Вход

Содержание аскорбиновой, дегидроаскорбиновой и дикетогулоновой кислот в эритроцитах здоровых детей и страдающих инсулинзависимым сахарным диабетом

Курсовая работа по биологии
Дата добавления: 03 февраля 2004
Язык курсовой: Русский
Word, rtf, 1.2 Мб
Курсовую можно скачать бесплатно
Скачать
Данная работа не подходит - план Б:
Создаете заказ
Выбираете исполнителя
Готовый результат
Исполнители предлагают свои условия
Автор работает
Заказать
Не подходит данная работа?
Вы можете заказать написание любой учебной работы на любую тему.
Заказать новую работу
оглавление Введение 2 ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 3 1.1.б иохимические процессы при созревании и старении эритроцитов 3 1.1.1. Характеристика эритроцитов 3 1.1.2. Энергетический обмен в эритроцитах 5 1.1.3. Антиоксидантная система эритроцитов 6 1.2. Аскорбат как компонент АОС эритроцитов 8 1.2.1. Строение и физико-химические свойства аскорбата 8 1.3. Сахарный диабет как один из распространёенных патологических процессов 9 ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 11 2.1. Подготовка эритроцитов 11 2.2. Метод раздельного определения аскорбиновой , дегидроаскорбиновой и дикетогулоновой кислот в эритроцитах 11 2.3. СТАТИСТИЧЕСКАЯ ОБРАБОТКА РЕЗУЛЬТАТОВ 13 Г лава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 14 ВЫВОДЫ 15 литература 16 SUMMARY 19 Приложение 20 Введение Зрелые эритроциты млекопитающих – это высокоспециализированные безъяде р ные клетки . Основной функцией эритроцитов является транспорт кислорода от клетки к тканям и углекислоты в обратном направлении . Высокие концентрации кислород а и процессы оксигенации – деоксигенации гемоглобина обуславливают образование в ы сокореакционных интермедиатов кислорода , вызывающих нарушение нормального функционирования клетки . Существует антиоксидантная система защиты клетки от свободнорадикального оки сления . В её состав входит ряд ферментов и небелковых веществ . Важную роль в антиоксидантной системе играет вещество небелковой пр и роды – аскорбат . Он обладает широким спектром антиоксидантных свойств , в частн о сти , только аскорбат достаточно реакционноспо собен для эффективного ингибиров а ния инициации перекисного окисления липидов . Аскорбат блокирует поглощение кислорода и образование перекиси водорода ; присутствие аскорбата в клетках оказ ы вает защитное действие на гемоглобин , препятствуя его окислению . Аск орбат в ходе выполнения своих биохимических функций обратимо переходит в окисленную форму – ДАК и ДКГК . Основную роль в биохимических процессах играет редокс-пара – АК /ДАК . По данным литературы , это соотношение может меняться при различных патологических п роцессах , одним из наиболее распространённых из них является и н сулинзависимый сахарный диабет . Исследования , направленные на изучение измен е ния содержания АК , ДАК и ДКГК в клетках могут быть одним из критериев , свид е тельствующих о наличии в организме вышеу казанных процессов. Целью данной работы явилось определение содержания АК , ДАК , ДКГК в общей эритроцитарной массе у детей , страдающих инсулинзависимым сахарным диабетом . Данная работа представляет собой часть исследований , проводимых на кафедре би о химии и физиологии человека и животных КГУ по изучению метаболизма эритроц и тов. ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1. б иохими ческие процессы при созревании и старении эритроцитов 1.1.1. Характеристика эритроцитов Зрелый эритроцит человека является упрощенной клеткой по биохимической и структурной организации . Это высокоспециализированная безъядерная клетка . Эри т роциты человека образуются из ядросодержащих клеток преимущественно в костном мозге . В этих предшественниках эритроцитов содержатся субклеточные структуры и ферментные системы , необходимые для деления , созревания , дифференцировки , п р о цессов биосинтеза ДНК , РНК , белков , в том числе глобина , синтеза гема , липидов , у г леводов , других соединений . На этой стадии развития эритроцита осуществляются окислительные процессы , тканевое дыхание , анаэробное расщепление углеводов (гл и колиз ), прямое окисление глюкозы через пентозофосфатный путь (Черняк Н.Б ., 1976). До сих пор нет достаточно чётких представлений о том , как соотносятся отдел ь ные стадии созревания ядерных клеток с изменениями химического состава и обмена веществ . Однако известно , что в п роцессе развития клетки на стадии нормобласта уменьшается количество РНК , увеличивается содержание гемоглобина и утрачивается способность к синтезу ДНК , в связи с чем нарушается способность к митотическому делению. Ретикулоциты – безъядерные клетки , образу ющиеся на последнем этапе созрев а ния , предшествующем образованию эритроцитов , характеризуются схожей морфол о гией , в частности , содержат митохондрии , рибосомы , ЭПР . В ретикулоцитах ос у ществляется биосинтез глобина , гема , пуринов , пиридиннуклеотидов , фосфати дов , липидов (Фёдоров Н.А ., Черняк Н.Б ., 1976). РНК практически не синтезируется . Пр о исходит фосфорилирование , сопряжённое с окислением , и гликолиз (Гинодман Л.М ., 1968). В обмене веществ ретикулоцитов участвуют эндогенные и экзогенные субстр а ты , в том чис ле аминокислоты , глюкоза. Последний этап созревания – превращение ретикулоцита в эритроцит – протекает 1-3 дня . Происходят значительные изменения в обмене веществ и морфологии клеток (Фёдоров Н.