целом, ПАУ действуют более длительное время, являясь хроническими токсикантами. Ароматические УВ трудно поддаются разрушению. Экспериментально показано, что главным фактором деградации ПАУ в окружающей среде, в особенности в воде и воздухе, является фотолиз, инициированный ультрафиолетовым излучением.[ А.И. Шилина]. В почве этот процесс может происходить только на ее поверхности. Смолы и асфальтены. Смолы и асфальтены - это высокомолекулярные неуглеводородные компоненты нефти. Смолы - вязкие мазеподобные в-ва, асфальтены - твердые, нерастворимые в низкомолекулярных УВ. По содержанию смол и асфальтенов нефти подразделяются на: o малосмолистые ( от 1 - 2 до 10 % смол и асфальтенов ) o смолистые ( 10 - 20 % ) o высокосмолистые ( 23 - 40 % ) Смолы и асфальтены содержат основную часть микроэлементов нефти, в том числе почти все металлы. Среди нетоксичных и малотоксичных металлов можно выделить: Si, Fe, Al, Mn, Ca, Mg, P. Другие микроэлементы: V, Ni, Co, Pb, Cu, U, As, Hg, Mo, в случае повышенных концентраций могут оказывать токсическое воздействие на биоценоз. Вредное экологическое влияние смолисто - асфальтеновых компонентов на почвенные экосистемы заключается не в химической токсичности, а в значительном изменении водно - физических св - в почв. Если нефть просачивается сверху, ее смолисто - асфальтеновые компоненты сорбируются в основном в верхнем, гумусовом горизонте иногда прочно цементируя его. При этом уменьшается поровое пространство почв. Смолисто - асфальтеновые компоненты гидрофобны. Обволакивая корни растений, они резко ухудшают поступление к ним влаги в результате чего растения погибают. Эти в-ва малодоступны микроорганизмам, процесс их метаболизма идет очень медленно, иногда десятки лет. В целом при окислительной деградации нефти в почвах, независимо от того, происходит механическое вымывание загрязняющих в - в или нет, идет накопление смолисто - асфальтеновых в - в. Разрушение и вынос компонентов УВ фракции происходят гораздо быстрее. За те 400 млн. Лет, что жизнь на Земле вышла на сушу, с поверхностью нашей планеты произошли большие изменения: каменистые и глинисто-песчаные пустыни покрылись тонкой оболочкой среды обитания наземных животных и растений. Определяющую роль в формировании этой живой оболочки Земли сыграли фотосинтезирующие растения. Вследствие их деятельности поверхностный слой Земли обогатился органическими веществами, насытился множеством гетеротрофных микроорганизмов, сформировались почвенные экосистемы, дающие пищу для животных. Они же служат основными источниками пищи и для человека. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ПОЧВЫ. Таким образом почва - это связующее звено между атмосферой, гидросферой, литосферой и живыми организмами и играет важную роль в процессах обмена веществами и энергией между компонентами биосферы. Почва - это средоточие жизни, среда обитания многих живых организмов. “Дыхание” почвы существенно изменяет состав приземного слоя атмосферы. Почвенная влага, формируясь из атмосферных осадков, в дальнейшем определяет химический состав грунтовых, речных, озерных и в значительной мере морских вод. В почве постоянно и одновременно протекают химические, физические и биологические процессы. Немаловажную роль здесь играют процессы ферментативного и каталитического окисления, восстановления и гидролиза. В результате почва обогащается необходимыми неорганическими и органическими веществами, происходит химический круговорот веществ - сущность развития почвы, ее плодородия. Под плодородием понимают свойство почвы удовлетворять потребности растений в элементах питания и воде, снабжать корневые системы необходимым количеством воздуха и теплоты, обеспечивая тем самым нормальную жизнедеятельность растений. Важное значение для осуществления почвенных процессов имеет структура почвы. Любую почву можно рассматривать как гетерогенную, многофазную систему, состоящую из твердой ( минеральный “скелет”, органический и биологический компоненты ), жидкой ( почвенный раствор ) и газообразной ( почвенный воздух ) фаз. Почва представляет собой биоминеральную ( биокосную ) динамическую систему, находящуюся в материальном и энергетическом взаимодействии с внешней средой и частично замкнутую через биологический круговорот веществ. Минеральный состав почв складывается в основном из кварца ( SiO2) и алюмосиликатов ( SiO2 . Al2O3 . H2O ) в различных соотношениях. Твердая фаза почв и почвообразующих пород состоит из разномерных частиц ( педов ) - механических элементов. Относительное содержание в почве таких элементов определяет ее гранулометрический состав. В зависимости от размеров частиц различают песчаные, суглинистые и глинистые почвы. От механического состава почв и почвообразующих пород в значительной мере зависит интенсивность многих почвенных процессов, связанных с превращениями, переносом и накоплением в почве органических и минеральных соединений. Органический компонент почв представлен гумусовыми веществами, служащими источниками питания для почвенных микроорганизмов и структураторами почв. Гумусообразование происходит в результате превращения органических остатков, поступающих в почву после отмирания растений. Биологическая составляющая почвенных экосистем представлена зелеными растениями, микроорганизмами и животными. При воздействии организмов на почву в процессе их жизнедеятельности осуществляются важнейшие звенья почвообразования - синтез и разрушение органического вещества, избирательное концентрирование биологически важных микроэлементов, разрушение и новообразование минералов и аккумуляции веществ. Основная почвообразующая роль принадлежит лесной растительности. Ее биомассы на поверхности суши составляет 1011 - 1012 т. Остатки растительности поступают на поверхность почвы в основном в виде опада. На втором месте по биомассе почвообразующих зеленых растений - травянистая растительность ( 1010 - 1011 т ). При этом биомасса корней обычно превышает биомассу наземной части травянистой растительности. В формировании плодородия почв принадлежит почвенным микроорганизмам. Здесь обитают в большом количестве бактерии, микроскопические грибы и водоросли. Общее число микроорганизмов в почве исчисляется миллиардами в 1 гр. Микрофлора почвы по объему составляет около 0,1% ее объема, 7 - 10 т на 1 га или в сухом весе примерно 2 т живого вещества на гектар. Особенно важную роль в почвенном круговороте веществ играют бактерии. Гетеротрофные бактерии разлагают органические остатки до простых минеральных соединений. Афтотрофные бактерии осуществляют в почве процессы окисления минеральных соединений - продуктов жизнедеятельности гетеротрофов. Широко распространенные в почвах серобактерии окисляют Н2S, S, и тиосоединения до Н2SO4 (процесс сульфофикации). При участии железоокисляющих бактерий, наиболее распространенных в заболоченных почвах, происходит окисление солей Fe (II). В почве содержится много бактерий - азотфиксаторов: свободно живущих и клубеньковых. На отмирающих органических остатках живут сапрофитные гетеротрофные бактерии и грибы. Микроскопические грибы (плесневые, актиномицеты) в аэробных условиях могут разлагать клетчатку, лигнин и другие стойкие органические соединения, участвуют в минерализации гумуса. Их гифы достигают нескольких тысяч метров на 1 г почвы. Наряду с бактериями и грибами в почве присутствует большое количество водорослей, в основном в поверхностном слое и на растениях. Плодородие почвы определяется содержанием в ней гумусовых веществ. Эти вещества химически и микробиологически устойчивы. Они являются промежуточными продуктами в процессе образования угля. Зрелые гумусовые почвенные горизонты формируются за сотни лет, а минеральные - за тысячи и миллионы лет. Потери почвенного покрова во всем мире велики. Общая площадь почв, разрушенных за всю историю человечества, достигла 20 млн. км2, что намного превышает площадь всей пахотной земли, используемой в настоящее время. В результате застройки, производства горных работ, опустынивания и засоления почв мировое сельское хозяйство ежегодно теряет около 50 - 70 тыс. км2 (Ю. И. Скурлатов 1994). Таким образом, после краткого знакомства с “ участниками “ этой экологической проблемы, можно перейти непосредственно к изучению взаимодействия между почвой и нефтью, которые, как это не парадоксально звучит, вовсе не являются “ соседями “, но ставшие таковыми в результате “ хозяйственной “ деятельности человека. ЕСТЕСТВЕННАЯ ТРАНСФОРМАЦИЯ НЕФТИ В ПОЧВЕ. Исследование трансформации нефти, попавшей в почву в результате разливов или утечек в местах хранения или транспортировки, необходимо для понимания механизмов самоочищения и восстановления почв, нарушенных техногенезом. Знание стадий трансформации нефти позволит определить давность загрязнения и сроки восстановления почв, повысить эффективность контроля за загрязнением среды нефтью и нефтепродуктами. Окисление отдельных классов УВ, входящих в состав нефти, в частности микробиологическое окисление, изучается в настоящее время довольно подробно, существует достаточно много работ по этим вопросам (Н. М. Исмаилов 1985, Ф. Х. Хазиев 1981, М. А.Глазовская 1979 и др. ). Авторы выделяют следующие наиболее общие этапы трансформации нефти: o Физико-химическое и частично микробиологическое разрушение алифатических УВ. o Микробиологическое разрушение низкомолекулярных структур разных классов, новообразование смолистых веществ. o Трансформация высокомолекулярных соединений - смол, асфальтенов, полициклических УВ. В соответствии с этапами биодеградации происходит регенерация биоценозов. Процессы идут разными темпами на разных ярусах экосистем. Значительно медленнее, чем микрофлора и растительный покров, формируется сапрофитный комплекс животных. Полной обратимости процесса, как правило, не наблюдается. Наиболее сильная вспышка микробиологической активности приходится на второй этап биодеградации нефти. При дальнейшем снижении численности всех групп микроорганизмов до контрольных значений, численность углеводородокисляющих организмов на многие годы остается аномально высокой по сравнению с контролем. Ю.