Вход

Биосинтетическое получение дейтериймеченного L-фенилаланина

Реферат по биологии
Дата добавления: 07 июня 2007
Язык реферата: Русский
Word, rtf, 1.5 Мб
Реферат можно скачать бесплатно
Скачать
Данная работа не подходит - план Б:
Создаете заказ
Выбираете исполнителя
Готовый результат
Исполнители предлагают свои условия
Автор работает
Заказать
Не подходит данная работа?
Вы можете заказать написание любой учебной работы на любую тему.
Заказать новую работу
Биосинтетическое получение деитериймеченного L -фенилаланина, секретируемого метилотрофным мутантом Brevibacterium rnethylicum Н а примере L -фенилаланинсекретирующего мутанта Brevibacterium methylicum продолжены исс ледования по использованию метилотрофных бактерий для биосинтетического получения амино кислот, меченных стабильными изотопами. Представлены данные по адаптации L -фенилаланин секретирующего метилотрофа В, methylicum к максимальной концентрации дейтерия в среде: 98 % D 2 O и 2% CD 3 OD по объему. Разработанный метод позволяет получать изотопно-меченный L -фенилаланин разной степени изотопного обогащения, вплоть до полной замены атомов водорода на дейтерий, что подтверждено данными масс-спектрометрического анализа. Контроль биосинте тического включения дейтерия в секретируемые аминокислоты был осуществлен с использованием производных типа метиловых эфиров N -дансил-аминокислот и последующей масс-спектрометрией электронного удара. Метилотрофные бактерии — группа микроорга низмов, способных расти на метаноле и других восстановленных производных углерода, являются весьма притягательными биотехнологическими объ ектами, возможности практического применения ко торых реализованы явно недостаточно [1, 2]. Одним из наиболее важных направлений работ с метилотрофными микроорганизмами являются исс ледования, направленные на поиск или конструиро вание новых продуцентов аминокислот и других биологически активных соединений. В плане нача тых исследований по получению аминокислот, ме ченных стабильными изотопами [3 — 6], практиче ский интерес представляет использование метилот- рофов, особенно продуцентов аминокислот для пол учения целевых соединений за счет биоконверсии низкомолекулярных меченых субстратов. Традици онным подходом при этом остается селекция проду центов биологически активных соединений (БАС) [7,8]. Безусловно, наиболее целесообразным является использование облигатных метилотрофов, которые способны ассимилировать меченые Ci -субстраты в качестве единственного источника углерода [9]. Как было показано на примере L -лейцинсскретирущего облигатного метилотрофа Methylobacillus flagellatum , полная замена в среде метанола на его 13 С-аналог практически не сказывается на величине лаг-фазы и уровне накопления биомассы, а степень биосинте тического изотопного обогащения характеризуется главным образом изотопной чистотой 13 Ci -субстра та [3]. Известно, что исчерпывающее биосинтетическое обогащение дейтерием бактериальных микроорга низмов при высоких концентрациях изотопа в среде может вызвать ингибирование биосинтеза клеточ ных протеинов и тем самым замедлить бактериаль ный рост [10]. В отличие от микроводорослей [11], бактерии весьма чувствительны к высокому содер жанию дейтерия в среде и, как правило, не способны выдерживать концентрации оксида дейтерия более чем 75 % [4, 12]. В связи с этим разработка способов возможной адаптации метилотрофных микроорга низмов к максимальному содержанию дейтерия в среде представляется очень актуальной. Целью данной работы было исследование динами ки роста микробной биомассы и секреции деитерий меченного L -фенилаланина лейцинзависимым му- тантом В. methylicum за счет биоконверсии дейтеро-мета нола на средах с тяжелой водой разного уровня дейтерирования. УСЛОВИЯ ЭКСПЕРИМЕНТА Бактериальные штаммы. Исследования ли с факультативным лейцинзависимым (макси мальная потребность в L -лейцине — 100 мкг/мл) метилотрофом В. methylicum , продуцентом L -фе нилаланина, полученным из коллекции культур ВК ПМ НИИ генетики и селекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ В 5652). Исходный штамм поддерживали на агаризованной (2 %-ный агар) среде М9 [13] с метанолом (2 %). Штаммы хранили в водном 70 %-ном растворе глицерина при -10°. Адаптированный к максимальному содержанию дейтерия в среде лейциновый ауксотроф В. met hylicum был получен в серии пассажей с последова тельным отбором хорошо растущих клонов на ага- ризованных средах (с 2 % С D зО D по объему), содержащих ступенчатое увеличение концентрации дейтерия (начиная с нсдсйтерированных сред, вплоть до полной замены воды и метанола на их дсйтери- рованные аналоги). Адаптированный к дейтерию штамм В. methylicum поддерживали на агаризованных средах М9 (см. выше) с максимальным содержанием дсйтеро-ком- понентов. Для приготовления питательных сред с различным содержанием СОзОО и D 2 O использовали соли марки «х. ч.», D 2О (99,9 % D ) и CD 3 OD (99,6 % О), получе нные из Всесоюзного центра «Изотоп» (Санкт-Пе тербург, РФ), а также L -лейцин ( Reanal , Венг рия). Для получения производных аминокислот использовали Н-диметиламинонафталин-5-сульфо- хлорид (дансилхлорид) ( Sigma , США) и диазометан. Для получения диазометана применяли N -нитрозо- метилмочевину, закупленную у Merck (Германия). Посевной материал выращивали до ранней фазы экспоненциального роста бактериальной культуры на средах разного уровня дейтерирования, затем вносили в ферментационные среды с соответствую щим изотопным насыщением D 2 O и СОзО D (табли ца) в количестве 5 об. % и культивировали, как описано ниже. Выращивание посевного материала и фермента цию проводили на синтетической среде М9 [13] с десятикратным избытком NH 4 C 1 (так как в предва- Влияние изотопного состава питательной среды на величину лаг-фазы, выход биомассы и время генерации В. methylicum Номер опыта Компоненты среды, об. % Лаг-фаза, ч Выход биомассы, % от контрольного Время генерации, ч Н 2 0 D 2 0 CHjOH CD 3 OD 1 98 0 2 0 24 100 2,2 2 98 0 0 2 30 92 2,4 3 73,5 24,5 2 0 32 90 2,4 4 73,5 24,5 0 2 35 86 2,6 5 49 49 2 0 40 70 3,0 6 49 49 0 2 44 60 3,2 7 24,5 73,5 2 0 46 56 3,5 8 24,5 73,5 0 2 49 47 3,8 9 0 98 2 0 60 33 4,4 10 0 98 0 2 64 30 4,8 Данные приведены для В. methylicum , не адаптированного к средам с высоким содержанием дейтерия. рительных экспериментах по оптимизации состава питательных сред показано, что такое увеличение концентрации хлористого аммония в среде стимули рует биосинтез L -фенилаланина несмотря на неко торое увеличение продолжительности лаг-фазы) и L -лсйцином. После стериллизации рН доводили до величины 7,0— 7,2 при помощи NaOH . В качестве источника углерода использовали метанол (2 % от объема среды) или его дейтериймеченный аналог. Культивирование бактерий проводили при 37° в условиях интенсивной аэрации растущей культуры в колбах емкостью 750 мл с наполнением 100 — 150 мл среды. Морфологию клеток В. methylicum иссле довали с помощью поляризационно-интерфсрснци- онного микроскопа « Biolar » (Польша). Рост культу ры контролировали на спектрофотометре « Beckman DU 6» (США) при X 620 нм. Все эксперименты по биосинтетическому включе нию дейтерия проводили параллельно с контроль ным (см. таблицу) на стандартной недейтерирован- ной среде. Для каждого эксперимента по биосинтетическому введению дсйтериевой метки в В. methylicum клетки на ранней фазе экспоненциального роста осаждали центрифугированием (10000 мин" 1 , 5 мин). После отделения биомассы супернатант лиофилизовали. Сухой остаток супернатанта, содержащий фенила- ланин, переводили в метиловые эфиры N -дансил-производных аминокислот, как описано в работе [3]. ТСХ осуществляли на пластинках « Silufol » (Че- хо-Словакия) в