А ., 1976). В зрелых безъядерных эритроцитах нарушены биологиче ский аппарат дыхания , системы синтеза белка , пуринов , порфиринов . Сохраняется способность к гликолизу , утилизации небольшого количества глюкозы в пентозном цикле и синтезу некоторых соединений , например , глутатиона. В норме длительность жизни эритроцитов п оддерживается в течение 120 дней специализированными ферментными системами . Выведение эритроцитов из циркул я ции связано с изменениями (структурных компонентов , химического состава , исто ч ников энергии ), характеризующими старение клеток . Наиболее характерным и изм е нениями при старении эритроцитов являются : 1) уменьшение активности различных ферментов гликолиза и пентозного ци к ла , что понижает интенсивность данных процессов (Мортенсен , Брайн , 1974); 2) уменьшение содержания липидов , что приводит к изменению стр уктуры эритроцитов , увеличению чувствительности к осмотическому лизису и механич е ским воздействиям ; 3) изменения в составе катионов в результате изменения проницаемости ме м браны ; 4) изменение содержания АТР , что в свою очередь связывается как с одной из пр ичин нарушения проницаемости , так и с уменьшением приживаемости эритр о цитов в кровяном русле. Одной из ведущих гипотез старения является свободнорадикальная гипотеза , предложенная Д . Хартманом . Она связывает причины возрастных изменений с накоплением молек улярных повреждений в мембранах и генетическом аппарате клетки свободными радикалами и продуктами перекисного окисления липидов . Нарушение нормального функционирования клетки обусловлено высокими ск о ростями образования высокореакционных интермедиатов кисло рода (суперокси д радикал , пероксид водорода , гидроксильный радикал ), что , в свою очередь , связ а но с постоянно протекающими процессами оксигенации и деоксигенации гем о глобина и наличием высоких концентраций кислорода в ходе выполнения осно в ной функции эритро цитов – транспорта кислорода от клетки к тканям и углеки с лого газа в обратном направлении. 1.1.2. Энергетический обмен в эритроцитах Для поддержания функциональной активности клеток организма необходима з а трата энергии . Зрелые эр итроциты , циркулирующие в кровяном русле , являются м е таболически активными клетками , несмотря на отсутствие способности к синтезу бе л ков , аэробному расщеплению глюкозы в лимоннокислом цикле Кребса (Владимиров Г.Е . по Рапопорту , 1970). Основным процессом об мена энергии в них является глик о лиз . Процесс , протекающий в эритроцитах , близок к процессам в других клетках и тканях , и подробно описан (Фёдоров Н.А . по Райкеру , 1976). К особенностям гликолиза в эритроцитах можно отнести использование , помимо глюкозы , д ругих моносахаридов : фруктозы , маннозы , галактозы , а также инозина , сорбита при наличии соответствующих ферментов (Йошикава , 1968). В процессе гл и колиза происходит образование АТР и NADH . Энергия гликолиза используется для активного транспорта катионов чер ез клеточную мембрану и поддержания соотнош е ния между ионами калия и натрия в эритроцитах и плазме , для сохранения целостн о сти мембраны и двояковогнутой формы клетки . Образующийся NADH используется для восстановления пировиноградной кислоты в молочную и дл я восстановления ме т гемоглобина при участии метгемоглобинредуктазы . В составе метгемоглобина соде р жится трёхвалентное железо , вследствие чего он не способен к транспорту кислорода . Характерной особенностью гликолиза в эритроцитах является превращение 1,3- дифосфоглицерата не только в 3-фосфоглицерат , но и в 2,3-дифосфоглицериновую кислоту под действием дифосфоглицеромутазы . 2,3-дифосфоглицерат имеет , наряду с АТР , важное значение в регуляции сродства гемоглобина к кислороду . По мере стар е ния эритроцита прои сходит уменьшение способности к восстановлению метгемогл о бина в гемоглобин , т.е . нарушение функциональной активности эритроцита . Это св я занно именно с уменьшением интенсивности гликолиза , в результате которого обр а зуется NADH , необходимый для действия метг емоглобинредуктазы . Уменьшение с о держания 2,3-дифосфоглицерата приводит к сдвигу диссоциационной кривой влево , ухудшению отдачи кислорода тканям. Итогом всех реакций гликолиза является превращение 1 молекулы глюкозы в 2 молекулы молочной кислоты с одноврем енным превращением 2 молекул ADP в 2 м о лекулы АТР. Наряду с гликолизом – анаэробным расщеплением глюкозы до молочной кислоты – в эритроцитах существует дополнительный путь утилизации глюкозы – прямое окисление до углекислого газа и воды в ходе пентозофосфа тного цикла . Этот путь н е отличим от подобных процессов , протекающих в других клетках и тканях ; суммарным результатом цикла является окисление одной из 6 молекул глюкозо -6-фосфата до 6 молекул СО 2 и восстановление 12 молекул NADPH . Роль пентозного цикла в з релых эритроцитах заключается , с одной стороны , в образовании пентозофосфатов . В реа к ции цикла образуется 3-глицероальдегидфосфат , подвергающийся превращениям в цепи гликолитических реакций и , таким образом , является дополнительным источн и ком энергии . Осно вное значение пентозофосфатного цикла заключено в образовании молекул NADPH . Значение NADPH определяется его участием в ряде реакций , нео б ходимых для поддержания функциональной активности и целостности эритроцитов . К ним относятся восстановление метгемогло бина в гемоглобин при участии NADPH и метгемоглобинредуктазы и восстановление окисленного глутатиона с помощь . NADPH - глутатионредуктазы . Восстановленный глутатион ( GSH ), форма со свободно реагирующей тиоловой группой составляет в эритроцитах до 96% общего количества . Сохранение глутатиона в восстановленном состоянии необходимо для предохранения ряда ферментов , содержащих SH - группы , от инактивации , ограждение мембраны клетки от действия перекисей и необратимого окислительного денатурирования гем о глобина. 