Сырьевые ресурсы биотехнологии

Любое производство начинается с сырья. Общий объем биотех нологической продукции в мире измеряется в миллионах тонн в год. В микробиологической промышленности наибольшая доля сырья (более 90 %) идет на производство этанола. Производство хлебо пекарных дрожжей требует 5 % расходуемого в микробиологиче ской промышленности сырья, антибиотики — 1,7 %, органические кислоты и аминокислоты — 1,65 %. Ферментная биотехнология является крупным потребителем крахмала, так как только одной фруктозной патоки производится свыше 3,5 млн в год. С точки зрения экономики, сырье в биотехно логических производствах, особенно в крупнотоннажных, занимает первое место в статьях расходов и составляет 40— 65 % общей сто имости продукции (рис. 4.1). При тонком биосинтезе доля сырья в общей себестоимости продукции уменьшается. Питательный субстрат, или питательная среда, является слож ной трехфазной системой, содержащей жидкие, твердые и газооб разные компоненты. Много ферментов расположено на поверхно сти клетки или выделяется в окружающую среду. Кроме того, зна чительная часть продуктов биосинтеза после экскреции из клеток накапливается в среде. Некоторые промежуточные метаболиты служат резервным питательным фондом, которым клетка пользует ся после истощения основных источников питания. Существует тесное взаимодействие между культивируемым биообъектом и фи зико-химическими факторами среды. С одной стороны, эти факто ры (рН, осмотическое давление и др.) контролируют рост клеток и биохимическую активность продуцентов. С другой сторо ны, химический состав и физико-химические свойства среды посто янно меняются в результате жизнедеятельности самих клеток. Эти обсто ятельства заставляют рассматривать ферментируемый субстрат как продолжение внутренней среды клетки. Во время ферментации формируется совокупность субстрата и биообъекта. СЫРЬЕ ДЛЯ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОЙ ПРОМЫШЛЕННОСТИ Сырьевые ресурсы Земли В принципе, микроорганизмы способны ассимилировать любое органическое соединение, поэтому потенциальными ресурсами для микробиологической биотехнологии могут служить все миро вые запасы органических веществ, включая первичные и вторич ные продукты фотосинтеза, а также запасы органических веществ в недрах Земли. Но, к сожалению, каждый конкретный вид микроорганизмов, используемый в биотехнологии, весьма избирателен к питательным веществам, и органическое сырье (кроме лактозы, сахарозы и крахмала) без предварительной химической обработки малопригодно для микробного синтеза. Тем не менее целлюлозосодержа щее сырье после химического или ферментативного гидролиза и очистки от ингибирующих или балластных примесей (фенол, фур фурол, оксиметилфурфурол и др.) может быть использовано в био технологическом производстве. Каменный уголь, природный газ и древесина могут служить сырьем для химического синтеза техниче ских спиртов или уксусной кислоты, а последние, в свою очередь, являются отличным сырьем для микробиологической промышлен ности.. Из органического сырья наибольшее внимание биотехнологов привлекает крахмал, хотя для его ассимиляции микроорганизмами требуется сложный комплекс амилолитических ферментов, кото рым владеют только некоторые виды микроорганизмов (например, грибы рода Aspergillus , бактерии Вас. subtilis и др.)