системах: (А) — изопропанол-амми ак (7:3) и (Б) — хлороформ-метанол-ацетон (7:1:1). Количественное определение секретируемого фе- нилаланина производили методом ТСХ на пластин ках « Silufol » в системе (А). Образцы КЖ объемом 10 мкл наносили на пластинки. Элюирование прояв ленных нингидрином пятен фенилаланина проводи ли 0,5 %-ным раствором хлористого кадмия в 50 %- ном этаноле. Концентрацию аминокислоты опреде ляли спектрофотомстрически с использованием кри вой корреляции при X 540 нм. Очистку метиловых эфиров N -дансил-производ ных аминокислот из КЖ, содержащей дейтерий, осуществляли с помощью колоночной (150 х 40 мм) хроматографии на силикагеле L 40/100 ( Chemapol , Чехо-Словакия) с градиентной элюцией системой хлороформ-метанол (от 0 до 10 % метанола). Детекцию при ТСХ проводили 0,2 %-ным раство ром нингидрина в ацетоне. N -Дансильные производ ные аминокислот идентифицировали в системе (Б) по характерной флуоресценции в УФ-свете. Аминокислоты идентифицировали сопоставлени ем их спектральных и хроматографичсских характе ристик с литературными данными [14], сравнением со стандартными аналогами, а также подтверждали данными масс-спсктрометричсского (МС) анализа их производных. Масс-спектры электронного удара производных аминокислот измерены на приборе МВ-80 A ( Hitachi , Япония) при энергии ионизирующих электронов 70 эВ. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Как известно, большинство микроорганизмов, рас пространенных в природе, к которым относятся ме- тилотрофы, не могут служить хорошими продуцен тами ароматических аминокислот, вследствие нали чия эффективных механизмов регуляции биосинтеза этих соединений в микробной клетке, хотя эта спо собность появляется у ряда их мутантных форм [15 — 17]. Активными микробными продуцентами L -фснилаланина являются, как правило, мутанты, у которых снят негативный контроль со стороны таких ключевых ферментов биосинтеза этой аминокисл оты, как префенатдегидратаза (ПД) и дезоксиара- биногептулозофосфатсинтстаза (ДАГФ-синтетаза) [18, 19]. Определенный интерес в связи с этим представляет исследование способности продуциро вать L -фенилаланин лейцинзависимым метилотроф-ным мутантом В. methylicum , достаточно удобным, хотя и малоизученным объектом для биотехнологи ческого применения. Поэтому начальный этап биохи мических исследований В, methylicum был связан с получением ауксотрофных мутантов, для которых в большинстве случаях характерны ограниченный спектр мутантных фенотипов и кроме того довольно высо кий уровень реверсий [20 — 23]. Исходный лейцин- зависимый штамм В. methylicum , продуцент L -фени лаланина, был отобран в лаборатории генетики ме-тилотрофов НИИ генетики и селекции промышлен ных микроорганизмов на предыдущем этапе работы после обработки В. methylicum нитрозогуанидином по устойчивости к аналогу фенилаланина мета- фторфенилаланину (50мкг/мл.). Выделенные таким образом аналогорезистентные мутанты конвертиро вали метанол и накапливали при этом фенилаланин в ферментационной среде. Сравнительные анализы аминокислоты методом тонкослойной хроматографии и масс-спектрометрии показали, что фенилаланин, секретиру- емый В. mcthylicum , полностью идентичен коммер ческому L -фенилаланину. Мы изучали влияние степени замещенности дей терием низкомолекулярных субстратов воды и мета нола в составе питательных сред на рост полученного ауксотрофа, величину лаг-фазы и времени клеточ ной генерации (см. таблицу), а также секрецию дейтериймеченного фенилаланина. Продолжитель ность лаг-фазы, время генерации и максимальная секреция фенилаланина В. melhylicum в условиях изотопных экспериментов (см. таблицу, опыт 2, 4, 6, 8, 10) представлены на гистограмме (рис. 1). Секреция , г/л Рис. 1. Характеристики бактериального роста В. methylicutn выход биомассы, время генерации и максимальная