1.1.3. Антиоксидантная система эритроцитов Основная функция эритроцитов – транспорт кислорода от лёгких к тканям и СО 2 в обратном направлении . Благодаря высоким концентрациям кислорода и постоянно протекающим процессам оксигенации – деоксигенации гемоглобина , в этих клетках с высокой скоростью идут процессы образования свободных радикалов : Н 2 О 2 , ОН - . Кроме того , в эритроцитах в результате аутокаталитических реакций образуются п е рекиси и гидроперекиси липидов. Основное количество О 2 - в эритроцитах образуется при аутоокислении гемогл о бина в метгемоглобин . Это пример генерации супероксидного радикала , связанной с неферментативным окислением субстрата : Hb + O 2 Hb … O 2 MetHb + O 2 - Большую роль в защите клетки от свободных радикалов играют ферментативные антиоксиданты . Эритроциты содержат высокоактивную супероксиддисмутазу , кот о рая осуществляет дисмутацию двух O 2 - с образованием перекиси водорода : O 2 - + O 2 - H 2 O 2 + O 2 Образовавшаяся перекись водорода , являющаяся сильнейшим окислителем , ч а стично нейтрализуется неферментативным путём при непосредственном участии а с корбата или других антиоксидантов ( -токоферол , глутатион в осстановленный ). О с новное количество Н 2 О 2 расщепляется в реакциях , катализируемых каталазой и гл у татионпероксидазой : Н 2 О 2 + Н 2 О 2 2Н 2 О + О 2 Н 2 О 2 + RH 2 2Н 2 О + R Важную роль в антиоксидантной си стеме эритроцитов играют легкоокисляющи е ся пептиды , содержащие аминокислоты с SH -группой : метионин , цистеин . Особое м е сто занимает глутатион – трипептид , образованный цистеином , глутаматом , глиц и ном . В организме он присутствует в окисленной и восстановленн ой форме ( GSH ). О с новной антиоксидантный эффект глутатион оказывает , участвуя в работе фермент а тивных антиоксидантов . Глутатион является ингибитором активированных кислоро д ных радикалов и стабилизатором мембран . Это связано с тем , что SH - содержащие с о един ения подвергаются окислению в первую очередь , что предохраняет от окисления другие функциональные группы. Немаловажный вклад в защиту клетки от органических радикалов вносят нефе р ментативные антиоксиданты . Эффективными перехватчиками органических радик а лов являются фенольные антиоксиданты , имеющие в структуре ароматическое кол ь цо , связанное с одной или несколькими гидроксильными группами . Имеется нескол ь ко тысяч фенольных соединений , обладающих антиоксидантным эффектом : витамины группы Е и К , триптофан , фен илаланин , убихиноны , большинство животных и раст и тельных (каротиноиды , флавоноиды ) пигментов . Синтезируется ароматическое кол ь цо только у высших растений и микроорганизмов , поэтому многие из фенольных а н тиоксидантов входят в группу облигатных пищевых , кот орые эффективно ингибир у ют О 2 - , ОН - и индуцируемые ими процессы перекисного окисления (Оксенгендлер , 1985). Антиоксидантными свойствами обладают хелатные соединения , связывающие м е таллы переменной валентности (церулоплазмин , мочевая кислота , трансферрин ). Тем самым они препятствуют вовлечению их в реакции разложения перекисей , поскольку в присутствии металлов переменной валентности образование высокореакционных радикалов усиливается (Эристер , 1987). Таким образом , развитие и функционирование клеток в кисло родсодержащей ср е де не представляется возможным без существования защитных систем – специализ и рованных ферментативных и неферментативных антиоксидантов . В живых органи з мах постоянен процесс образования прооксидантов , уравновешиваемый дезактивац и ей их антио ксидантными системами . Для поддержания гомеостаза регенерация ант и оксидантов должна быть непрерывной . Отсутствие или нарушение в её непрерывной работе приводит к развитию окислительных процессов , к накоплению окислительных повреждений , что сопровождает ряд патологических физиологических процессов , например , старение (Оксенгендлер , 1985). 