- Много крах мала расходуется для производства этанола, а также для изготов ления фруктозных сиропов. Из-за того, что мировые запасы крахмалосодержащего в нашей стране ограничены, целесообразно использовать для целей биотехнологии мелассу, глюкозное сырье, метанол и этанол. При выборе сырья учитывают не только физиологические по требности выбранного продуцента, но и стоимость сырья (табл. 1 ). Таблица 1. Стоимость основного микробиологического сырья Сырье Содержание углерода, % от содержания в глюкозе Стоимость 1 т глюкозного эквивалента, доллары Кукурузный крахмал Глюкоза Сахароза-сырец Сахароза рафинированная Меласса Уксусная кислота 100 100 105 105 50 100 64— 91 290 133 629 140 550 Метанол Этанол Метан Кукурузное масло-сырец Пальмовое масло Парафины 94 130 180 200 200 218 160 430 105 300 Традиционные источники углерода Углеродсодержащее сырье является основным сырьем мик робного синтеза. Наиболее широко применяемые в производ ственных условиях источники углерода перечислены в табл. 2. Большинство микроорганизмов хорошо ассимилирует углеводы. При катаболизме большое значение имеют строение углеродного скелета молекул (прямой, разветвленный или циклический) и степень окисления углеродных атомов. Легкодоступными счита ются сахара, особенно гексозы, за ними следуют многоатомные спирты (глицерин, маннит и др.) и карбоновые кислоты. До недавнего времени существовало мнение, что органические кислоты малодоступны для большинства микроорганизмов, одна ко на практике довольно часто встречаются микроорганизмы, ус пешно утилизирующие органические кислоты, особенно в ана эробных условиях. Низкомолекулярные спирты (метанол, этанол) можно отнести к числу перспективных видов микробиологического сырья, так как их ресурсы существенно увеличиваются благодаря успешному развитию технологии химического синтеза. Многие дрожжи родов Candida , Hansenula , Rhodosporidium , Endomycopsis и др. способны ассимилировать этанол. Дрожжи родов Pichia , Can dida , Torulopsis и др. и бактерии, принадлежащие родам Methy - lomonas , Protaminobacter , Flavobacterium и др., используют в качестве единственного источника углерода метанол и образуют биомассу с высоким содержанием белков (60— 70%). В 1939 г. В. О. Таусоном была установлена способность разных видов микроорганизмов использовать в качестве единст венного источника углерода и энергии н-алканы и некоторые фракции нефти. Отличительной особенностью углеводородов по сравнению с другими видами микробиологического сырья являет ся низкая растворимость в воде. Этим объясняется тот факт, что только некоторые виды микроорганизмов в природе способны ассимилировать углеводороды. Максимальная растворимость н-алканов в воде около 60 мл/л при длине молекул от С2 до С4, но при увеличении цепи растворимость снижается. Таблица 2. Источники углерода, применяемые для микробного синтеза Субстрат Содержание основ ного вещества Характеристика Кристаллическая глю коза Техническая сахароза Техническая лактоза Гидрол Крахмал Уксусная кислота Спирт этиловый синте тический Узкая фракция жид кого парафина 99,5 % Сахарозы не менее 99,75 % Лактозы не менее 92% РВ не менее 70 % в пересчете на СВ СВ не менее 80 % Уксусной кислоты не менее 60 % Этанола не менее 92% н-Алканов 87— 93 % Содержит до 9 % воды, до 0,07 % зольных веществ, в том числе же леза не более 0,004 % Влажность до 0,15 %, зольных ве ществ не более 0,03 % Влажность до 3 %, зольных ве ществ не более 2 % и 1 % молоч ной кислоты Сиропообразная жидкость, РВ представлены главным образом глюкозой, зольных веществ до 7 %, рН 4,0 Зольных веществ Q .