И. Пиковский (1988) отмечает, что при нефтяном загрязнении взаимодействуют три экологических фактора: а) сложность, уникальная поликомпонентность состава нефти, находящегося в состоянии постоянного изменения; б) сложность, гетерогенность состава и структуры любой экосистемы, находящийся в процессе постоянного развития и изменения; в) многообразие и изменчивость внешних факторов, под воздействием которых находится экосистема: температура, давление, влажность, состояние атмосферы, гидросферы и др. Исходя из этого, оценивать последствия нефтяного загрязнения необходимо с учетом конкретного сочетания этих трех групп факторов. Рассматривая общие закономерности трансформации нефти в почве, Ю.И. Пиковский (1988) отмечает, что нефть - это высокоорганизованная субстанция, состоящая из множества различных компонентов. Она деградирует в почве очень медленно, процессы окисления одних структур ингибируются другими структурами, трансформация отдельных соединений идет по пути приобретения форм, трудноокисляемых в дальнейшем. На земной поверхности нефть оказывается в другой обстановке - в аэрируемой среде. Основной механизм окисления УВ разных классов в аэробной среде следующий: внедрение кислорода в молекулу, замена связей с малой энергией разрыва (С-С, С-Н) связями с большой энергией, следовательно, процесс протекает самопроизвольно. Главный абиотический фактор трансформации - ультрафиолетовое излучение. Фотохимические процессы могут разлагать даже наиболее стойкие полициклические УВ за несколько часов. Конечные продукты метаболизма нефти в почве следующие: · Углекислота, которая может связываться в карбонаты, и вода. · Кислородные соединения (спирты, кислоты, альдегиды, кетоны), которые частично входят в почвенный гумус, частично растворяются в воде и удаляются из почвенного профиля. · Твердые нерастворимые продукты метаболизма - результат дальнейшего уплотнения высокомолекулярных продуктов или связывания их в органо-минеральные комплексы. · Твердые корочки высокоминеральных компонентов нефти на поверхности почвы (киры). Вместе с тем изучению трансформации всей системы соединений, входящих в состав нефти, на природных моделях уделялось еще мало внимания. М. А Глазовская., Ю. И Пиковский. (1985) отмечают, что главной целью изучения загрязнений природной среды является быстрейший возврат непригодных для использования земель в сельскохозяйственное производство, восстановление их первоначальной продуктивности или рекреационных качеств. Скорость разложения нефти по данным разных авторов различается в пять и более раз, восстановление первоначальной продуктивности земель при активной рекультивации происходило в одних случаях в течение года, в других растягивалось от нескольких лет до 12 и более. Так, А. А Оборин., И. Г Калочникова., Т. А Масливец. (1988), изучая процессы самоочищения нефтезагрязненных почв Предуралья и Западной Сибири на примере экспериментальных пробных площадок, выделили следующие этапы деградации нефти в почве: - I этап (первые 1-1,5 года). Имеют место физико-химические процессы: распределение УВ по профилю, испарение, вымывание, ультрафиолетовое облучение. К концу первого года полностью исчезают н-алканы. Биота подавлена, идет адаптация к новым условиям и постепенное повышение количества микроорганизмов, особенно углеродокисляющих. - II этап (3-4 года). Частичная биохимическая деструкция сложных гибридных молекул, изменение состава нефти. Вспышка численности микроорганизмов, к концу этапа - ее снижение. - III этап (для исследуемых зон через 58-62 месяца). Исчезновение остаточной нефти в исходных и вторичных парафиновых УВ. Эти кажущиеся различия объясняются различными почвенно - климатическими условиями, в которых производились наблюдения. Очевидно, что для такой обширной территории, как наша страна не может быть разработано единых рекомендаций для всех районов по защите и рекультивации земель нарушенных при транспортировке, добыче и переработке нефти. В качестве доказательства можно привести пример рекультивации с применением выжига нефти. Допустимый для одних районов он может быть пагубным для природной среды в других ( вследствие, например, деградации мерзлого слоя ). Проведенная дифференциация территории служит научным обоснованием мероприятий по защите и восстановлению природной среды. Чтобы сделать эти мероприятия наиболее эффективными, для каждого ландшафтного района необходимо знать природные механизмы самоочищения, факторы, ускоряющие этот процесс, количественные критерии, характеризующие разные стадии изменения нефти, почв, растительности, а также скорость восстановления последних. Получить такие данные (на которые должен ориентироваться контроль за загрязнением окружающей среды нефтью и нефтепродуктами) можно путем постановки специальных экспериментов на природных моделях. Суть эксперимента состоит в следующем. В пределах выбранных природных моделей на экспериментальных площадках, в почву с поверхности вносится определенное количество нефти того состава который наиболее распространен в данном районе. Через фиксированные промежутки времени на загрязненном и контрольном участках проводятся наблюдения за состоянием растительности и отбираются пробы почв по генетическому профилю для исследования в лаборатории. Отличие предложенного Глазовской М. А. и др. 1985 эксперимента прежде всего в том, что впервые задумана система опытов, охватывающих различные природные зоны, резко контрастные в климатическом отношении. В этих опытах равное значение имеют биолого - почвенные, геохимические, битуминологические исследования, которые для всех районов выполняются на единой методической основе. По времени в каждом районе эксперимент рассчитан на несколько лет ( не менее трех ). Первые результаты работ по комплексному эксперименту были получены на целинных участках в следующих природных зонах: лесотундра в низовье р. Оби ( тундрово - глеевые почвы), средняя тайга в Среднем Приобье ( песчано - подзолистые почвы ), южная тайга в Пермском Прикамье (дерново - подзолистые почвы ), сухие субтропики Апшеронского п - ва (светлые серо - коричневые почвы ). Исследования ведутся также в Белоруссии, Татарии, Башкирии, намечается распространить эксперимент и на другие районы. Проведенные наблюдения позволили выявить некоторые общие черты процесса самоочищения почв и его особенности в природных зонах. На всех экспериментальных площадках содержание нефти в почве резко снижалось в первые три месяца после начала опытов и в дальнейшем продолжало снижаться, но с меньшей скоростью. Основные причины снижения содержания нефти следующие: испарение легких фракций, минерализация нефти, физический вынос водными потоками, лимификация (превращение в нерастворимые в нейтральных органических растворителях продукты микробиологического метаболизма). Соотношение этих факторов самоочищения зависит от почвенно - климатических условий, состава и свойств самой нефти и глубины ее проникновения в почву. Поскольку для данного реферата модельные эксперименты, упомянутые выше, представляются подчас единственным способом в понимании столь сложной проблемы как загрязнение почвы нефтью и нефтепродуктами, хотелось бы более подробно остановиться на одном из подобных экспериментов, выполненных Пиковским Ю. И, Калочниковой И. Г. 1985. Авторы провели наблюдения за изменением состава трех разновидности нефти: тяжелой нефти Бинагадинского месторождения Азербайджана (р-0,935), нефти Ярино- Каменноложского мест-я Пермской области (р-0,820) и нефти Федоровского мест-я Западной Сибири (р-0,840). Первые две названные нефти были внесены соответственно на поверхности светлой серо-коричневой и дерново-подзолистой почв вблизи мест добычи. Федоровская нефть вносилась в почву разных природных зон: лесотундры, средней и южной тайги. В течение месяца в светлой серо-коричневой почве аридной зоны нефть проникла на глубину 10-13 см., в подзолистой и дерново-подзолистой почве гумидной зоны на глубину 30-40 см. Состав нефти, впитавшейся в почву периодически исследовался (начиная от двух недель до двух лет после загрязнения). Состав нефти, впитавшейся в почву периодически исследовался (начиная от двух недель до двух лет после загрязнения). Остаточная нефть экстрагировалась из почвенных проб хлороформом без нагревания. Растворитель отгонялся при комнатной температуре. Вещество хроматографировалось в незакрепленном слое силикагеля с выделением метано-нафтеновой, нафтено-ароматической УВ фракций, смол и асфальтенов. Метаново-нафтеновая фракция исследовалась методом газожидкостной хроматографии, нафтено-ароматическая - методом низкотемпературной спектрофлуориметрии при температуре 77К. Нефракционированная нефть исследовалась методом инфракрасной спектрометрии. Изменения химического состава нефти, происходящие параллельно со снижением ее содержания в почве, заметны уже в первые три месяца после начала опыта. По данным изучения инфракрасных спектров в нефти относительно возрастает количество кислородосодержащих соединений и появляются сероорганические соединения. Со временем неуклонно происходит относительное уменьшение групп СН2 и СН3 (полосы 1470 и 1380 см -1). Процесс постепенного изменения состава нефти в почвах во времени отчетливо прослеживается по изменению содержания и состава ее групповых компонентов. По истечении срока эксперимента были получены следующие выводы: - На фоне общего снижения концентраций нефти в почве снижение содержания ее групповых компонентов происходит неравномерно. Быстрее других компонентов уменьшается относительное и абсолютное содержание метаново-нафтеновой фракции. Эти УВ легче поддаются биодеградации, кроме того, они более растворимы в воде, что облегчает их вынос за пределы участков загрязнения. - Одновременно в нефти увеличивается содержание смолистых в-в. Это увеличение происходит не только за счет уменьшения доли других компонентов и более высокой устойчивости смол, но и за счет их новообразования в процессе трансформации нефти. - Относительное содержание нафтено-ароматической фракции и асфальтенов в нефти во времени меняется незначительно, хотя их абсолютное содержание в почве также снижается. Рассматривая изменение состава отдельных групповых компонентов нефти было показано, что уже в первые три месяца заметны признаки микробиологического воздействия на метано-нафтеновую фракцию. Относительно увеличивается количество изопреноидных структур - ненасыщенных УВ типа пристана с числом углеродных атомов в молекуле - 19 и фитана с числом углеродных атомов - 20. В течение последующего года начинает снижаться относительное содержание изопреноидов типа фитана. Кроме того, в составе этой фракции с течением времени снижается содержание УВ (С20-С24) и увеличивается содержание тяжелых (С27-С31) УВ. В составе нафтено-ароматической фракции всех изучавшихся разновидностей нефти установлен один и тот же набор полициклических ароматических УВ. Эти УВ представлены широким диапазоном алкилзамещенных структур - от низко-кольчатых (нафталины и фенантрены) до многокольчатых со структурой 3,4-бенз(а)пирена. Наблюдения показали, что во время инкубации нефти в почве происходит постепенное снижение во фракции всех групп полициклических ароматических УВ. Наиболее быстро снижается содержание УВ с меньшим к-вом ядер в структуре: нафталинов, бензфлуоренов, фенантренов, хризенов. Медленнее всего происходит снижение пиренов, которые являются , по видимому, наиболее устойчивыми среди УВ данного класса. Таким образом, приведенные Пиковским Ю. И., Калочниковой И. Г. 1985, данные показали наиболее общие тенденции в трансформации загрязняющих почвы нефтей в различных природных зонах. Эта трансформация в разных природно-климатических условиях идет с различной скоростью. Так, содержание метаново-нафтеновой фракции Федоровской нефти за один год в условиях лесотундры снизилось на 34%, в средней тайге- на 46%, в условиях южной тайги- на 55%. Возможности деградации природной среды при добыче и транспортировке нефти могут отражаться на ландшафтно-геохимических прогнозных картах. М.