1.2. Аскорбат как компонент АОС эритроцитов 1.2.1. Строение и физико-химические свойства аскорбата Витамин С ( L -аскор биновая кислота ) входит в состав алифатического ряда вит а минов . По своему строению он может быть отнесен к производным углеводов . Это г- лактон 2,3-дегидро- L -гулоновой кислоты , производное ненасыщенных полиокси- г- лактонов . Структура близка структуре -глюкозы. Благодаря наличию двух асимметричных атомов углерода в 4 и 5 положениях , а с корбиновая кислота (АК ) образует 4 оптических изомера и 2 рацемата . D - и L - а с корбиновые кислоты в природе не встречаются и синтезированы искусств енным п у тём . Наличие в АК двух сопряжённых двойных связей (углерод-углеродной и углерод-кислородной ) обуславливает ее способность к обратимому окислению , продуктом к о торого является дегидроаскорбиновая кислота (ДАК ). ДАК устойчива , но ее лакто н ное кольцо, в отличие от стабилизированного двойной связью лактонного кольца L -АК в водном растворе легко гидролизуется с образованием 2,3-дикетогулоновой ки с лоты (2,3-ДКГК ). Эта реакция необратима , ее скорость возрастает при повышении температуры и рН среды . Через р яд дальнейших превращений ДКГК переходит в щ а велевую и L -треоновую кислоты . Такое же превраще ние имеет место в организме (Халмурадов , Тоцкий , 1993): Сп особность к О-В превращениям , связанная с ендольной группировкой , которая стабилизирована находящейся в цикле соседней карбонильной группировкой , сопр о вождающаяся перенесением атомов водорода к акцепторам , является важнейшей к а талитической функцией АК в жи вом организме . L -АК по своей биологической акти в ности высокоспецифична . Витаминная активность проявляется только при наличии свободных гидроксильных групп . Различные функциональные производные по ним лишают молекулу витаминной активности почти полностью , к ак и гидрирование н е насыщенной связи лактонного кольца . Поэтому L -ДАК имеет витаминную акти в ность , равноценную L -АК , тогда как 2,3-ДКГК полностью ее лишена . Вследствие ле г кой окисляемости L -АК – донор Н + , она количественно легко восстанавливает мног о числен ные соединения , как-то : йод , перманганат калия и другие . L -АК – переносчик Н + в некоторых ферментативных реакциях живой клетки , она легко окисляется перо к сидазой , цитохромоксидазой , каталазой . L -АК восстанавливает окисленные формы ферментов , окисляясь в ДА К , обратимо легко регенерирующуюся в АК под действием глутатиона за счет его сульфгидрильной группы : Окисление АК катали зируется медью , в меньшей степени – катионами серебра и железа . Имеется предположение , что специфическим катализатором окисления АК в животных организмах является белок , синтезирующийся в печени , осуществляющий транспорт меди , обладающий оксигеназной акти в ностью , - церулоплазмин . В мен ь шей степени окисление аскорбата катализируют другие катионы , в частности , серебра и железа . Комплексоны , флавоноиды тормозят окислительный распад АК . Некоторые белки ингибируют окисление АК , связываясь с ней или путём образов ания комплекса с медью – сывороточные глобулины (Борец , 1980). Окисление тормозится – SH соде р жащими соединениями : сернистая кислота блокирует фермент аскорбиназу ; С- SH св я зывает ионы Cu + , удаляя т . с . катализатор окисления АК из реакции (Киверин , 1971). 1 .2.2. Биосинтез АК в живом организме L -АК синтезируется в растениях и организме некоторых животных из D -глюкозы через лактон D -глюкуроновой кислоты и L -гулоно- г- лактон или их производное . В процессе биосинтеза происходит превращение соединений D -ряда в соединения L -ряда (Березовский , 1993): Биосинтез АК в организме животных происходит в клетках печени , почек , надп о чечников , гипофиза , стенки тонкого к ишечника (Киварин , 1973). 1.2.3. Физиологические свойства аскорбата Витамин С является постоянной составной частью тканей и органов человека . Его поступление в организм должно быть ежедневным , т . к . аскорбат , играя важную роль в обменных процессах органи зма , все время расходуется . Он восстанавливает оки с ленные формы ферментов , активирует некоторые протеазы , тормозит действие амил а зы и протеазы поджелудочной железы , активирует эстеразу печени . L -АК участвует в обмене некоторых ароматических аминокислот , ре гулирует уровень холестерина в крови , усиливает антитоксические функции гепатоцитов (вкупе с глюкозой ), норам а лизирует белковообразование . Витамин С необходим для нормального функционир о вания клеток , продуцирующих коллаген , активирует и регулирует зритропо эз (сп о собствуя усвоению железа ), нормализует нарушенное протромбинообразование , но р мализует процессы свертывания (Андреев ; 1996). Аскорбат играет положительную роль в развитии иммунных реакций организма , обладает некоторым детоксициру ю щим свойством , являе тся существенным фактором профилактики и лечения инфекц и онных заболеваний. Витамин С оказывает положительное воздействие на углеводный обмен . Волы н ский З . М . с сотрудниками показали , что повышает синтез гликогена в печени , и что нарастание содержания глико гена в печени , как правило , прямо пропорционально п о вышению в этом органе витамина С . К такому выводу позволяют прийти многочи с ленные клинические наблюдения последнего времени , подтверждающие ценное сво й ство АК обладать нормализующим действием на уровень с ахара в крови . Подобный эффект связан с синергическим действием аскорбата и гормонов – инсулина и адрен а лина . Витамин С может усиливать действие инсулина или действовать аналогично ему , способствуя образование гликогена в печени . Синергизм возникает косвен ным путем через воздействие инсулина и витамина С на общегормональный фон органи з ма. Таким образом , АК оказывает разностороннее влияние на процессы обмена в е ществ у здоровых людей , а при различных патологических состояниях благоприя т ствует нормальному тече нию обмена веществ и функционированию различных орг а нов и систем организма (Бременер ; 1997). 