-35— 1,2 % в пе ресчете на СВ ( Содержит формальдегид и до 1,0 % муравьиной кислоты Содержит до 0,21 % изопропило вого спирта и до 15 мг/л органиче ских кислот Содержит до 0,5 % ароматических углеводородов и до 0,5 % серы Побочные продукты производства Многие ценные виды побочной продукции раньше считались отходами производства. В канализацию спускали воду после замачива ния кукурузных зерен при их переработке в крахмал и глюкозу. Теперь эту воду упаривают, получая экстракт, и используют в микробиологической промышленности. Успешно используют отхо ды химического производства (смесь карбоновых кислот — ян тарной, кетоглутаровой, адипиновой) и др.; сульфитный щелок, зерновую и картофельную барду, мелассу, гидрол и т. д. Таблица .3. Химический состав свекловичной мелассы Содержание, % Содержание, % Наименование среднее опти- Наименование среднее опти- маль- маль- ное для ное для дрож- дрож- жей жей Сухое вещество 75— 77 — Зольность 6,6 — 7,5 7 Сахароза 45 в том числе: Инвертный сахар 0,5 — 1,2 — К 2 О 2,5— 3,5 3,5 Раффиноза 0,5— 1,0 MgO 0,1— 0,24 — Сбраживаемые са- 46 — 48 50 СаО 0,5— 0,8 1,0 хара (суммарное Азот количество) общий 1,1 — 1,5 1,4 Коллоиды 3 — 4 аминный Доброкачествен- 62 — 65 65 до гидролиза 0,2— 0,35 — ность после гидро- 0,5 — 0,6 0,4 лиза Лизин 41 Алании Гистидин 24 Цистин Аргинин 26 Валин Аспарагиновая кислота 251 Метионин Треонин 41 Изолейцин 118 Следы 89 120 13 Комплексное использование всей побочной продукции произ водства далеко от совершенства. В нашей стране ежегодно оста ется неиспользованной или нерационально используется около 1 млн т лактозы, содержащейся в сыворотке и пахте. В США из всего количества молочной сыворотки, образующейся при про изводстве сыра (ежегодно 20 млн т), половина теряется со сточ ными водами. В то же время известно, что из 1 т сыворотки мож но получить около 20 кг сухой биомассы дрожжей. Кроме того, из сепарированной бражки можно выделить допол нительно около 4 кг протеина. Нерационально используется кар тофельный сок, выделяемый из картофеля при производстве крахмала, а также альбуминное молоко, получаемое из сыворотки. В микробиологической промышленности широко применяются меласса и гидрол — побочный продукт производства глюкозы из крахмала. Меласса характеризуется высоким содержанием са харов (43— 57%), в частности сахарозы (табл. 3). В микробиологической промышленности используется ряд других побочных продуктов (табл. 4). В дальнейшем необходи мо учесть потенциальные возможности постоянно возобновляю щихся сырьевых ресурсов — первичных продуктов фотосинтеза, в первую очередь гидролизатов древесины и депротеинизированного сока растений. Таблица 4. Побочные продукты, используемые в микробиологической промышленности в качестве основного сырья Продукт Характеристика Область гтр йменён йя~х Сульфитный щелок Картофельная барда Зерновая барда Гидрол Солодовое сусло Молочная сыворотка Депротеинизирован-ный сок растений Депротеинизирован- ный картофельный сок Гкдролизат древесных отходов торфа Гидролизат (упаренный) Пшеничные отруби СВ 4,0— 4,5 %, в том числе РВ 3,3— 3,5 % СВ 4,3— 4,5 %, в том числе РВ 2,0— 2,2 % СВ 7,3— 8,1 %, в том числе РВ 2,5— 2,9 % СВ 76— 78 %, в том числе сбраживаемых Сахаров 50% СВ 15— 20 %, в том числе РВ (мальтоза, декстрины) 8— 12 %, СВ 6,5— 7,5 %, в том числе лактозы 4,0— 4,8 %, белков 0,5— 1,0%, жиров 0,05— 0,4 %, витамины СВ 5— 8 %, в том числе РВ 0,8— 2,0 %, аминокислоты, витамины СВ 4— 5 %, в том числе РВ 0,5— 1,0 %, витамины, ами нокислоты СВ 6— 9 %, в том числе РВ 3— 4 %, органических кис лот 0,3— 0,4 % СВ 48— 52%, в том числе РВ 26— 33 % (галактоза, глюкоза, манноза, ксилоза, рамноза); гуминовые веще ства СВ 90— 92 %, в том числе экстрактивных веществ 48— 50%, крахмала 25— 30%, белков 11 — 13%, жиров 2,5— 3,0 %, целлю лозы 15— 17 % кормовых Производство дрожжей То же Производство дрожжей, антибиотиков, этанола Выращивание дрожжей, бактерий, микромицетов Получение дрожжей, эта нола, лактанов кормовых Выращивание дрожжей Производство хлебопекар ных дрожжей, антибиотиков Получение кормовых дрож жей То же Производство ферментов Источники минерального питания Азот. В