секреция фенилала нина) на средах с изотопным составом, соответствующим номерам экспериментов 2, 4, 6, 8, 10 в таблице Как видно из представленных данных, в отсутст вие дейтериймеченных субстратов при росте исходной бактерии на протонированной среде продолжитель ность лаг-фазы не превышала 24 ч (см. таблицу, опыт 1). С увеличением содержания тяжёлой воды в среде продолжительность лаг-фазы увеличивалась до 64 ч на средах с 98 % D 2 O и 2 % CD 3 OD по объему (см. таблицу, опыт 10). Если замена метанола на его дейтерированный аналог не вызывала существенного ингибирования роста бактерий и не сказывалась на выходе микробной биомассы, то на средах с высоким содер жанием оксида дейтерия микробный рост был замет но подавлен. Вследствие этого в экспериментах, где оксид дейтерия преобладал в среде (см. таблицу, опыт 9, 10), выход биомассы был значительно ниже, чем в контрольных экспериментах и в тех случаях, когда использовали простую воду и дейтеро-метанол (см. таблицу, опыт 2). Как видно, длительность времени генерации бактериальной культуры с уве личением изотопного насыщения среды дейтерием увеличивается. Из данных таблицы видно, что про должительность лаг-фазы и время клеточной гене рации бактерии при переходе со стандартной на дейтерирован ные среды находятся в определенной корреляции. Так например, в условиях эксперимента 10 продол жительность лаг-фазы увеличивается в 2,6 раза, а время генерации возрастает в 2,2 раза. С целью увеличения эффективности изотопного мечения клеточных БАС и аминокислот и интенси фикации роста метилотрофа на полностью дейтери рованных средах мы адаптировали полученный му тант В. methylicum к максимальному содержанию дейтерия в среде культивирования. Для этого были проведены пять серий адаптационных пассажей на агаризованных средах (с 2 % С D 3ОО по объему) при ступенчатом увеличении концентрации оксида дей терия в них (см. таблицу). Последовательно отбира ли наиболее продуктивные по уровню накопления дейтерированной биомассы клоны В. methylicum и пересевали их на среды с большей степенью дейте рирования, вплоть до полной замены воды и мета нола на их дейтерированные аналоги (выживаемость на полностью дейтерированных средах не более 40 %). Полученный в результате ступенчатого отбора шта мм В. methylicum , адаптированный к дейтерию, пе реносили затем с максимально насыщенных дейте рием агаризованных сред на жидкие среды М9, приго товленные исключительно из 98 % D 2 O (99,9 % D ) и содержащие 2 % СОзО D , и культивировали, как описано в эксперименте. Динамика роста бактерии В. m е thylicum , адаптированного к высокому содержанию дейтерия в среде, и способ ность секретировать L -фенилаланин в условиях мак симально насыщенных дейтерием сред представлены на рис. 2. дО время, ч Секреция Рис. 2 . Динамика роста В. methylicum ( la , 10'а, 10 d ) и секреция фенилаланина (16, 10'б, 10 б) на средах с изотопным составом, соответствующим номерам эксперимента в таблице: I а,б — исходный метилотроф на стандартной среде М9; 10'а,б — адап тированный к высокому содержанию дейтерия В. melhylicum на полностью дейтерированной среде; 10 а,б — неадаптированный метилотроф на полностью дейтерированной среде Выход биомассы, время генерации и максималь ная секреции фенилаланина исходным мутантом (10) и мутантом, адаптированным к высокому содер жанию дейтерия в среде (10'), на средах, максималь но насыщенных дейтерием, приведены в гистограм ме на рис. 3 относительно контрольного (У). Срав нивали ростовые данные адаптированного к дейте рию метилотрофа и секрецию фенилаланина (опыт 10') с исходным В. methylicum на стандартной среде М9 (опыт I ) и на полностью (98 % D 2О) дейтери рованных средах с 2 % CD 3 OD (опыт 10). Как видно из графиков на рис. 2, степень заме щенности дейтерием воды и метанола не оказывает м • и биомассы, % 0тк0нтрол»н