1.3. Сахарный диабет как один из распространенных патологических процессов Диабет сахарный ( diabetes mellitus ; сахарная болезнь , сахарн ое мочеизнурение ) – эндокринное заболевание , обусловленное дефицитом гормона инсулина в организме или его низкой биологической активностью ; характеризуется хроническим течением , нарушением всех видов обмена веществ , ангиопатией. Сахарный диабет представляе т собой самую распространённую эндокринную п а тологию . В его развитии существенную роль играют наследственная предраспол о женность и неблагоприятное воздействие окружающей среды , однако , характер наследственной предрасположенности и так называемых факторов р иска различны при разных типах сахарного диабета . Факторами риска развития сахарного диабета являются появление антител к -клеткам островков поджелудочной железы , частые вирусные инфекции , гиподинамия , ожирение , нерациональное или недостаточное п и тание , стрессы , генетически отягощенный по сахарному диабету анамнез и другие. Согласно классификации ВОЗ , различают два основных типа сахарного диабета . Это инсулинзависимый (I тип ) и инсулиннезависимый ( II тип ) сахарный диабет . И н с улинзависимый сахарный диабет , как правило , развивается у лиц молодого возраста и детей , имеющих генетическую предрасположенность к сахарному диабету именно данного типа . Инсулиннезависимым сахарным диабетом чаще болеют лица , старше 50 лет (особенно женщи н ы ). Наследственная предрасположенность играет большую роль , чем при сахарном диабете I – типа. Механизм развития сахарного диабета сложен и многогранен . Он зависит как от функции самой поджелудочной железы , так и от внепанкреатических факторов . Прежде все го , нарушен обмен углеводов . Из-за недостатка инсулина или других пр и чин затрудняется переход глюкозы в мышечную и жировую ткань , снижается синтез гликогена в печени , усиливается образование глюкозы из белков и жиров (глюконе о генез ). В развитии этих процес сов увеличивается содержание глюкозы в крови . Если в норме оно довольно устойчиво и натощак у здоровых людей колеблется в пределах 3,33 – 35,55 ммоль /л (70 – 100 мг %), то при сахарном диабете в зависимости от фо р мы и тяжести течения обычно превышает 6,00 ммоль /л , достигая 20 – 30 ммоль /л и больше. Диабет у детей и подростков характеризуется тяжелым течением и , как правило , острым началом заболевания . От времени появления первых признаков заболевания (жажда , похудание , выделение большого количества мочи , общ ая слабость , сухость кожи ) до развития тяжёлого состояния и значительных нарушений обмена веществ , проходит обычно 2 недели . Дети , больные сахарным диабетом , требуют обязательного лечения и постоянного лечебного контроля. ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Нами обследован 41 ребёнок , страдающий инсулинзависимым сахарным диаб е том , и 10 человек контрольной группы . Объектом исследования служили эритроциты больных и здоровы х детей . Для получения эритроцитов кровь брали из локтевой вены капельным способом , в качестве антикоагулянта использовали гепарин. Исследования проводили в общей эритроцитарной массе детей , страдающих инс у линзависимым сахарным диабетом , и детей контрольно й группы. 2.1. Подготовка эритроцитов Свежую гепаринизированную кровь разливали в центрифужные пробирки по 5 мл . После пятнадцатиминутного центрифугирования при 3000 об /мин при 4 0 С отбир а лись и отбрасывались лейкоцитарный слой и плазма . Эритроциты суспендировали в десятикратном объёме 0.9% раствора NaCl и центрифугировали в течение пятнадцати минут при 3000 об /мин . Супернатант отсасывали , процедуру повторяли 3 раза . Это делалось для более плотной упаковки эритроцитов. 2.2. Метод раздельного определения аскорбиновой , дегидроаскорбиновой и дик е тогулоновой кислот в эритроцитах Для количественных определений АК , ДАК и ДКГК использовали метод J . H . Roe , C . A . Kuether (1943) в модификации В.В . Соколовского , Л .В . Лебедевой , Т.Б . Лиэлуп (1967). Метод основан на взаимодействии 2,4- динитрофенилгидразина с ДАК с обр а зованием в серной кислоте соответствующего озазона . ДАК и ДКГК дают красное окрашивание , используемое для фотометрического определения . Для вычисления суммы всех кислот их окисляют 2,6- дихлорфенолиндофенолятом натрия . Содержание АК определяют по разности . Для дифференцированного определения ДАК и ДКГК смесь подвергают действию восстановителей , при этом в АК восстанавливается тол ь ко ДАК . В качестве вос становителя использовали димеркаптопропансульфонат натрия (унитиол ) Реактивы : 1. 2 . 10 М унитиол (0.84 мл 5% раствора ампулированного препарат в 100 мл 0.2 М фосфатного буфера рН 7.0. хранить не более суток ). 2. 5% трихлоруксусная кислота (ТХУ ). Хранить в холодильнике не более двух недель. 3. 85% раствор серной кислоты (100 мл воды + 900 мл концентрированной серной кислоты ). 4. 2% раствор 2,4-динитрофенилгидразина в 9Н серной кислоте , содержащей 0.25% тиомочевины (хранить в холодильнике не более 1 месяц а ). 5. 0.001 Н раствор 2,6- дихлорфенолиндофенолята натрия (краска Тильманса ). Хранить в темноте не более 1 недели . 6. 