бактериальных клетках азота до 12 % в пересчете на сухую биомассу, в мицелиальных грибах — до 10%. Микроорга низмы могут использовать как органические, так и неорганиче ские источники азота. Известно, что бактерии более требователь ны к источникам азота, чем большинство микромицетов, актиномицетов и дрожжей. У клеток животных и растений особые тре бования к источникам азота. Продуктивность по биомассе в за висимости от источника азота не всегда совпадает с продуктив ностью целевого метаболита и зависит также от условий культи вирования (табл. 5). При выращивании биомасс Таблица 5. Влияние минеральных источников азота на рост биомассы и биосинтез лимонной кислоты мутантом A . niger при поверхностном и глубинном культивирования (Р. Я- Карклиньш) Источник азота Поверхностное культивиро вание Глубинное культивиро вание АСБ, г/л Лимонная кислота, г/л АСБ, г/л Лимонная кислота, г/л (NH,) 2 SO 4 6,2 (NH 4 ) 2 HPO 4 4,2 NH 4 C1 5,5 KNO 3 5,0 40 59 60 30 12 15 14 11 9 15 82 95 101 30 30 88 Ca(NO 3 ) 2 3,5 NH.CONHs 6,9 35 58 в концентра ции 30— 40 г/л потребность в добавках азотсодержащих солей обычно не превышает 0,3— 0,4 % от объема среды. В периоди ческих режимах культивирования потребление азота заканчива ется в первые 6— 12 ч роста (в первой половине экспоненциаль ной фазы). При направленном биосинтезе азотсодержащих мета болитов потребность в азоте существенно возрастает. Большинство дрожжей хорошо усваивает аммиачные соли - сульфат аммония, фосфат аммония, а также аммиак из водного раствора. Соли азотной кислоты не всегда хорошо усваиваются. Только некоторые виды дрожжей испытывают потребность в нит ратах. Часто источником азота в состав сред включают мочевину. При направленном биосинтезе, например, целлюлолитических ферментов грибом Peniophora gigantea наивысшая биохимиче ская активность клеток наблюдается на средах с органическим азотом (аспарагин, пептон и др.). Другие минеральные соли. Фосфор, как известно, входит в со став нуклеиновых кислот, фосфолипидов и других важных компонентов клетки. Иногда фосфор накапливается в ней в виде поли фосфатов. Небольшая часть усвоенного фосфора существует в форме макроэргических соединений — АТР. Фосфор является важным компонентом клетки. Микроорга низмы нуждаются еще в 10 минеральных элементах, но в значи тельно меньших количествах (10~ 3 — 10~ 4 М). Повышенная по требность микроорганизмов в микроэлементах возникает, если целевой метаболит содержит микроэлемент. Так, при биосинтезе витамина В]2 в состав питательной среды включают кобальт; молибден и бор стимулируют биосинтез тиамина в клетках клубень ковых бактерий; медь присутствует в ряде ферментов, перенося щих электроны от субстрата к кислороду. Минеральный состав питательной среды формирует распределение электрических зарядов на поверхности клеток. Обычно клетки микроорганизмов имеют отрицательный потенциал (16— 20 мВ). При добавлении в среду электролитов он снижается, и тем сильнее, чем выше валентность добавляемого противоиона. Увеличение содержания К + или Na + до 500 мг/л уменьшает величину потенциала клеток до 10— 12 мВ. Введение в среду 60— 80 мг/л Са 2+ , Fe 2+ или Си 2+ , равно как и 5 мг/л А l +3 , может привести клетки в электронейтральное состояние. В отличие от бактерий дрожжи и мицелиальные грибы не перезаряжаются и не приобретают положительный потенциал. Изменение электриче ского потенциала клеток может изменить их физиологическую деятельность, воздействовать на селективность клеточной мем браны, вызвать флокуляцию или флотацию клеток. Комплексные обогатители сред Микроорганизмы лучше растут в присут ствии витаминов, аминокислот, цитокининов и других биологиче ски активных веществ. С