А. Глазовская, В.В. Батоян и др. (1985), занимаясь составлением таких карт, выяснили, что опасность загрязнения и возможность самочищения почв от продуктов нефтедобычи в отдельных зонах и областях страны различаются. Опасность остаточного накопления нефтепродуктов возрастает с юга на север. В пределах отдельных биоклиматических зон опасность возрастает от песчаных почв к глинистым, от мезоморфных к гидроморфным, от распаханных к целинным. При составлении прогнозов деградации авторы рекомендуют пользоваться понятием КЛГС - каскадной ландшафтно-геохимической системы. КЛГС - это совокупность местных ландшафтов, находящихся в одном бассейне стока на разных гипсометрических уровнях и связанных между собой потоками вещества, энергии и информации. Прогноз для любого района необходимо строить с учетом всей КЛГС. Характер техногенных воздействий на КЛГС определяется положением очагов этих воздействий (нефтегазоносных бассейнов). Чем ниже находится очаг техногенного воздействия в цепочке звеньев каскада, тем влияние нефтезагрязненных территорий на КЛГС наименьшее. Авторы выделили шесть рангов по степени опасности деградации среды. Они утверждают, что анализ антропогенного воздействия на среду всегда должен быть системным, т.е. учитывать не только участок непосредственного воздействия, но и изменения, происходящие при этом во всей ландшафтно-геохимической системе или подсистеме. Как уже указывалось выше, почвенные “ жители “ это основа почвенного плодородия. Без микроорганизмов почва мертва. Можно представить себе, что происходит с почвенной флорой и фауной при внезапном вторжении столь агрессивного поллютанта, как нефть. НЕФТЯНОЕ ЗАГРЯЗНЕНИЕ. Нефтяное загрязнение создает новую экологическую обстановку, что приводит к глубокому изменению всех звеньев естественных биоценозов или их полной трансформации. Общая особенность всех нефтезагрязненных почв - изменение численности и ограничение видового разнообразия педобионтов (почвенной мезо- и микрофауны и микрофлоры). Типы ответных реакций разных групп педобионтов на загрязнение неоднозначны (Н. М. Исмаилов 1985): ь Происходит массовая гибель почвенной мезофауны: через три дня после аварии большинство видов почвенных животных полностью исчезает или составляет не более 1% контроля. Наиболее токсичными для них оказываются легкие фракции нефти. ь Комплекс почвенных микроорганизмов после кратковременного ингибирования отвечает на нефтяное загрязнение повышением валовой численности и усилением активности. Прежде всего это относится к углеводородоокисляющим бактериям, количество которых резко возрастает относительно незагрязненных почв. Развиваются “специализированные “ группы, участвующие на разных этапах в утилизации УВ. ь Максимум численности микроорганизмов соответствует горизонтам ферментации и снижается в них по профилю почв по мере уменьшения концентраций УВ. Основной “ взрыв “ микробиологической активности падает на второй этап естественной деградации нефти. ь В процессе разложения нефти в почвах общее количество микроорганизмов приближается к фоновым значениям, но численность нефтеокисляющих бактерий еще долгое время превышает те же группы в незагрязненных почвах (южная тайга 10 - 20 лет). ь Изменение экологической обстановки приводит к подавлению фотосинтезирующей активности растительных организмов. Прежде всего это сказывается на развитии почвенных водорослей: от их частичного угнетения и замены одних групп другими до выпадения отдельных групп или полной гибели всей альгофлоры. Особенно значительно ингибирует развитие водорослей сырая нефть и минеральные воды. ь Изменяются фотосинтезирующие функции высших растений, в частности злаков. Эксперименты показали, что в условиях южной тайги при высоких дозах загрязнения - более 20 л/м2 растения и через год не могут нормально развиваться на загрязненных почвах. ь Исследования показали, что в загрязненный почвах снижается активность большинства почвенных ферментов (Н. М. Исмаилов, Ю. И. Пиковский 1985). При любом уровне загрязнения ингибируются гидролазы, протеазы, нитратредуктазы, дегидрогеназы почв, несколько повышается уреазная и каталазная активности почв. ь Дыхание почв также чутко реагирует на нефтяное загрязнение. В первый период, когда микрофлора подавлена большим количеством УВ, интенсивность дыхания снижается, с увеличением численности микроорганизмов интенсивность дыхания возрастает. Итак, процессы естественной регенерации биогеоценозов на загрязненных территориях идут медленно, причем темпы становления различных ярусов экосистем различны. Сапрофитный комплекс животных формируется значительно медленнее, чем микрофлора и растительный покров. Пионерами зарастания нарушенных почв часто являются водоросли. ВОССТАНОВЛЕНИЕ ЗАГРЯЗНЕЕНЫХ ПОЧВ. Говоря о процессах восстановления нефтезагрязненных почвенных экосистем, многие исследователи (например, Т.П. Славина, М.И. Кахаткина и др., 1986) обращают внимание на то, что обычные рекультивационные мероприятия имеют ряд недостатков - не всегда способствуют восстановлению почв и растительности и часто сами наносят долговременный вред природе. Землевание замедляет процессы разложения нефти. Вывоз загрязненного слоя создает новые очаги вторичного загрязнения. Исследования показывают, что при сжигании нефти сроки естественного восстановления нефтезагрязненных почв значительно увеличиваются, происходит образование полициклических ароматических УВ, обладающих канцерогенными свойствами, следовательно увеличивается токсичность почв, затормаживается восстановление всех блоков экосистемы. В настоящее время научно обоснованные методы ликвидации последствий загрязнения отсутствуют. Для максимального уменьшения неблагоприятного воздействия необходимо знание законов трансформации загрязненных экосистем и загрязняющих веществ, прогноз их изменения во времени. Н.М. Исмаилов, Ю.И. Пиковский (1988) считают, что концепция восстановления загрязненных экосистем должна опираться на следующий принцип: не нанести экосистеме больший вред, чем тот, который уже нанесен при загрязнении. Суть концепции - максимальная мобилизация внутренних ресурсов экосистемы на восстановление своих первоначальных функций. Рекультивация, по определению исследователей, - это продолжение процесса самоочищения, при котором используются природные резервы экосистемы: климатические, микробиологические, ландшафтно-биохимические. Концепция восстановления загрязненных земель исходит из положения, что в разных почвенно-климатических и ландшафтно-геохимических условиях процессы трансформации загрязнителей аналогичного типа в одних и тех же дозах происходят с разной скоростью и останавливаются на разных стадиях. Различаются и результаты воздействия разных доз загрязнителей на экосистемы. Самоочищение и самовосстановление экосистем - стадийный биохимический процесс трансформации загрязняющих веществ, сопряженный со стадийным восстановлением биоценоза. В соответствии с этапами биодеградации происходит регенерация биоценозов. Процессы идут разными темпами на разных ярусах экосистем. Значительно медленнее, чем микрофлора и растительный покров, формируется сапрофитный комплекс животных. Полной обратимости процесса, как правило, не наблюдается. Наиболее сильная вспышка микробиологической активности приходится на второй этап биодеградации нефти. При дальнейшем снижении численности всех групп микроорганизмов до контрольных значений, численность углеводородокисляющих организмов на многие годы остается аномально высокой по сравнению с контролем. Н.М. Исмаилов, Ю.И. Пиковский (1988) неоднократно подчеркивают, что механические и физические методы рекультивации не могут обеспечить полное удаление нефти и нефтепродуктов из почвы. Разложение нефти в почве в естественных условиях - процесс биогеохимический, в котором главное и решающее значение имеет функциональная активность комплекса почвенных микроорганизмов, обеспечивающих полную минерализацию нефти и нефтепродуктов до углекислого газа и воды. Ускорить очистку почв с помощью микроорганизмов можно в основном двумя способами: активизацией метаболической активности микрофлоры почв путем изменения физико-химических условий среды ( агротехнические приемы ) или внесением специально подобранных активных нефтеокисляющих микроорганизмов в загрязненную почву. Анализ многочисленных работ по рекультивации нефтезагрязненных почв дает противоречивые результаты - одни и те же мероприятия в разных условиях приводят к неодинаковым последствиям. Вышеупомянутые авторы намечают наиболее общие принципы интенсификации самоочищающей способности почв. На первом этапе, когда геохимическая обстановка наиболее токсична, целесообразно проводить подготовительные мероприятия: аэрацию, увлажнение, локализацию загрязнения. На втором этапе возможен пробный посев культур с целью оценки остаточной фототоксичности почв, работы по регулированию водного режима и кислотных условий, в случае необходимости - рассоление. На третьем этапе восстанавливаются естественные растительные биоценозы, создаются культурные фитоценозы, практикуется посев многолетних растений. Длительность процесса рекультивации зависит от почвенно-климатических условий и характера загрязненности. В настоящее время все способы рекультивации почв не являются достаточно приемлимыми. Рассмотрим их основные недостатки: Обработка почвы сольвентами приводит к частичному или полному уничтожению в почве колоний микроорганизмов, что приводит соответственно к обеднению почвенного состава и уничтожению всех плодородных свойств почвы. В результате выпаривания, которое происходит при температуре не ниже 700-800С вся почвенная органика сгорает в прямом смысле слова. В результате этих мер очистки почвы мы имеем полностью стерильную почву, которая не пригодна для жизни растений и останется такой еще в течении многих лет, даже если пытаться стимулировать рост бактерий, внося в почву новые штаммы микро организмов или производя смешивание “пустой” почвы с почвенными культурами, взятыми из других областей. С экономической точки зрения данный метод также является невыгодным, т.