0.9% раствор хлорида натрия (физиологический раствор ). Ход определения. В три пробирки помещали по 0.5 мл упакованных и отмытых от пл азмы эритроц и тов с известным гематокритом . В первую прибавляли 0.25 мл физиологического ра с твора и 0.25 мл унитиола . После пятнадцатиминутной инкубации при периодическом помешивании суспензии отбирали 0.5 мл экстракта , к которому прибавляли 1.5 мл ТХУ. В д ве другие пробирки также прибавляли по 1.5 мл ТХУ. В две пробирки вносили по 0.75 мл супернатанта , полученного при центрифуг и ровании смеси упакованных эритроцитов с ТХУ . В одну из пробирок добавляли по каплям 0.001 Н раствор 2,6- дихлорфенолиндофенолята на трия до появления слабор о зового окрашивания , устойчивого в течение 30 секунд . В третью пробирку помещали 0.75 мл супернатанта , полученного после центрифугирования смеси упакованных эритроцитов с физиологическим раствором , унитиолом и ТХУ . Во все пробирки д о бавляли по 0.25 мл 2,4- динитрофенилгидразина и доводили объём до 1.25 мл дисти л лированной водой , инкубировали при 100 0 С в течение 10 минут и охлаждали в лед я ной бане . В каждую пробирку добавляли небольшими порциями 1.25 мл 85% раствора серной кислоты , охлаждая в ледяной бане после каждой порции . Окрашенные раств о ры фотометрировали через час при длине волны 540 нм. Концентрацию кислот определяли по формуле : С = (3*А )/0.085; где С – концентрация кислот , мг % 3 – концентрация стандартного раствора , мг % А – оптическая плотность пробы 0.085 – оптическая плотность стандартного раствора 2.3. СТАТИСТИЧЕСКАЯ ОБРАБОТКА РЕЗУЛЬТАТОВ Результаты исследований обрабатывались статистически (Лакин И.А ., 1976). Г лава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Целью исследования являлось определение содержания аскорбата и его окисле н ных форм – ДАК и ДКГК в общей эритроцитарной массе взрослых , страдающих ИЗСД , со стажем болезни более 10 ле т ; сравнение и сопоставление полученных р е зультатов с данными , полученными ранее , в ходе работы со здоровыми детьми и стр а дающими ИЗСД . В эксперименте участвовал 21 взрослый в возрасте от 25 до 40 лет , 37 больных детей и группа контроля , включающая 10 здор овых детей . Результаты и с следований отображены на диаграммах. Рис .1. Содержание общей АК , А К , ДАК и ДКГК в эритроцитах здоровых детей и детей , страдающих ИЗСД (мг %) Рис . 2. Содержание общей АК , АК , ДАК и ДКГК в эритроцитах взрослых , страд а ющих ИЗСД (мг %) Как следует из полученных результатов , в эритроцитах детей и взрослых , страд а ющих ИЗСД , наб людается увеличение содержания окисленной форма АК-ДАК , что может свидетельствовать о нарушении процесса восстановления АК в ДАК , большем участии АК в метаболических процессах , нарушении транспорта АК в клетке. Процентное содержание общей АК , АК , ДАК и ДКГ К также демонстрирует пр е валирование окисленных форм АК над восстановленной. Рис . 3. Содержание общей АК , АК , ДАК и ДКГК в эритроцитах здоровых детей и страдающих ИЗСД (%). Рис . 4. Содержание общей АК , АК , ДАК и ДКГК в эритроцитах взрослых , страд а ющих ИЗСД (%). Все полученные данные согласуются с данными литературы об изменении общего количества АК в организме при патологии (нормальное содержание составляет 5 – 15 мг %) и соотношения «окисленная форма АК /восстановленна я форма АК» в сторону увеличения первой. ВЫВОДЫ 1. Содержание общей АК в эритроцитах детей и взрослых , страдающих ИЗСД , составляет 19.52 мг % и 6,47 мг %, в эритроцитах здоровых детей – 12.48 мг %. 2. Содержание восстановленной АК в эритроцитах больных детей и взрослых составляет 4.1 и 2,01 мг % (20.5 и 31% от общей АК ), в эритроцитах здоровых детей – 4.28 мг % (33%). 3. Содержание окисленных форм АК – ДАК и ДКГК в эритроцитах бол ьных д е тей и взрослых составляет 15.5 и 4.46 мг % (79.5 и 69% от общей АК ), в эри т роцитах здоровых детей – 8.36 мг % (67%). 4. В общей эритроцитарной массе больных детей соотношение окисленная фо р ма АК / восстановленная форма АК составляет 4/1, что свидетель ствует о пр е валировании окисленной формы АК над восстановленной. 5. В общей эритроцитарной массе здоровых детей это соотношение равно 2/1, т.е ., налицо тенденция к росту содержания восстановленной АК. Заключение Уже давно доказали тот факт , что аскорбин овая кислота является постоянной с о ставной частью тканей и органов человека . Важность выполняемых ею физиологич е ских функций не подлежит сомнению . Некоторые из них давно известны и хорошо изучены . Например , то , что витамин С оказывает благоприятное воздейс твие на раб о ту иммунной системы , нормализует эритропоэз и продукцию коллагена , является компонентом антиоксидантной системы клетки . Однако многочисленные исследов а ния недавнего времени показали , что возможности этого вещества гораздо шире , чем представляло сь до сих пор . К примеру , было обнаружено ценное свойство аскорбата нормализовать уровень сахара в крови , оказывая положительное воздействие на угл е водный обмен . При выполнении этой и других биохимических функций аскорбиновая кислота обратимо окисляется в ДАК , при последующем воздействии окислителя н е обратимо переходит в ДКГК . По данным литературы , соотношение «окисленная фо р ма АК /восстановленная форма АК» может изменяться при различных патологиях , как и ее общее содержание в организме . Одной из распростран енных патологий является инсулинзависимый сахарный диабет . Поскольку ИЗСД является эндокринной патол о гией , протекающей с нарушением углеводного обмена , в регуляции которого аскорбат играет немаловажную роль , было бы