наступлением эры антибиотиков и в связи с широким применением микроорганизмов в промышленно сти остро встал вопрос об экономически оправданных, сбаланси рованных по составу питательных средах. Эффективной добавкой оказался кукурузный экстракт благодаря наличию в нем витами нов, аминокислот и минеральных элементов в легко ассимилиру емых формах. Химический состав кукурузного экстракта приве ден ниже. Содержание, мг/ r СВ Алании 24— 59 Метионин 2— 6 Аргинин 10— 24 Фенилаланин 8— 13 Аспарагиновая кислота 10— 27 Пролин 16— 20 Цистин 2— 4 Серии 12— 20 Глутаминовая кислота 35— 88 Треонин 4— II Глицин Следы Тирозин 5— 10 Гистидин 2— 4 Триптофан 5— 10 Изолейцин 35— 42 Валин 8— 18 Лейцин 27— 42 Лизин 16— 37 Содержание, мкг/г С В Рибофлавин 7— 12 Биотин 15— 55 Тиамин 80— 100 Никотиновая кислота 120— 180 Пантотеновая кислота 80— 140 Содержание, % от золы Калий 25— 35 Натрий 4— 6 Кальций 12— 18 Железо 1— 2 Фосфор (Р 2 О 5 ) 0,3— 0,5 Марганец 0,2— 0,6 Цинк 0,2— 0,5 Медь 0,05— 0,1 Магний 10— 15 Алюминий 0,4— 0,5 Кроме кукурузного экстракта в рецептуры сред промышленного микробного синтеза включают дрожжевой автолизат, дрожже вой экстракт, гидролизат дрожжей, клеточный сок картофельных клубней, молочную сыворотку, экстракт пшеничных отрубей, эк стракт солодовых ростков и другие продукты. Иногда добавляют мясной и рыбный пептоны. Для культивирования животных кле ток используют экстракт плаценты, плазму крови животных. Для выращивания клеток растений или мицелия высших грибов при меняют экстракты тыквы, листьев хлопчатника, отвар слив и др. Пеногасители. Процессы пенообразования и пеногашения иг рают важную роль при аэробном глубинном культивировании микроорганизмов. При сбалансированных пенных режимах уве личивается межфазная контактная поверхность и достигается ин тенсивный массообмен между средой и аэрирующим воздухом. Вспенивание питательной среды, устойчивость пены и ее реологи ческие свойства (поверхностное натяжение, поверхностная вяз кость) зависят от состава среды (содержания Сахаров, липидов, белков, структурообразующих солей), режимов стерилизации и аэрации среды и пр. Для создания устойчивых режимов пенообразования приме няют механические и химические пеногасители и их комбинации. Химические пеногасители (поверхностно-активные вещества - ПАВ) делятся на жировые и синтетические. Жиры проявляют пеногасящие свойства в относительно высоких концентрациях (0,2— 1,0% от объема среды и выше). Кроме того, для многих микробиологических процессов они являются необходимыми или дополнительными питательными компонентами. При ассимиляции жиры, расщепляясь до жирных кислот, изменяют рН среды. Весьма эффективны синтетические пеногасители, (силиконы, пропинолы, контрамин, полиформаль и др.), выпускаемые для пищевой промышленности. В каждом конкретном процессе микробного синтеза экспери ментальным путем подбирают оптимальный пеногаситель и рас считывают его максимально допустимую дозировку. Флокулянты. В некоторых микробиологических процессах целесообразно стимулировать флокуляцию (конгломеризацию) клеток продуцента, например, для более эффективного фракци онирования клеток или с целью удерживания клеток в условиях непрерывной ферментации. Применяют химические флокулянты (хлорид кальция, соли фосфорной кислоты) или синтетические полиэлектролиты, которые могут быть анион-или катионактивные, или неионогены. На выпадающем в осадок фосфате кальция, например, адсорбируются клетки продуцента. Из анионактивных полиэлектролитов используют сополимер акриламида и натри евой соли акриловой кислоты. Катионактивные полиэлектролиты (например, цетазолакриламид с сополимером — катионогенным мономером) осаждают белковые вещества ферментируемой