к. вещества, которыми обрабатывается почва используются в больших количествах и являются дорогостоящими. Срезка зараженного грунта приводит прежде всего к образованию новых очагов загрязнения. В результате срезки появляются места с почвенным голоданием, что особенно актуально в местах наиболее частых разливов нефти, т.е. за Полярным кругом. При выполнении этих работ затрачивается большой объём средств, т.к. необходимо эвакуировать большое количество зараженного грунта, что приводит к занятости большого числа людей и техники. Наиболее перспективным методом обеззараживания почв, по мнению многих научных деятелей, является принудительное окисление нефти и нефтепродуктов при помощи почвенных микроорганизмов. Практика внесения в почву бактериальных штаммов сейчас пока еще не очень распространена. Этому имеется много причин, одной из которых является несовместимость условий нормальной жизнедеятельности бактерий с условиями данного региона. Например, в местах основной нефтедобычи, т.е. в условиях крайнего севера, многие виды бактерий не жизнеспособны вследствие низких температур и специфического почвенного состава. Поэтому необходимо производить исследования для выявления возможных бактериальных штаммов. В настоящее время ведутся исследования в области искусственного стимулирования роста бактериальных штаммов. Известны два основных направления. Первое: внесение в почву, загрязненную нефтью аналогичной незагрязненной почвы для образования семейств бактерий и стимуляции их роста. Второе: Использование метал-лигандных соединений. В почву в виде суспензии вводятся металлические соединения, в результате вокруг катиона металла образуется магнитное поле в котором молекулы воды , кислорода , азота ориентируются особым образом , что создает особый водно-кислородный режим , из-за которого значительно улучшаются физико-химические свойства почв . Кроме этого в магнитном поле катиона гораздо лучше развиваются бактерии , в результате деятельности которых идет процесс окисления нефти . В природных условиях В качестве катионных центров обычно выступают щелочные металлы Ca, K, Na . Исследования показывают , что потенциал переходных металлов гораздо больше , что и учитывается в приготовлении почвенных добавок . Обычно используются ферриты Fe-S,Fe2-S2 и т.д. В этом случае имеется еще один плюс в том что эти вещества в огромных количествах встречаются в отвалах теплоэлектростанции и при их отделении они получаются почти чистыми . Внесение их в зараженную почву имеет двоякий эффект во-первых стимуляция роста бактериальных семейств , во-вторых окультуривание почв. Избранные материалы из Автореферата диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук ДРАЧУК Сергея Владимировича на тему: «ФОТОГЕТЕРОТРОФНЫЕ ПУРПУРНЫЕ БАКТЕРИИ В ПОЧВАХ, ЗАГРЯЗНЁННЫХ УГЛЕВОДОРОДАМИ» под научным руководством к. б. н., профессора Фирсова Н.Н. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. Широкое применение в хозяйственной деятельности человека нефти и нефтепродуктов приводит к загрязнению окружающей среды различными углеводородами. По данным А.М. Рябчикова (1974), при добыче и переработке нефти, а также при использовании нефтепродуктов во всем мире ежегодно теряется 45 х 106 тонн углеводородов. Возрастающие масштабы нефтяного загрязнения окружающей среды приводят к необходимости поиска методов борьбы с этими поллютантами. Главными природными деструкторами нефти и нефтепродуктов являются углеводородокисляющие микроорганизмы. Поиск непосредственных деструкторов нефти или микроорганизмов, ускоряющих в смешанных культурах процессы потребления углеводородов, например благодаря способности к фиксации молекулярного азота - важная задача экологической биотехнологии. Помимо методов рекультивации, предусматривающих интродукцию углеводородокисляющих микроорганизмов в экосистему, большое значение приобретают методы, основанные на стимуляции естественной нефтеокисляющей микрофлоры (Коронелли, 1996). Поэтому необходимо изучать все группы микроорганизмов, способные участвовать в деструкции нефти и нефтепродуктов. Исследованию микроорганизмов, ассимилирующих углеводороды, посвящено огромное количество научных публикаций. Большинство авторов сосредоточило все внимание на аэробных хемогетеротрофных бактериях и грибах. Сведения о возможном участии в биодеградации нефти фотогетеротрофных микроорганизмов очень ограничены. В то же время, в литературе можно найти сообщения о распространении бактерий, способных к фотогетеротрофному росту в пластовых водах нефтяных месторождений, хотя причины этого явления окончательно не установлены (Розанова, Худякова, 1970; Розанова, 1971а). В обзоре, посвящённом использованию аноксигенных фототрофных бактерий в биотехнологии (Sasikala, Ramana, 1995), приводятся данные о возможности роста пурпурных бактерий на средах с нефтепродуктами и об u1080 использовании этих микроорганизмов для очистки вод, загрязнённых углеводородами. Фотогетеротрофные пурпурные бактерии ранее объединяли в группу пурпурных несерных бактерий (сем. Rhodospirillaceae ). Данные геносистематики позволили отнести большую часть этих микроорганизмов к б – подклассу класса Proteobacteria (Stackebrandt et al .,1988). Пурпурные несерные бактерии обладают большим разнообразием метаболических путей и таким свойством, как способность к азотфиксации. Большой интерес может представлять их участие в биодеградации нефти в составе смешанных микробных культур или как самостоятельных деструкторов углеводородов. Совершенно неизученным остаётся вопрос о распространении этих микроорганизмов в почвах и грунтах, подверженных нефтяному загрязнению. Цель настоящего исследования - изучение закономерностей распространения фотогетеротрофных пурпурных бактерий в почвах, загрязнённых нефтью и нефтепродуктами, и оценка роли этих микроорганизмов в биодеградации углеводородов. Основные задачи исследования: 1. Выявить наличие фотогетеротрофных бактерий в почвах и грунтах, загрязнённых нефтью и нефтепродуктами. Определить их численность в этих природных субстратах в зависимости от величины углеводородного загрязнения, сравнить численность пурпурных бактерий с количеством аэробных нефтеокисляющих микроорганизмов. 2. Выделить из загрязнённых биоценозов чистые культуры фотогетеротрофных пурпурных бактерий и описать их физиологические и морфологические свойства с целью установления систематической принадлежности. 3. Установить, способность этих бактерий использовать нефтепродукты в качестве. единственного источника углерода и энергии. 4. Выяснить способность пурпурных бактерий к совместному росту с аэробными нефтеокисляющими микроорганизмами на средах с нефтепродуктами. Установить влияние пурпурных бактерий на рост нефтеокисляющих микроорганизмов и деструкцию ими углеводородов. Научная новизна. На основании изучения нефтезагрязнённых почвенных проб, отобранных в разных районах Среднего Урала и Западной Сибири, впервые показано, что фотогетеротрофные пурпурные бактерии являются частью почвенного микробоценоза в условиях загрязнения нефтью. В результате лабораторных опытов по интродукции штаммов пурпурных бактерий в почву выявлено влияние некоторых факторов на развитие этих микроорганизмов (концентрация дизельного топлива, влажность почвы, освещённость). Впервые выделены чистые культуры пурпурных бактерий из загрязнённой почвы, дана их физиологическая характеристика. Установлена возможность метаболического взаимодействия пурпурных бактерий и гетеротрофных нефтеокисляющих грибов и бактерий. Обнаружены штаммы фотогетеротрофных бактерий, способных расти в аэробных условиях на среде с дизельным топливом в качестве единственного источника углерода и энергии. Теоретическое и практическое значение работы. Полученные данные расширяют представление об экологии пурпурных бактерий, дают представление об участии этих микроорганизмов в биодеградации углеводородов нефти. Результаты работы показывают, что нефтезагрязнённая почва является экологической нишей фотогетеротрофных пурпурных бактерий. Выделенные штаммы этих прокариот могут быть использованы для создания биопрепаратов для борьбы с нефтяным загрязнением на основе ассоциаций с аэробными нефтеокисляющими микроорганизмами. Данные о преимущественном развитии этих микроорганизмов в загрязнённой почве могут использоваться для разработки методов биоиндикации таких загрязнений. Основные положения, выносимые на защиту: 1. В почвах и грунтах при загрязнении сырой нефтью или нефтепродуктами обнаружены фотогетеротрофные пурпурные бактерий, на основании морфологических и физиологических признаков отнесённые к роду Rhodopseudomonas , к видам Rps. acidophila, Rps. palustris. 2. Причинами развития пурпурных бактерий служит избыток доступных органиче- ских веществ (органических кислот), которые образуются при окислении углеводородов. нефтеокисляющей микрофлорой, главным образом, мицелиальными грибами. 3. Живые клетки и лизированная биомасса пурпурных бактерий (штамм Rps. Acidophila S1) оказывают стимулирующее воздействие на рост аэробной нефтеокисляющей бактерии Dietzia maris в условиях, лимитирования по азоту. 