логичным предположить , что его содержани е в организме больного окажется иным , чем у здорового человека . Экспериментальные данные подтвердили это предположение . В организме больного ребенка содержание общей АК повышено на 37 % по сравнению с общей АК и составляет 19,52 мг %, тогда как нормальным с читается наличие от 5 до 15 мг % аскорбата . Среднее значение АК у здорового ребенка – 12,48 мг %. В то время как содержание ДКГК в процентном соо т ношении практически не изменено и составляет у больных и здоровых детей 46 и 49,4 % соответственно (6,16 мг % и 8 ,96 мг %), концентрация ДАК у больных детей пов ы шена против здоровых почти вдвое и составляет 33,5 % вместо 17,6 % (6,54 мг % и 2,2 мг %). Основные различия выявляются в процентном содержании восстановленной формы АК . Ее содержание у здоровых детей составляет 33 % общей АК (4,28 мг %), тогда как у больных детей оно ниже на 13 % и составляет 4,1 мг %. Таким образом , с о отношение «окисленная форма АК /восстановленная форма АК» у больных детей с о ставляет 4:1, в отличие от здоровых детей , у которых оно равняется 2:1. На основании этих данных можно предположить следующие причины подобных изменений содержания общей АК и ее метаболических форм в организме больных ИЗСД детей : 1) При ИЗСД нарушены все виды обмена веществ в организме – углеводный , бе л ковый и жировой . В посл еднем случае возрастает количество свободных рад и калов , вследствие чего АОС испытывает большую нагрузку . Возрастает соде р жание одного из ее компонентов – аскорбата , он более активно включается в метаболические процессы , возможно , тем самым в какой-то мере компенсир у ется снижение концентрации другого ее компонента – С- SH ; 2) Почти двукратное возрастание уровня ДАК в организме больного ребенка при практически неизменном количестве ДКГК может свидетельствовать о нар у шении процесса восстановления ДАК в АК ; воз можно снижена активность фермента ДАК – редуктазы . При ИЗСД ее активность снижена на 50 %, что приводит к сокращению содержанияС- SH , необходимого для процесса восст а новления ДАК в АК . Одновременно снижается активность ГБФДГ , в реакции которой образуется не обходимый для работы С- R NADPH ; 3) Нарушение транспорта АК в клетке. Несколько иная картина наблюдается в отношении взрослых , страдающих ИЗСД . Здесь общее содержание АК находится близко к нижнему пределу нормы и составляет 6,47 мг %. Содержание ДКГК состав ляет 11,4 % (0,73 мг %), ДАК – 57,6 % (3,73 мг %), АК – 31 % (2,01 мг %). Сопоставляя эти показатели с таковыми у детей , можно закл ю чить , что активное участие АК в работе АОС решено не количественным , а кач е ственным путем . Так , доля неактивной ДКГК составляет 11 %, тогда как на долю м е таболически активных АК и ДАК приходится 89 % от общего количества АК . Такое превалирование активных форм АК особенно в сочетании с повышенным содержан и ем АК может указывать на своеобразную «адаптацию» фермента ДАК-редуктазы в хо де многолетнего лечения болезни (свыше 10 лет ). Для подтверждения данных пре д положений и выяснения механизма приспосабливаемости (если таковая имеется ) необходимы дальнейшие исследования. В настоящее время определенно сказать можно следующее : страдающие ИЗ СД , особенно дети , в процессе лечения нуждаются в проведении антиоксидантной тер а пии. литература 1. Абрамова Ж.И ., Оксенгендлер Г.И . Человек и противоокислительные вещ е ства . – Л .:Наука , 1985. – 230 С. 2. Авраамова Т.В ., Титова Н.М . Руководство по большому биохимческому пра к тикуму . – Красноярск : Изд-во КГУ , 1978, ч .1. – С .80-82. 3. Асатиани В.С . Ферментные методы анализа . – М .:Наука , 1969. – С .26-40. 4. Ахромеева Г.И . Определение дегидроаскорбиновой кислоты в пищевых пр о дуктах //Вопросы питания . – 1988. -№ 3. – С .66-88. 5. Ашкинази И.Я . Разрушение эритроцитов // Физиология системы крови . Ф и зиология эритропоэза . – Л .:Наука , 1979. – С .274-334. 6. Березовский В.М . Химия витаминов . – М .:Пищевая промышленность , 1973. – С .230-300. 7. Борец В.М . Витамины . – М .:Наука , 1980. – 29 С. 8. Бохински Р . Современные воззрения в биохимии . – М .:Мир , 1987. – С .120-154. 9. Браунштейн А.Е . Процессы и ферменты клеточного метаболизма . – М .:Наука , 1987. – 44С. 10. Бременер С.М . Витамины . – М .:Медицина , 1974. – 194С . 11. Бреслер В.М ., Никифоров А.А . Транспорт органических кислот через плазм а тические мембраны дифференцированных эпителиальных слоёв у позвоно ч ных . – Л .:Наука , 1981. – С .52-111. 12. Букин В.Н . Биохимия витаминов . – М .:Наука , 1982. – С .17-19. 13. Владимиров Г.Е . Об энергетической функции АТФ в клетке . – Л .:Наука , 1980. – 44С. 14. Гаврилов О.К ., Козинец Т.И ., Черняк Н.В . Клетки костного мозга и периф е рической крови . – М .:Медицина , 1985. – 288С. 15. Галактионов С.Г . Биологически активные. – М .:Молодая гвардия , 1988. – С .4-84. 16. Григорьев Г.П . Цитохром Р -450 и витамин С //Вопросы питания . – 1983. -№ 4. – С .5-10. 17. Дегли С ., Никольсон Д . Метаболические пути . – М .:Мир , 1973. – С .189-196. 18. Домбровская Ю.В . Витаминная недостаточность у дете й . – М .:Медицина , 1983. – 63С. 19. Ефимов А.С ., Бездробный Ю.В . Структура и функции инсулиновых рецепт о ров . – Киев .:Наукова думка , 1987. – С .4-104. 20. Канунго М . Биохимия старения . – М .:Медицина , 1982. – 194С. 21. Киверин М.