сре ды (до 20 г на 1 г полиэлектролита) и на них адсорбируются клетки. Эффективность применения флокулянтов во многом зависит от температуры культивирования, рН среды и физиологического состояния клеток. Кислород и вода Потребность аэробных микроорганизмов в молекулярном кис лороде зависит от источника окисляемого источника углерода и от физиологических свойств и активности роста микроорганизмов (рис. 2, табл. 7). Для биосинтеза 1 кг дрожжевой биомассы необходимо, например, 0,74— 2,6 кг молекулярного кислорода. При интенсивном потреблении субстрата продуцент ассимилирует независимо от источника углерода 0,83— 4,0 мг кислорода на 1 л среды в минуту. Растворимость кислорода в среде сравнительно низка и зави сит от температуры, давления и от концентрации растворенных, эмульгированных и диспергированных компонентов. При давле нии 0,1 МПа (1 кгс/см 2 ) и температуре 30 °С в 1 л дистиллирован ной воды максимальное количество растворенного кислорода со ставляет 7,5 мг. В реальной питательной среде максимальная растворимость кислорода 2-— 5 мг/л. Запасы кислорода в среде обеспечивают жизнедеятельность аэробного продуцента в течение 0,5— 2 мин. При глубинном культивировании запасы кислорода в питательной среде возобновляются при подаче аэрирующего воздуха. Скорость адсорбции кислорода увеличивается с ростом интенсив ности перемешивания среды (табл. 7). Таблица 7. Зависимость абсорбции кислорода в воде (мг/л) от концентрации растворенных, эмульгированных и диспергированных компонентов при температуре 20 °С Сахароза Подсолнечное масло Биомасса Концентра ция, % Абсорбция о э Концентра ция, % Абсорбция Концентра ция, % Абсорбция о а 0 2,5 8,2 0 7,8 0,05 8,9 0 1 1 ,6 3,0 8,0 4,1 5,0 7,5 10,0 15,0 7,2 0,10 6,6 0,15 5,9 0,20 4,8 0,25 18,9 6,0 19,0 9,6 22,3 16,0 24,0 32,0 2,4 1,5 1,2 0,8 Установлено, что во время роста биомассы микроорганизмы обычно потребляют больше кислорода, чем во время сверхсинте за целевого метаболита. Принято говорить о критической концен трации кислорода, при которой наблюдается лимитация дыхания клеток. Для большинства аэробных микроорганизмов, растущих в сахарсодержащих субстратах, критическая концентрация кис лорода 0,05— 0,10 мг/л, что соответствует 3— 8 % от полного на сыщения среды кислородом. Лимитация роста и физиологической деятельности клеток наблюдается при более высоких концентра циях кислорода: на средах с глюкозой рост дрожжей лимитиру ется при О 2 на уровне 20— 25% от полного насыщения, в сре дах с парафинами — при 50— 60 % от полного насыщения. Даль нейшее повышение интенсивности аэрации приводит к резким из менениям физиологической деятельности клеток. Таблица 8. Зависимость скорости абсорбции кислорода в воде от аэрации и перемешивания среды, мг/(л-мин) Количество по- Частота вращения мешалки, об/мин даваемого воз- духа в 1 мин, (М 3 /(М 3 -МИИ) 0 500 800 1000 1200 0,35 1 ,3 4,0 7,5 14.5 15,1 0,65 3,5 7,3 12,1 19,1 22, i 1 ,00 6,0 10,0 15,0 23,0 24,0 1,30 7,5 13,9 18,0 26,0 28,0 1,60 11,0 15,5 20,0 27,0 29,0 * Для лабораторного ферментатора рабочей емкостью 8 л. Оптимальной для роста биомассы считается концентрация кислорода 50— 60 % от полного насыщения, для биосинтеза целе вых метаболитов— 10— 20%. Вода составляет 80— 90 % биомассы микроорганизмов. Для приготовления питательных сред требуется чистая бес цветная вода, без привкуса, запаха и осадка, отвечающая требо ваниям ГОСТа. В воде, используемой для приготовления питательных сред, должно содержаться не более 50 мл/л хлори дов и не более 60 мг/л сульфитов. Концентрации ионов метал лов (в мг/л) не должны превышать следующих цифр: свинец — 0,2, мышьяк — 0,05, фтор — 1,5, цинк — 5,0, медь — 3,0. СОСТАВЛЕНИЕ РЕЦЕПТУР ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД . Среды для культивирования микроорганизмов Основной принцип составления рецептур питательных сред — удовлетворение физиологических потребностей микроорганизмов. В каталогах культур и в определителях указаны эти потребности, а также оптимальные значения рН и температуры. Задача специ алиста, оптимизирующего состав среды для конкретного штам ма — продуцента целевого продукта, — выбрать из перечня ис точников углерода, азота, фосфора и других веществ наиболее оправданные в экономическом и экологическом отношении ком поненты. С этой целью проводят лабораторные опыты, желатель но с использованием методов математического планирования эк сперимента. Концентрация основного сырья определяется с учетом коэф фициента его конверсии ( Y p / s и Y x / s ). При соблюдении оптималь ных условий культивирования коэффициент конверсии в биомас су ( Y x ) для метанола и глюкозы равен примерно 0,5; для этано ла— 0,70 — 0,75; для гексадекана — 1,0— 1,1; для жидких парафинов — 1,2 — 1,3. Это означает, что в условиях периотшческ^- го культивирования для выращивания 30 г биомассы в 1 л среды в субстрат должны быть внесены 60 г метанола, 40 г этанола, 30 г гексадекана или 24 г жидких парафинов. Концентрации метанола, превышающие 1,0%, или этанола, превышающие 1,5— 2,0%, обычно токсичны для микроорганиз мов. Глюкоза, сахароза, фруктоза и другие низкомолекулярные сахара в концентрациях более 7— 8 % также тормозят рост большинства микроорганизмов, поэтому при необходимости эти вещества вводят в питательный субстрат постепенно, по мере ассимиляции. Количество азотсодержащих веществ для конструктивного метаболизма определяют из содержания азота в биомассе и предполагаемого ее урожая, учитывая, что около 5 % азота оста ется неиспользованным. Кроме минерального азота ряд микроор ганизмов усваивает азот белка, пептидов и аминокислот, внесен ных в среду с органическим сырьем. Точную потребность микроорганизмов в минеральном питании выясняют, культивируя их на строго синтетических средах, состоящих из компонентов в чистом виде (перекристаллизованные соли) и дистиллированной воды. Потребность в минеральных элементах, необходимых для выращивания биомассы (30 г/л), перечислена ниже. Компонент Концентрация, г/л Источник азота — ( NH 4 ) 2 SO 4 12 Источник фосфора — KHUPO 4 1,3 Источник магния — MgSQt 1,5 Макроэлементы Fe , Са, Mg По 10 -3 Микроэлементы Си, Со, Zn , Mo , Mn По 10 -4 Таким образом, для составления рецептур все компоненты должны быть взяты в соотношениях, пропорциональных потреб ностям культивируемого микроорганизма, и с учетом предполага емого урожая биомассы. Рецептуры составляют, пользуясь сле дующей формулой: C1/A1=C2/A2=C3/A3 = S 0 где С — концентрация компонента i в сбалансированной питательной среде ( i =1,2 /г); A — коэффициент конверсии компонен та / для выбранной культуры; So — заданный запас компонентов в среде, в единицах концентрации биомассы. Соблюдение данного правила обеспечивает разработку состава сред, сбалансированных по всем компонентам, и более или менее полную ассимиляцию всех ингредиентов среды во время фермента ции. Для ауксотрофных микроорганизмов необходимую концентра цию дефицитных факторов подсчитывают с учетом потребностей выращиваемой культуры. В 1 г сухой биомассы метионин- и трео ниндефицитного мутанта Brevibacterium flavum содержится 7 мг треонина и 15 мг метионина. Соответственно для выращивания, например, 20 г биомассы этого мутанта в 1 л среды питательный субстрат должен содержать 30 мг% метионина и 14 мг% треони на, которые вносят с комплексным обогатителем. Тиаминдефицитный мутант Candida lipolytica для синтеза 1 г биомассы