4. Отдельные представители пурпурных бактерий способны к аэробному росту в темноте на среде с дизельным топливом в качестве единственного источника углерода и энергии. (...............) РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Сравнительное изучение численности фотогетеротрофных пурпурных бактерий и аэробных нефтеокисляющих микроорганизмов в почвах. В табл. 1 представлены результаты определения количества фотогетеротрофных пурпурных бактерий, аэробных нефтеокисляющих бактерий и нефтеокисляющих грибов в почвах с различной степенью загрязнения углеводородами . Фотогетеротрофные пурпурные бактерии методом посева на агаризованные питательные среды обнаружены только в загрязнённых пробах. Их количество варьировало от 0.7 до 570 х 103 клеток на 1 г почвы, если определение проводилось на среде с малатом и от 0.3 до 51 х 103 клеток - на среде с бутиратом. В контрольных пробах без нефтяного загрязнения эти микроорганизмы, за одним исключением, обнаружены не были. Эта закономерность была подтверждена в результате постановки накопительных культур. В накопительных культурах с контрольными почвенными пробами рост пурпурных бактерий не наблюдался, при постановке накопительных культур с загрязнёнными пробами на среде ПНБ на свету в анаэробных условиях рост пурпурных бактерий был отчётливо виден. Таблица 1. Микрофлора антропогенно изменённых почв с различным содержанием углеводородов возле эстакад для ремонта автомобилей. Содержание углеводородов, % Фототрофные бактерии на среде с орг. кислотами х 10 3 , сухой почвы клетка/г Нефтеокисляющие бактерии х 10 6 , сухой почвы клетка/г Нефтеокисляющие грибы х 10 4 , сухой почвы КОЕ/г Яблочная кислота Масляная кислота 16,5 570,2 39,4 111,0 159,6 11,7 220,0 0 990,0 12,6 10,9 0,7 0,3 150,0 14,1 9,5 22,3 2,4 4,2 66,7 7,3 2,1 6,2 9,5 6,2 5,7 14,8 1,9 0,8 16,1 3,0 31,1 13,0 32,9 61,9 2,8 1,3 2,0 0,12 16,8 2,7 25,5 0 8,8 4,8 2,4 12,0 0,8 18,15 38,0 1,6 105,0 6,1 19,5 47,6 1,2 130,0 51,1 10,6 2,5 0,5 0 0 118,0 37,0 0 0,4 0 20,1 36,5 0 0 0 3,6 3,4 0 0 0 65,2 43,5 0 0 0 2,3 10,4 0 0 0 28,3 7,6 0 0 0 2,0 10,3 0 0 0 3,2 19,4 0 0 0 9,8 16,8 Сравнивая результаты определения количества трёх групп микроорганизмов, можно придти к заключению, что количество аэробных нефтеокисляющих бактерий в исследованных пробах было значительно больше, чем количество нефтеокисляющих мицелиальных грибов и фотогетеротрофных бактерий. Именно аэробные нефтеокисляющие бактерии являются главными деструкторами углеводородов в почве. Однако обнаружение пурпурных бактерий в почве уже само по себе может чётко указать на нефтяное загрязнение. На этом основании можно сделать вывод, что фотогетеротрофные пурпурные бактерии могут служить индикаторной группой на наличие углеводородного загрязнения почвы. Результаты изучения послойных почвенных проб, загрязнённых нефтепродуктами, показали, что фотогетеротрофные пурпурные бактерии способны проникать в почву на глубину до 10 см. Их развитие не зависит от света. Распределение этих микроорганизмов в почвенных горизонтах сходно с характером распределения углеводородных поллютантов. Исследование микрофлоры почв, загрязнённых нефтепродуктами, позволяют высказать предположение, что почвы, которые подвергаются действию углеводородных поллютантов, становятся своеобразной экологической нишей для пурпурных бактерий. Пурпурные бактерии являются частью микробоценоза почв с углеводородным загрязнением. Фотогетеротрофные пурпурные бактерии обнаружены не только в почвах, загрязнённых нефтепродуктами, но и в почвах, загрязнённых сырой нефтью. Эти микроорганизмы найдены в пробах, отобранных в Западной Сибири (район г. Сургута, г. Урая, г. Югорска, нас. пункта Покачи) и в Приуралье (район г. Кунгура). Изучение почвенных проб, отобранных в августе 2001 года в районе Тепловского и Мамонтовского месторождений нефти, так-же показывает, что пурпурные бактерии способны к развитию в почвах с нефтяным загрязнением. В контрольных пробах эти прокариоты обнаружены не были. В пробах со слабым нефтяным загрязнением (содержание нефти 0.3 – 6.7 %) эти микроорганизмы обнаружены в 80 % проб, при среднем уровне загрязнения (10 – 40%)– во всех пробах, при сильном загрязнении (выше 40 %) фотогетеротрофные прокариоты не выявлены. Количество аэробных нефтеокисляющих бактерий превосходило количество пурпурных бактерий и мицелиальных грибов. В контроле их численность достигала 0.01 – 38.3 х 106 клеток/г почвы, при слабом загрязнении – 0.6 – 727.3 х 106 клеток/г почвы, при среднем и сильном уровнях загрязнения 0.57 – 491.8 х 106 клеток/г почвы. Количество грибов при тех же уровнях загрязнения изменялось, соответственно, от 0.4 до 7.7 х 103 КОЕ/г почвы, 3.03 – 517.6 х 103 КОЕ/г почвы, 0.4 – 6039 х 103 КОЕ/г почвы. Исследование верхового пушицево-сфагнового торфа, отобранного в районе Саматлорского нефтяного месторождения, показало, что пурпурные бактерии встречаются в этом 10 природном субстрате независимо от наличия нефтяного загрязнения. Пурпурные бактерии являются обычными обитателями торфа, что, видимо, связано с высокой влажностью на болотах и большим количеством органического вещества в этом субстрате. Благодаря способности к азотфиксации эти прокариоты могут успешно конкурировать с другими гетеротрофными бактериями в условиях верховых болот, отличающихся недостатком азота. Для торфа пурпурные бактерии не могут выступать в качестве индикаторов нефтяного загрязнения. Полученные данные о распространении пурпурных бактерий в торфе согласуются с данными литературы (Imhoff, Tr ьper, 1991). Сравнительное изучение численности фотогетеротрофных пурпурных бактерий и нефтеокисляющих микроорганизмов в грунте. На рис. 1. представлены результаты изучения количества фотогетеротрофных пурпурных бактерий в грунте полотна железной дороги в зависимости от концентрации нефтяного загрязнителя. Эти бактерии обнаружены в грунте при концентрации углеводородов 0.9 – 4.1 % (максимумом численности при 1.8 %). В незагрязнённом грунте они отсутствуют. При концентрации 10.7 % в грунте обнаруживаются только отдельные колонии пурпурных бактерий в пересчёте на 1 г. Максимум численности аэробных нефтеокисляющих бактерий и грибов наблюдался также при содержании углеводородов 1.8 %. Количество аэробных нефтеокисляющих бактерий на два-три порядка было больше, Рис. 1. Изменение количества фотогетеротрофных пурпурных бактерий в грунт (в расчёте на 1г) в зависимости от концентрации углеводородного загрязнителя. чем количество пурпурных бактерий и грибов. В целом, пурпурные бактерии чувствительнее к избыточным концентрациям углеводородов, чем нефтеокисляющие грибы и бактерии. Микрофлора грунта, в свою очередь, чувствительнее к избытку углеводородов, чем микрофлора почв. При загрязнении больше 10 % количество аэробных нефтеокисляющих бактерий и грибов в грунте снижается по сравнению с почвами при аналогичном уровне загрязнения. Это можно объяснить недостатком биогенных элементов в грунте по сравнению с почвами. Подводя итог исследованиям микрофлоры грунта на полотне железной дороги, необходимо подчеркнуть, что и в этом случае распространение пурпурных бактерий связано с наличием углеводородного поллютанта. Заселение загрязнённых почв могут, вероятно, осуществлять пурпурные бактерии, населяющие водные местообитания. Эта группа микроорганизмов широко распространена в различных водоёмах (Горленко и др., 1977). Перемещение этих бактерий возможно с талыми или дождевыми водами. Систематическая принадлежность выделенных штаммов пурпурных бактерий. Изучение морфологии бактерий штаммов S1, S5, X методом электронной микроскопии указывают на возможность отнесения этих микроорганизмов к роду Rhodopseudomonas. пользу этого можно привести следующие доказательства: наличие в жизненном цикле подвижных клеток с субполярными жгутиками, способность к неравномерному делению (почкованию), внутриклеточные мембраны в виде ламелл, подстилающих цитоплазматическую мембрану и расположенных параллельно ей, грамотрицательный тип клеточной стенки (Определитель бактерий Берджи, 1997). Морфологию клеток пурпурных бактерий штаммов М2, М3, Е8, выделенных из нефтезагрязнённых почв г. Екатеринбурга, и бактерий штамма МЮ3 из почвы г. Югорска исследовали при помощи светового микроскопа с фазово-контрастным устройством. Клетки имели форму палочек, у исследуемых бактерий наблюдалось u1085 неравномерное деление. В молодых культурах многие бактерии были подвижны, в старых культурах были видны агломераты в форме розеток. Морфология клеток выделенных штаммов была сходна с морфологией клеток коллекционной культуры Rhodopseudomonas palustris. Перечисленные штаммы также могут быть отнесены к роду Rhodopseudomonas. Фенотипические признаки бактерий выделенных штаммов позволяют судить о принадлежности их к тем или иным видам рода Rhodopseudomonas. Бактерии Rps. sp. S1 и Rps.sp. S5 отнесены к виду Rps. acidophila. В пользу этого утверждения свидетельствуют следующие признаки: сидячая отпочковывающаяся клетка, рост при относительно низких значениях pH, неспособность использовать бензоат в качестве источника углерода, размеры клеток, близкие к размерам клеток Rps. acidophila, сходный спектр потребляемых субстратов (Bergey’ s Mannual ..., 1989). Бактерии Rps. sp. M2 и Rps. sp. M3 по ряду фенотипических признаков также могут быть отнесены к Rps. acidophila, бактерии штаммов X, Е8 – к Rps.palustris, бактерии штамма МЮ3 - к Rps. rutila. Наиболее предпочтительными субстратами для изучаемых микроорганизмов были органические кислоты (яблочная, янтарная, уксусная и др.). Интродукция пурпурных бактерий в почву. Если в почву вносили пурпурные бактерии Rps. acidophila S1 (10 х 103 клеток/г почвы), то через 2 месяца в колбах с незагрязненной почвой их количество резко уменьшалось, а через 8 месяцев они вообще не обнаруживались. В колбах с загрязненной почвой их количество значительно увеличивалось, что указывает на наличие благоприятных условий для роста пурпурных бактерий в такой почве (табл. 2). Интересно отметить, что пурпурные бактерии развивались в загрязненной почве как при освещении колб, так и в темноте. Это указывает на темновой рост бактерий Rps. Acidophila S1 в почве, загрязненной дизельным топливом. Данные о темновом росте пурпурных бактерий согласуются с результатами изучения микрофлоры почвенных горизонтов, которые показывают, что эти микроорганизмы развиваются в почве на глубине 9 – 10 см. Таблица 2 Численность бактерий Rps. acidophila S1 в почве в лабораторном опыте после интродукции в количестве 10 х 10 3 клеток на 1 г почвы Варианты опыта Количество