Д . Витамин С и профилактика С-вита минозных состояний на С е вере . – Сев.-Зап . книжное изд ., 1971. – С .5-7. 22. Кон Р.М . Ранняя диагностика болезней обмена веществ . – М .:Медицина , 1986. – С .17-42. 23. Косяков К.С . Клиническая биохимия . – Л .:Медицина , 1997. – С .113-118. 24. Меньщикова Е.Б ., Зенко в Н.К . Антиоксиданты и ингибиторы радикальных окислительных процессов // Усп . совр . биол . – 1993. – № 4. – С .442-455. 25. Мережинский М.Ф . Нарушения углеводного обмена при заболеваниях чел о века . – Минск .:Медицина , 1987. – С .22-28. 26. Моисеева О.И . Физиологиче ские механизмы регуляции эритропоэза . – Л .:Наука , 1985. – 185С. 27. Мосягина Е.Н ., Владимирская Е.Б . Кинетика эритрона //Кинетика фермент а тивных элементов крови . – М .:Медицина , 1976. – С .101-122. 28. Мосягина Е.Н ., Фёдоров Н.А ., Гудим В.И . Эритропоэз // Норм альное кров е творение и его регуляция /Под ред . Н.А.Фёдорова . – М .:Медицина , 1976. – С .341-457. 29. Новое в гематологии /Под ред.А.И . Воробьёва , Ю.И.Лория . – М .:Медицина , 1974. – С .18-22. 30. Новикова С.Г . На приёме больной сахарным диабетом //Здоровье . – 1997 . -№ 3.-С .14-19. 31. Спиричев В.Б . Врождённые нарушения обмена витаминов . – М .:Медицина , 1995. – С .12-19. 32. Патологическая биохимия /Под ред . А.Ф . Симёнова . – М .:Медицина , 1994. – С .130-147. 33. Рубина Х.М . Биохимия эритроцитов //Физиология системы крови . Физиол о гия эритопоэза . – Л .:Наука , 1978. – С .211-232. 34. Рубина Х.М . Некоторые данные о связи метаболизма эритроцитов с их кисл о родно-транспортной функцией //Проблемы гематологии и переливания крови . – 1973. -№ 8. – 35С. 35. Рысс М.Н Витамины . – Л .:Наука , 196 3. – С .3-9. 36. Свободные радикалы в биологии /Под ред . У.Прайор . – М .:Мир , 1979. – С .272-308. 37. Смирнов Н.И . Витамины . – М .:Медицина , 1974. – С .34-40. 38. Соколовский В.В ., Лебедева Л.В ., Лиэлуп Т.Б . Определение аскорбиновой , дегидроаскорбиновой и дикетог улоновой кислот в биологических тканях // Лаб.дело . – 1967. -№ 12. – С .160-162. 39. Суровова А.П . Витамины в нашем рационе // Здоровье . – 1997. -№ 2. – С .17-20. 40. Схимниковский Б.Г . Авитаминозы у детей //Здоровье . – 1998. -№ 6. – С .11-13. 41. Черницкий Е.А ., В оробей А.В . Структура и функции эритроцитарных ме м бран . – Минск : Наука и техника , 1981. – С .23-56. 42. Черняк Н.Б . Биохимические процессы при созревании и старении эритроц и тов //Нормальное кроветворение и его регуляция . – М .:Медицина ,1976. – С .159-186. 43. Baker W.I. Urate and ascorbate: their possible roles as antioxidants in determining longevity of mammalian species //Arch. Biochem. and Biophis. – 1987. -№ 2. – Р .451-457. 44. Basu S., Som S., Ded S. Dehydroascorbic acid reduction in human erythrocytes //J. Chromatogr. Biomed. Appl. – 1991. -№ 1-2. – Р .529-542. 45. Burns J., Evans C. Ascorbic acid in human erythrocytes // J. Biol. Chem. – 1996. - № 4. – P. 223-241. 46. Penney J., Zilua S. Role of ascorbate in our organism // J. Biochem. – 1994. - № 2. – P. 37-49. 47. Pradhu H.R., Krishnamurthy S. Inhibition of ascorbate autooxidation by human blood //Curr. Sci. (India). – 1986. - № 8. – Р .403-405. 48. Sahashi Y., Mioki T., Hasegama T. Reduction of ascorbate in erythrocytes // J. Vi t aminol. – 1996. - № 12. – P.6 – 14. 49. Thompson R.Q. Ascorbic acid content of plasma and cellular components of blood //Anal.Chem. – 1987. - № 8. – Р .1119-1121. 50. Yamazaki M., Mioki T. Ascorbic acid is cellular components // J. Ferment. Tec h nolog. – 1995. - № 7. – P. 422-513. SUMMARY The main aim of this work is the study of concentration ascorbic acid, dehydroascorbic acid and DCGA in the human ’ s erythrocytes. The concentrations of the AA, DAA & DCGA were learned in the common erythrocytes mass. Our results showed that concentration of AA is lower that concentration of DAA, DCGA. Приложение 1 Содержание АК , ДАК и ДКГК в эритроцитах детей , страдающих инсулинзавис и мым сахарным диабетом (мг %) № АК ДКГК ДАК АК 1 27,32 13,06 7,9 6,36 2 27,68 16,66 8,9 2,12 3 12,56 5,3 3,52 3,74 4 17,86 10,02 4,16 3,68 5 19,78 11 6,36 2,42 6 17,84 10,66 6,70 0,84 7 26,64 12,14 7,8 6,7 8 13,18 4,14 3,88 5,16 9 18,04 10,26 4,40 3,38 10 19,74 11,12 6,22 2,4 11 27 16,94 8,06 2 12 18,14 10,8 6,82 0,52 13 19,76 8,48 4,24 7,04 14 14,82 8,32 5,30 1,2 15 27,52 8,48 9,32 9,68 16 17,01 8,15 6,8 2,06 17 19,5 7,01 9,1 3,39 18 16,4 6,4 5,43 4,57 19 17,7 5,22 7,92 4,56 20 12,4 4,81 6,1 1,49 21 16,33 7,49 6,4 2,44 22 17,77 6,29 9,2 2,21 23 23,27 10,01 7,6 5,66 24 18,8 7,26 8,13 3,41 25 20,5 8,16 7,3 5,04 26 22,55 9,25 6,24 7,06 27 17,74 9,14 6 2,6 28 19,22 7,17 7,3 4,75 29 16,38 6,19 6,29 3,9 30 24,14 10,21 7,24 6,69 31 16,88 8,19 5,3 3,39 32 19,02 9,14 4,9 4,98 33 19,74 6,7 7,16 5,88 34 22,16 10,2 8,12 3,84 35 16,01 6,9 5,49 3,62 36 13,3 7,1 4,2 2,08 37 19,2 9,03 6,59 3,58 19,52 8,96 6,54 4,1 % 100 46 33,5 20,5 Приложение 2 Содержание АК , ДАК и ДКГК в эритроцитах детей , страдающих инсулинзавис и мым сахарным диабетом и здоровых детей форма АК ДКГК ДАК АК АК ДКГК ДАК АК АК М m М m М m М m М m М m М m М m С 19.52 8.96 0.9 6.54 0.49 4.1 0.04 12.48 0.5 6.16 1.01 2.2 0.56 4.28 0.82 0.89 % 100 46 33.5 20.5 100 49.4 17.6 33 Р <0.01 <0.05 <0.01 <0.01 <0.01 <0.05 <0.01 <0.01
© Рефератбанк, 2002 - 2018