требует 0,09 мкг тиамина, для выращивания биомассы 20 г/л среда должна содержать 18 мкг треонина. Для прототрофных культур, которые получают интенсификато ры роста, оптимальные дозы выбранного комплексного стимуля тора устанавливают экспериментальным путем для каждой кон кретной системы культивирования. Побочные ингредиенты. Для приготовления питательных сред, как правило, используют технические и нестандартные продукты, содержащие разного рода примеси, которые также влияют на рост и биосинтетическую активность продуцента. Примеси и побоч ные продукты могут положительно влиять на процесс фермента ции (белки, аминокислоты, органические кислоты, минеральные вещества и др.), но могут оказать и тормозящее влияние. Допустимые концентрации некоторых потенциально вредных при месей для дрожжей представлены в табл. 10. Таблица 10. Концентрация (в %) некоторых примесей, ингибирующих дрожжи Saccharomyces cerevisiae Примеси Рост за- Рост по- Примеси Рост за- Рост подав- держи- давляет- держи- ляется вается ся вается Органические кис- Нитриты 0,0005 — Лоты Формалин 0,09 — щавелевая 0.001 од Фтористый натрий 0,002 — муравьиная 0,0085 0,2 Тяжелые металлы уксусная 0,02 0,2 медь — 0,005 масляная 0,005 0,05 серебро — 0,000001 молочная 1,35 — МЫШЬЯК — 0,0005 Оксид серы 0,0025 — Среды для выращивания клеток растений и животных Помимо источников углерода, азота и других минеральных компонентов, среда для клеток многоклеточных организмов содер жит специфические стимуляторы и регуляторы роста. Клетки растений, как правило, требуют индолуксусную кислоту, кинетин и гиббереллиновую кислоту. Клетки животных нуждаются в росто вых веществах и незаменимых аминокислотах. Клетки растений и животных более чувствительны, чем микроорганизмы, к присут ствию посторонних ингредиентов, поэтому требуют химически чистых компонентов среды. Общая характеристика сред для культивирования клеток растений и животных приведена в табл. 11. Таблица 11. Состав сред (в мг/л) для клеток животных и растений Компоненты Клетки животных Клетки растений CaCl 2 -2 H s O 185— 264 150— 440 Fe(NO 3 h-9H 2 O FeSO,.7H 2 O 0,03— 0,1 27— 28 KCI 320— 440 — KNO 3 1900— 2500 КН 2 РО , 60 170— 340 MgCl 2 -6H a O 170 — MgSO 4 -7H a O NaCl 161— 242 5100— 8000 250— 370 NaHCO 3 350— 3700 — NaH 2 PCv2H 2 O J 00— 1500 134 NH 4 NO 3 _ 1200— 1650 Незаменимые аминокис- + — лоты Ростовые вещества Специфичные, в том числе Специфичные, в том числе инсулин — 0,1 — 10; глю- индолуксусная кислота — кагон — 0,05— 5,0; прос- 1— 30; кинетин — 0,02— тагландииы ei — Е 2 — по 10; 6-бензиладенин— 1,0— 0,01; соматомедин С - 5,0; гиббереллиновая кис- 0,001; гидрокортизон — лота — 0,5— 10 и др. до 0,03; прогестерон — до 0,003; эстрадной - - до 0,003; тестостерон — до 0,003 и др. ЛИТЕРАТУРА. Биотехнология/под ред. И. Хиггинса, Д. Беста, Дж. Джонса/пере вод с английского/под ред. А. А. Баева. — М.: Мир, 1988. — 479 с. Биотехнология микробного синтеза/под ред. М. Е. Бекера — Рига: Зинатне, 1980. — 350 с. Быков В. А., Винаров В. А., Шерстобитов В. В. Расчет про цессов микробиологических производств. — Киев: Техника, 1985. — 244 с. Виестур У. Э., Кристапсонс М. Ж., Б ы л и н к и н а Е. С. Куль тивирование микроорганизмов. — М.: Пищевая промышленность, 1980. — 232 с. Виестур У. Э., Ш м и т е И. А., Ж и л е в и ч А. В. Биотехнология. — Биотехнологические агенты, технология, аппаратура. — Рига: Зинатне, 1987. — 263 с. Воробьев Л. И. Техническая микробиология. — М.: Высшая школа, 1987. — 94 с. Д е б а б о в В. Г., Лившиц В. А. Биотехнология. — М.: Высшая шко ла, 1988. Л и е п и н ь ш Г. К-, Д у н ц е М. Э. Сырье и питательные субстраты для промышленной биотехнологии. — Рига: Зинатне, 1986. — 156 с.