бактерий, х 10 3 клеток/г почвы Через 2 месяца Через 8 месяцев На свету В темном месте На свету В темном месте Дизельное топливо 740,0 1050,0 600,0 1230,0 Без дизельного топлива (контроль) 0,2 1,5 Не обнаружены Не обнаружены Пурпурные бактерии Rps.acidophila S1 развивались в почве при концентрациях дизельного топлива 5, 10, 25 %. В незагрязненной почве и при 50 %-м загрязнении через 2 месяца пурпурные бактерии не выявлены не были. 50 %-е загрязнение, вероятно, полностью исключает доступ кислорода, что подавляет нефтеокисляющую микрофлору. Кроме того, нельзя исключать токсического воздействия избытка дизельного топлива непосредственно на пурпурные бактерии. Аналогичные опыты, проведенные с коллекционными культурами показали, что бактерии Rhodospirillum rubrum не сохраняют жизнеспособность ни в загрязненной почве, ни в контрольной. Единичные клетки Rhodobacter sphaeroides сохранялись только в незагрязненной почве. Бактерии Rps. palustris развивались в загрязненной почве (на свету и в темноте). Их численность возрастала с 10 х 103 на 1 г почвы до 1-2 х 106 клеток/г почвы. Судя по этим данным, способностью к заселению почв с углеводородным загрязнением обладают представители рода Rhodopseudomonas. Вероятно, определённую роль в распространении этих бактерий в почве при нефтяном загрязнении играет то обстоятельство, что углеводородная плёнка может удерживать влагу в почве, препятствуя её полному высыханию. Пурпурные бактерии рода Rhodopseudomonas не выдерживают высыхания, не образуют спор или цист. Они являются, главным образом, водными микроорганизмами. Влияние увлажнения на выживание пурпурных бактерий (Rps. Acidophila S1) в лабораторном опыте в почве показано в табл. 3. Таблица 3 Влияние увлажнения на выживание Rps. acidophila в почве при углеводородном загрязнении (10 % диз. топлива) Вносимое количество воды, мл. (на 50 г почвы) Влажность почвы в конце опыта, % Пурпурные бактерии х 10 3 клеток/г почвы Без диз. топлива С диз. топливом Без диз. топлива С диз. топливом 0 7,4 15,0 0,1 88,8 5 30,8 33,0 2,9 386,3 20 46,4 51,8 0,2 28,3 Данные табл. 3 показывают, что при отсутствии дополнительного увлажнения плёнка дизельного топлива удерживает воду, и влажность загрязнённой почвы после 30 суток проведения опыта была в два раза больше влажности контрольной почвы (15 и 7.4 %, соответственно). Количество пурпурных бактерий в загрязнённой почве также значительно превосходило их количество в контрольной почве. Однако сохранение влаги в почве – не единственная причина распространения пурпурных бактерий в почве при нефтяном загрязнении, т. к. даже при значительном увлажнении незагрязнённой почвы (30.8 и 46.4 %) количество бактерий Rps. acidophila S1 не достигло количества этих микроорганизмов в почве с дизельным топливом. Развитию этих бактерий в загрязнённой почве может способствовать подавление углеводородами конкурентов (других бактерий) или хищников (амёб, инфузорий), а также накопление доступных субстратов (органических кислот – продуктов неполного окисления алканов). Нельзя исключать непосредственную ассимиляцию углеводородов пурпурными бактериями. Влияние нефтепродуктов на рост пурпурных бактерий. Возможность ассимиляции пурпурными бактериями углеводородов. Исследовали влияние дизельного топлива на рост Rps. acidophila S1 на среде ПНБ с малатом и дрожжевым экстрактом на свету в анаэробных условиях. На протяжении пяти пассажей бактерии росли как в отсутствие дизельного топлива, так и с добавлением его в количестве одного объёмного процента. На среде с дизельным топливом наблюдалось некоторое замедление роста. В третьем пассаже константа скорости деления уменьшилась на 30 % по сравнению с контролем. Это уменьшение было статистически достоверным согласно t – критерию Стьюдента. В четвёртом и пятом пассажах статистически достоверного уменьшения скорости деления под влиянием дизельного топлива обнаружено не было, следовательно, эти микроорганизмы способны к адаптации к токсическому воздействию нефтепродуктов. При наличии субстрата исследуемые бактерии могут длительное время расти в присутствии такого нефтепродукта, как дизельное топливо. Бактерии Rps. acidophila S1, Rps. acidophila S5 и Rps. palustris X росли на полной среде ПНБ в присутствии дизельного топлива, смазочного и вазелинового масел, хотя на Rps. Palustris Х угнетающее действие оказали дизельное топливо и вазелиновое масло, на Rps. Acidophila S5 – смазочное масло. Бактерии выделенных штаммов пурпурных бактерий не росли на средах с нефтепродуктами на свету в анаэробных условиях, если эти нефтепродукты вносили в качестве единственного источника углерода. Потенциальные акцепторы электронов (нитрат, бикарбонат) также не способствовали анаэробному росту на средах с углеводородами. В анаэробных накопительных культурах (с нитратом и бикарбонатом) также не наблюдалось развития пурпурных бактерий на свету. В качестве инокулята для этих культур использовалась почва, загрязненная углеводородами и заселенная пурпурными бактериями (место отбора - в районе г. Сургута и г. Кунгура). Аэробного роста в темноте у бактерий Rps. acidophila S1, Rps. acidophila S5 и Rps. Palustris X на углеводородах также не обнаружено. Однако проверка 20 штаммов пурпурных бактерий, выделенных из почв с углеводородным загрязнением, показала, что у бактерий Rps. acidophila M2, Rps. palustris E8 и у бактерий коллекционной культуры Rps. palustris наблюдается медленный рост в темноте на среде с дизельным топливом в качестве единственного источника углерода и энергии в аэробных условиях. На поверхности агаризованной среды (минеральный фон ПНБ с 1 об. % дизельного топлива) эти бактерии образовывали бесцветные точечные колонии. Через 14 суток прирост белка у бактерий Rps. acidophila M2 на жидкой среде с дизельным топливом в качестве единственного источника углерода и энергии в аэробных условиях превысил контроль на 45 %, у Rps. palustris Е8 – на 31 %, у коллекционной культуры Rps. palustris – на 15 %. У трёх других штаммов ( Rps. acidophila S1, Rps. acidophila М3 и Rps. rutila МЮ3) увеличение количества белка было статистически недостоверным (согласно t – критерию Стьюдента). Приведённые данные свидетельствуют, что у трёх штаммов пурпурных бактерий есть способность к аэробной ассимиляции дизельного топлива u1074 в темноте, однако их рост на дизельном топливе гораздо более медленный по сравнению с ростом родококков и псевдомонад. Рост пурпурных бактерий на культуральной жидкости грибов. Совместный рост с грибами. Причиной развития пурпурных бактерий в почве при нефтяном загрязнении может быть накопление продуктов неполного окисления углеводородов. Такими продуктами могут быть различные органические кислоты. Для проверки такой возможности пурпурные бактерии различных штаммов выращивали на культуральной жидкости нефтеокисляющих мицелиальных грибов (на свету, в анаэробных условиях). Бактерии штаммов Rps . acidophila S 1, Rps. acidophila S5 и Rps. palustris X росли на культуральной жидкости большей части нефтеокисляющих грибов. Рост исследуемых пурпурных бактерий на культуральной жидкости грибов наблюдался также в аэробных условиях в темноте. Бактерии коллекционной культуры Rps. palustris также росли на культуральной жидкости грибов. Пурпурные бактерии Rps. acidophila S1 могли расти совместно с нефтеокисляющими грибами на свету в микроаэробных условиях при лимите азота. Грибы образовывали поверхностную пленку, пурпурные бактерии оседали на дно. Эти ассоциации могут, видимо, развиваться благодаря способности грибов при росте на дизельном топливе в условиях лимита по азоту накапливать в среде органические кислоты. Пурпурные бактерии, в свою очередь, способны к азотфиксации и могут ассимилировать органические кислоты. В контроле на среде с дизельным топливом в качестве единственного источника углерода (без нефтеокисляющих грибов) роста исследуемых пурпурных бактерий не наблюдалось. Создание искусственных ассоциаций нефтеокисляющих микроорганизмов и пурпурных несерных бактерий. Исследовали влияние лизата клеток пурпурных бактерий Rps. acidophila S1 (133 мкг белка/мл среды) на рост бактерий Dietzia maris А2 на среде с керосином в условиях недостатка азота. Контролем служил рост D. maris на среде с керосином и с нитратом калия, рост на среде с керосином без азота и рост на среде без керосина и без азота, но с добавлением клеточного лизата. Рост D. maris А2 на среде с керосином и лизатом клеток пурпурных бактерий составил 14.8 х 106 клеток/мл и превосходил рост на среде с керосином без азота (2.7 х 106 клеток/мл среды) и на среде с лизатом без керосина (6.2 х 106 клеток/мл среды), хотя и уступал росту на среде с керосином и с нитратом калия (34.9 х 106 клеток/мл среды). Отличия между вариантами опыта были достоверными согласно t – критерию Стьюдента. Аналогичные данные получены при замене керосина на бензойную кислоту (0.3 %) – ароматическую кислоту, потребление которой является характерным признаком бактерий D. maris . Таким образом, лизированная биомасса пурпурных бактерий может компенсировать недостаток азота в среде при аэробном росте углеводородокисляющей бактерии D. maris А2 на среде с керосином и с бензойной кислотой. Живые фотоситезирующие бактерии Rps. acidophila S1, адаптированные к фиксации молекулярного азота, оказывали положительное влияние на окисление дизельного топлива бактериями D. maris А2 в микроаэробных условиях на свету при недостатке азота. Исходная концентрация дизельного топлива составляла 59.0 мг/л среды, после 10 суток культивирования чистой культуры нефтеокисляющих бактерий D. maris A2 на среде без азота количество дизельного топлива уменьшилось до 46.7 мг/л, после культивирования смешанной культуры D. maris A2 и азотфиксирующих пурпурных бактерий - до 36.4 мг/л. ВЫВОДЫ 1. Установлено, что фотогетеротрофные пурпурные бактерии являются частью микробного сообщества почв и грунтов при загрязнении нефтяными углеводородами. 2. Показано, что пурпурные бактерии встречаются в почвах при концентрации углеводородов от 0.4 до 39 %, в грунте – от 0.9 до 4.1 %. При отсутствии углеводородного загрязнения эти микроорганизмы не обнаружены или представлены единичными клетками в пересчёте на 1 г почвы. 3. Максимальное количество пурпурных бактерий, зафиксированное при загрязнении почвы нефтепродуктами, достигало 0.57 х 106 клеток/г почвы и наблюдалось при концентрации углеводородов 16.5 %. При загрязнении почвы сырой нефтью максимальная численность достигала 7.7 х 106 клеток/г при концентрации нефти 16.1 %. В грунте максимальное количество составило 1.05 х 107 клеток/г при уровне загрязнения 1.8 %. 4. Установлены концентрации углеводородов, подавляющие развитие пурпурных бактерий в почвах и грунте. Эти бактерии не обнаружены в почвах при концентрации углеводородов выше 40 %, а в грунте – при концентрации выше 10 %. 5. Установлено, что количество пурпурных бактерий в почве в летнее время на два три порядка меньше численности аэробных гетеротрофных нефтеокисляющих бактерий и сопоставимо с количеством колониеобразующих единиц нефтеокисляющих мицелиальных грибов. В исследованных почвенных образцах при слабом углеводородном загрязнении (1.2 – 9.5 %) количество пурпурных бактерий варьировало в диапазоне 1.3 – 130.0 х 103 клеток/г почвы, количество аэробных нефтеокисляющих бактерий – в диапазоне 0.8 – 39.5 х 106 клеток/г почвы, количество нефтеокисляющих грибов достигало 2.5 – 66.7 х 103 КОЕ/г почвы. 6. Выделенные из нефтезагрязнённых почв чистые культуры фотогетеротрофных пурпурных бактерий на основании морфологических и физиологических признаков отнесены к роду Rhodopseudomonas , к видам Rps . acidophila , Rps . palustris . 7. Среди 20 штаммов пурпурных несерных бактерий, выделенных из загрязненных почв, способность к аэробному росту в темноте на среде с дизельным топливом в качестве единственного источника углерода и энергии обнаружена у Rps. acidophila M2 и Rps. Palustris E8, а также у бактерий коллекционной культуры Rps. palustris . Данные в пользу анаэробной ассимиляции углеводородов не получены. 8. Показана возможность роста пурпурных бактерий за счёт органических кислот, образуемых в результате неполного окисления нефтепродуктов мицелиальным грибами. Этот факт позволяет объяснить массовое развитие пурпурных бактерий в почве с нефтяным загрязнением. 9. Установлено, что присутствие азотфиксирующих фотогетеротрофных пурпурныхбактерий компенсирует недостаток азота в среде и оказывает положительное влияние на окисление углеводородов аэробными гетеротрофными бактериями Dietzia maris . 10. Полученные данные свидетельствуют о возможности использования фотогетеротрофных пурпурных бактерий в качестве индикаторов слабого нефтяного загрязнения почв (1-10 % углеводородов). Кроме того, они могут быть включены в биопрепараты, применяемые для рекультивации территорий, загрязнённых нефтью и нефтепродуктами. (...............) Избранные материалы из статьи на тему « ХАРАКТЕРИСТИКА НЕКОТОРЫХ ПРЕДСТАВИТЕЛЕЙ УГЛЕВОДОРОДОКИСЛЯЮЩЕЙ МИКРОФЛОРЫ УСИНСКОГО НЕФТЯНОГО МЕСТОРОЖДЕНИЯ » автора к.б.н. М. Маркаровой (...............) При разложении органических загрязнений, попадающих в окружающую среду, ведущая роль принадлежит микроорганизмам. Основными объектами наших исследований были нефтезагрязненные почвы и микрофлора Усиниского нефтяного месторождения. В течение ряда лет мы проводили сравнительный анализ состава и численности микрофлоры нефте-загрязненных почв на разных сроках загрязнения. Для свежезагрязненных почв характерна высокая численность почвенных микроорганизмов (общий титр КОИ в почве 3-8-10 6-7 ), преобладание группы аммонификаторов над другими трофическими группами, представленной мелкими однообразными бесцветными колониями бактерий родов Pseudomonas и Arthrobacter (табл. 1). Пигментированные колонии рода Rhodococcus, характеризующиеся, как правило, высокой степенью ферментативной активности- единичны. В отличие от свежезагрязненной почвы на более поздних срезках после загрязнения нефтью в почвах увеличивается численность групп олиготрофной микрофлоры, олигонитрофилов и целлюлозоразрушающих микроорганизмов. Общая численность остается по-прежнему высокой (10 6-7 ), Преобладающими видами среди бактерий являются представители родов Rhodococcus и Pseudomonas, относительно высока численность родов Arthrobacter, Flavobacterium, Agrobacterium. Отмечено присутствие грибов родов Mucor, Penicillium и Trichoderma (встречающихся также и в незагрязненной почве). Таблица 1 Представители доминирующих родов микроорганизмов в нефтезагрязненных и незагрязненных почвах Усинского района Фоновая почва Свежезагрязненная нефтью почва (срок загрязнения до трех лет) Почва старых нефтяных разливов (срок загрязнения более восьми лет) Criptococcus* Arthrobacter* Arthrobacter* Bacillus* Pseudomonas* Pseudomonas* Mycobaclerium Pmicillium Rhodococcus* Anhtohacter* Aspergillius Penicillium Pseudomonas Mucor Rhodococcus Trichoderma Penicillium Flavobacterium* Chrisosporium* Agrobacterium* Mucor Candida Rhodolorula* Clostridium * преобладающие по численности представители почвенной микрофлоры. Фоновые почвы отличаются от загрязненных нефтью не только более богатым видовым составом (табл. 1), но и меньшей численностью. Преобладающими по численности в них были виды родов Criptococcus, Bacillus, Arthrobacter, Chrisosporium, Rhodotorula (численность более 10 5 клеток/1 г в.с.п.). Многочисленны (численность около 10 4 клеток в 1 г в.с.п.) представители родов Mycobaclerium, Penicillium, Candida, Mucor, Clostridium. Также в фоновых почвах представлены и углеводородокисляющие виды родов Pseudomonas и Rhodococcus, но они не являются доминирующими, по сравнению с загрязненными нефтью почвами (численность не превышает 1000 клеток на 1 г в.с.п.). Таким образом, при нефтяном загрязнении в почвах происходит резкое увеличение численности микрофлоры узкоспециализированных групп бактерий, подавление большинства аборигенных видов, в том числе и микроскопических грибов. Высокая численность почвенных бактерий и бедный их видовой состав сохраняются в условиях Севера на протяжении трех-пяти лет после нефтяного загрязнения, что совпадает с периодом очищения почвы от подвижных (растворимых и летучих) углеводородов. Последующее очищение почв от нефти происходит с участием различных видов, таких, которые обладают либо выраженной углеводородокисляющей активностью или выделяют в окружающую среду биологически активные вещества (виды с высокой степенью ферментативной активности), либо участвуют в процессах трансформации промежуточных соединений или резистентны к присутствию остаточных углеводородов. Дальнейшее исследование было сосредоточено на нескольких направлениях. Одним из них стало изучение физиолого-биохимических свойств углеводородокисляющей бактериальной микрофлоры нефтезагрязненных почв Усинского района, с целью составления коллекции культур алканотрофной психрофильной микрофлоры. Выделенные в чистую культуру виды (табл. 2) стали основой для создания препарата МУС-1, предназначенного для активизации разложения нефти в почвах Усинского района. Ими являются Ahrtrobacter sp., Pseudomonas alcaligenes, Rhodococcus erythropolis, Flavobactenuin barbe и Agrobuctenum sp. (...............) Все изучаемые виды (табл. 2) способны активно развиваться в присутствии как аммонийного (КАА), так и нитратного азота на среде Чапека. Денитрифи-цирующей способностью обладают все перечисленные виды, кроме флавобактерий. Характерной особенностью выделенных бактерий рода Pseudomonas является способность восстанавливать нитраты (NО 3 ) до газообразного азота (N 2 ).Bce это свидетельствуют о том, что типичные для нефтезагрязненных почв Усинского месторождения микроорганизмы способны развиваться как в аэробных, так и в частично анаэробных условиях, в последнем случае переходить на нитратное дыхание. Это важно с точки зрения условий, в которых развиваются процессы самоочищения почв после воздействия нефтяных загрязнений. Речь идет об одном из следствий нефтяного загрязнения - ухудшении воздушных условий в почве, что является важной причиной ингибирования жизнедеятельности микроорганизмов. Способность к нитратному дыханию в этом случае является одним из способов приспособления к неблагоприятным условиям. На МПБ активность культур менее высокая, чем на КАА и среде Чапека. Существенно она снижается на МПБ в присутствии NaCI. Рост на средах с глюкозой и сахарозой существенно не различается. Все это позволяет отнести данные виды к группе аммонификаторов-гетеротрофов. Известно, что многие углеводородокисляющие микроорганизмы могут стимулировать уреазную активность почвы. Этот показатель используется часто для оценки экологического состояния нефте-загрязненных почв, для которых характерно увеличение уреазы на 15-25% по сравнен ию с незагрязненными почвами . Среди изучаемых культур оксидазную активность проявляли только представитель рода Pseudomonas. Уреазную активность проявляли все культуры, кроме псевдомонад, наиболее заметно эти показатели были выражены у Rhodococcus. Изучение роста чистых культур и комплекса видов из этих культур на сырой нефти показало, что каждый из представленных видов способен изменять качественные характеристики сырой нефти за счет деструкции отдельных ее составляющих. Деструкция углеводородной фракции отдельными культурами была незначительна и составила от 7 (Rhodococcus erythropolis) до 16 (Agrobactenum radiobacter) процентов по сравнению с контролем (табл. 3). Деструкция н-алканов отдельными культурами также отличается. В культуре Rhodococcus erythropolis произошло уменьшение массовой доли соединений с длиной цепи С 16-18 , С 22-24 , С 26-31 , с образованием промежуточных соединений с длиной цепи С 11-14 . Под воздействием Pseudomonas alcaligenes н-алканы подверглись заметному разложению в диапазоне от С 14 до С 30 . При этом масса углеводородов с длиной цепи менее 10 атомов углерода заметно увеличилась, что свидетельствовало о возрастании в составе остаточной нефти доли углеводородов с низким молекулярным весом (табл. 3). В варианте с культурой Flavobacterium barbe наблюдалось более заметное, чем в предыдущих культурах, изменение хроматографического рисунка н-алканов, характеризующееся снижением массовой доли соединений с длиной цепи С 14-21 и увеличением доли соединений в диапазоне С 25 и С 30 , по-видимому, за счет разложения более сложных углеводородов и длиной цепи С 17-30 происходило заметное увеличение доли соединений от С 13 до С 15 . При этом увеличился и вес легких углеводородов (табл. 3). Agrobacterium radiobacter способствовал относительно резкому, по сравнению с рассмотренными выше культурами снижению доли тяжелых парафинов с длиной цепи более С 22 . Таблица 3 Изменение массы отдельных фракций нефти под влиянием изучаемых культур Вариант Масса нефти, г Масса гетероциклических соединений, г Масса углеводородной фракции, г Парафины с длиной цепи до 10 атомов углерода, г Общая степень деструкции, % Контроль 5 0,925 3,857 0,218 0,00 Rhodococcus erythropolis 4,519 0,591 3,591 0,216 9,62 Pseudomonas alcaligenes 4,45 0,594 3,407 0,299 11,0 Plavobaclerium barbe 4,60 0,652 3,809 0,089 8,0 Arthrobacter sp. 4,48 0,594 3,537 0,225 10,4 Agrobacterium radiobacter 4,10 0,538 3,237 0,209 18 МУС-1 1,33 0,371 0,943 0,01 73,4 Эффективность разложения нефти в комплексе превышала суммарный эффект монокультур и составляла 73-75%, при этом доля в составе нефти гетероциклических соединений снижалась на 60%, углеводородов - на 75-76% (табл. 3). Разложение алканов произошло по всему спектру соединений, в том числе и высокомолекулярных. Очевидно, что такое резкое отличие углеводородокисляющей активности комплекса по сравнению с монокультурами связано с трофическим взаимовлиянием культур, т.е. способностью каждой из них разлагать промежуточные соединения, новообразованные при деструкции углеводородов другими культурами. Отличия в качественном разложении н-алкановой фракции чистыми культурами в какой-то степени свидетельствуют в пользу сказанного. К настоящему времени в чистую культуру из нефтезагрязненных почв Усинского района выделено более 50 штаммов различных углеводородокисляющих бактерий. Как известно из литературы, природных штаммов, способных разлагать сразу все виды соединений, входящие в состав сырых нефтей, не существует. Изучение отдельных представителей углеводородокисляющей микрофлоры, специфики роста их на углеводородах нефти позволяет моделировать составы препаратов для конкретного состава нефти. Данные, приведенные в настоящей статье являются начальными в цепочке исследований для создания рабочей коллекции культур алканотрофных бактерий почв Севера. (...............) Избранные материалы из публикации Мукашева Т.Д. и Шигаева М.Х. на тему « МИКРООРГАНИЗМЫ В ПОЧВАХ КАЗАХСТАНА С РАЗНОЙ СТЕПЕНЬЮ ЗАГРЯЗНЕНИЯ НЕФТЬЮ » . (...............) Целью данной работы явилось изучения отклика микроорганизмов в почвах Атырауской области на различные ко нцентрации загрязнителя – нефти . Объектами исследования были нефтезагрязненные почвы различных месторождений Атырауской области на участках с интенсивным нефтяным загрязнением от 3256 мг/кг до 5877 мг/кг почвы и в местах визуально не загрязненных от 359 мг/кг до 125 мг/кг почвы. Почвенные образцы для исследования брали на глубине 0-10 см и 10-20 см. Для слабозагрязненных почв характерна высокая численность почвенных микроорганизмов (общий титр КОЕ в почве, 106– 107) преобладание группы аммонификаторов над другими трофическими группами, представленной разнообразными бесцветными колониями бактерий родов Pseudomonas и Bacillus (табл.1). Пигментированные колонии рода Rhodococcus, характеризующиеся, как правило, высокой степенью ферментативной активности - единичны. В отличие от слабозагрязненной почвы в сильнозагрязненых нефтью почвах общая численность уменьшается на два- три порядка , преобладающими видами среди бактерий являются представители родов Rhodococcus, Pseudomonas, Bacillus и Mycobacterium. Кроме того, численность групп олиготрофных микроорганизмов (10 5-6) в сильнозагрязненной почве месторождений Доссор и Тенгиз выше, чем количе ство гетеротрофных групп на два -три порядка (10 3-4). В слабозагрязненных почвах относительно высока численность красных колонии дрожжей рода Rhodotorula. Отмечено их отсутствие в сильнозагрязненных почвах месторождения Доссор и Тенгиз. Преобладающими видами среди дрожжевых организмов в этих почвах являются представители родов Candida и Trichosporon. При слабом нефтяном загрязнении в почвах происходит резкое увеличение численности узкоспециализированных групп бактерий – углеводороокисляющих бактерий, отмечено присутствие в таких почвах мелких однообразных бесцветных колоний. В сильнозагрязненных почвах колебания численности углеводороокисляющих бактерий были более значительны (102-104) и преобладали бактерий, образующие мелкие пигментированные колонии. Таблица 1. Численность гетеротрофных микроорганизмов в нефтезагрязненных почвах. Месторождение-количество нефти в почве мг/кг Численность микроорганизмов , млн./г почвы КОЕ Гетеротрофных бактерий Олигот рофные Актино мицеты дрожжи и грибы углеводород окисляющие аммоницирующие спорообразующие слабозагрязненные почвы Доссор- 359 Забурунье- 125 Бекбике- 159 Тенгиз- 143 1 2 1 2 1 2 1 2 43,1 24,3 98,6 56,4 83,8 54,2 71,9 63,5 0,52 0,28 0,38 0,23 0,56 0,35 0,31 0,43 6,4 2,8 4,8 1,9 7,1 5,9 4,6 2,5 0,63 0,77 0,75 0,57 0,63 0,77 0,75 0,57 3,9 2,5 1,2 3,5 2,5 5,2 2,8 4,3 32,7 45,2 32,4 23,1 32,4 45,9 32,2 23,5 Сильнозагрязненные Доссор 5877 Забурунье 3256 Бекбике/ 3568 Тенгиз/ 4582 3 4 3 4 3 4 3 4 0,37 0,025 8,4 7,2 3,5 3,5 0,34 0,12 0,0091 0,017 0,26 0,22 0,29 0,59 0,046 0,62 2,32 0,47 2,6 1,9 6,1 1,8 4,54 1,32 0,0036 0,023 0,028 0,022 0,036 0,023 0,028 0,022 0,0032 0,027 0,039 0,031 0,032 0,027 0,039 0,031 0,32 0,027 3,9 3,1 3,2 2,7 3,9 0,31 Примечание: 1,3 - пробы почв взяты с поверхности 0-10см; 2,4 - пробы почв взяты с глубиной 10-20 см; 1,2 пробы почв слабозагрязненных нефтью; 3,4 пробы почв сильнозагрязненных нефтью. Выделенные штаммы были группированы на основании ряда морфо-физиологических свойств. Морфологии колонии и вегетативных клеток (форма, подвижность), наличие спор, окрашивание по Граму, способность к росту в присутствии аммонийного и нитратного азота, денитрифицирующей, оксидазной и уреазной актиностей. По морфологии колонии все выделенные культуры были разделены на группы: группа 1 – бактерии, образующие неокрашенные колонии (белые); группа 2 – бактерий, пигментированные колонии, кремовые; группа 3 – бактерий, пигментированные колонии, красно-розовые; морфотип 4 – бактерий, колонии морщинистые кремовые. Среди изучаемых культур, большинство относились к гр амотрицательным микроорганизмам , обладали денитрифицирующей и оксидазной активностями и были выделены из слабозагрязненных почв. Из сильнозагрязненных почв культуры, проявляющие оксидазную активность, представлены незначительно. Уреазную активность проявили большинство грамположительных штаммов, которые были выделены из сильнозагрязненных почв. Известно, что нефтеокисляющие микроорганизмы могут стимулировать уреазную активность почвы и этот показатель многие исследователи используют для оценки экологического состоян ия нефтезагрязненных почв . Таким образом, на численность микроорганизмов и на количество доминантных видов в нефтезагрязненых почвах оказывает воздействие степень загрязнения, кроме того, в сильнозагрязненных почвах наблюдается спад микробного разнообразия. ЗАКЛЮЧЕНИЕ. Длительное воздействие нефти на почву вызывает увеличение численности микроорганизмов, нарушения структуры микробных компонентов, которое проявляется в обеднении видового разнообразия и развитии «специализированных» эколого-трофических групп микроорганизмов, участвующих на разных этапах утилизации добавочной энергии. Среди микроорганизмов цикла азота наиболее чувствительны к действию нефти нитрифицирующие бактерии, а численность и активность микроорганизмов, участвующих в процессе азотфиксации, аммонификации и денитрификации, наоборот, могут увеличиться. Во всех почвах в большом количестве содержатся микроорганизмы, способные окислять различные углеводороды. Селективное действие нефти на почвенную микробиоту в первую очередь выражается в том, что в загрязненных почвах значительно увеличивается число микроорганизмов, использующих н-алканы и ароматические углеводороды, чем в почвах без нефти. Обнаружено увеличение количества узкоспециализированных форм окисляющих газообразные углеводороды, твердые парафины, ароматические углеводороды. Среди них выявлены представители бактерий родов Arthrobacter, Bacillus, Brevibacterium, Nocardia, Pseudomonas, Rhodococcus , Rhodosporidium, Rhodococcus, Flavobacterium, Agrobacterium, и аспорогенных дрожжей родов Candida, Cryptococcus, Rhodotorula, Rhodopseudomonas, Sporobolumyces, Torulopsis, Trichosporien. Отмечено присутствие грибов родов Mucor, Penicillium и Trichoderma (встречающихся также и в незагрязненной почве). В результате на численность микроорганизмов и на количество доминантных видов в нефтезагрязненых почвах оказывает воздействие степень загрязнения, кроме того, в сильнозагрязненных почвах наблюдается спад микробного разнообразия , также срок загрязнения. Поступление нефти в почву приводит в движение компоненты микробного сообщества, находящегося в состоянии гомеостаза, изменяется структура почвенного микробиоценоза, жесткость его строения, характер трофических связей, активность биоценоза, направленность и скорость биохимических реакций. Список используемой литературы: 1. Абдрахмонов, Т. А. Влияние загрязнений почвы нефтью и нефтепродуктами микрофлору / Т. А. Абдрахмонов, З. А. Жаббаров, Э. М. Хушвактов // Материалы IV съезда почвоведов и агрохимиков Узбекистана. – Ташкент, 2005. – С. 208– 209. 2. Ботоер, М. Микробные сообщества в мерзлотных почвах Сибири / М. Ботоер докл. II межвуз. конф. Сыктывкар, 1997 г. – Сыктывкар, 1997. – С. 54– 55. 3. Гузев В.С., Левин С.В., Селецкий Г.И., Бабьева Е.Н., Калачникова И.Г., Колесникова Н.М., Оборин А.А., Звягинцев Д.Г. Роль почвенной микробиоты в рекультивации нефтезагрязненных почв // Микроорганизмы и охрана почв. - М.: Наука, 1989. - С. 129-150. 4. Драчук С.В., Щербакова О.А., Фирсов Н.Н. Фототрофные бактерии в почвах, загрязнённых нефтепродуктами//Современные проблемы экологии, микробиологии и иммунологии: Матер. региональной конф. молодых учёных. – Пермь, 1999. – С. 82. 5. Исмаилов Н.М. Нефтяное загрязнение и биологическая активность почвы // Добыча полезных ископаемых и геохимия природных экосистем. - М.: Наука, 1992. - С. 227-235. 6. Коронелли Т.В. Принципы и методы интенсификации биологического разрушения углеводородов в окружающей среде (Обзоры/Прикладная биохимия и микробиология. 1996. Т. 32. №6. С.579-585 7. Усачева Г.М., Самосова С.М.,Мартынов А.А., Фильченков В.И., Петрова Л.М. Оценка эффективности некоторых приемов воздействия на разложение нефти в почве // Усп. газовой хромотографии. Казань. 1982. Вып. 6. С. 105-114. 8. Хазиев Ф.Х., Тишкина ЕИ., Киреева Н.А., Кузахметов Г.Г. Влияние нефтяного загрязнения на некотрые компоненты агросистемы // Агрохимия. 1988 № 2. С. 56-61.