Биосинтетическое получение деитериймеченного L -фенилаланина, секретируемого метилотрофным мутантом Brevibacterium rnethylicum
Н а примере L -фенилаланинсекретирующего мутанта Brevibacterium methylicum продолжены исс ледования по использованию метилотрофных бактерий для биосинтетического получения амино кислот, меченных стабильными изотопами. Представлены данные по адаптации L -фенилаланин секретирующего метилотрофа В, methylicum к максимальной концентрации дейтерия в среде: 98 % D 2 O и 2% CD 3 OD по объему. Разработанный метод позволяет получать изотопно-меченный L -фенилаланин разной степени изотопного обогащения, вплоть до полной замены атомов водорода на дейтерий, что подтверждено данными масс-спектрометрического анализа. Контроль биосинте тического включения дейтерия в секретируемые аминокислоты был осуществлен с использованием производных типа метиловых эфиров N -дансил-аминокислот и последующей масс-спектрометрией электронного удара.
Метилотрофные бактерии — группа микроорга низмов, способных расти на метаноле и других восстановленных производных углерода, являются весьма притягательными биотехнологическими объ ектами, возможности практического применения ко торых реализованы явно недостаточно [1, 2].
Одним из наиболее важных направлений работ с метилотрофными микроорганизмами являются исс ледования, направленные на поиск или конструиро вание новых продуцентов аминокислот и других биологически активных соединений. В плане нача тых исследований по получению аминокислот, ме ченных стабильными изотопами [3 — 6], практиче ский интерес представляет использование метилот- рофов, особенно продуцентов аминокислот для пол учения целевых соединений за счет биоконверсии низкомолекулярных меченых субстратов. Традици онным подходом при этом остается селекция проду центов биологически активных соединений (БАС) [7,8].
Безусловно, наиболее целесообразным является использование облигатных метилотрофов, которые способны ассимилировать меченые Ci -субстраты в качестве единственного источника углерода [9]. Как было показано на примере L -лейцинсскретирущего облигатного метилотрофа Methylobacillus flagellatum , полная замена в среде метанола на его 13 С-аналог практически не сказывается на величине лаг-фазы и уровне накопления биомассы, а степень биосинте тического изотопного обогащения характеризуется главным образом изотопной чистотой 13 Ci -субстра та [3].
Известно, что исчерпывающее биосинтетическое обогащение дейтерием бактериальных микроорга низмов при высоких концентрациях изотопа в среде может вызвать ингибирование биосинтеза клеточ ных протеинов и тем самым замедлить бактериаль ный рост [10]. В отличие от микроводорослей [11], бактерии весьма чувствительны к высокому содер жанию дейтерия в среде и, как правило, не способны выдерживать концентрации оксида дейтерия более чем 75 % [4, 12]. В связи с этим разработка способов возможной адаптации метилотрофных микроорга низмов к максимальному содержанию дейтерия в среде представляется очень актуальной.
Целью данной работы было исследование динами ки роста микробной биомассы и секреции деитерий меченного L -фенилаланина лейцинзависимым му-
тантом В. methylicum за счет биоконверсии дейтеро-мета нола на средах с тяжелой водой разного уровня дейтерирования.
УСЛОВИЯ ЭКСПЕРИМЕНТА
Бактериальные штаммы. Исследования ли с факультативным лейцинзависимым (макси мальная потребность в L -лейцине — 100 мкг/мл) метилотрофом В. methylicum , продуцентом L -фе нилаланина, полученным из коллекции культур ВК ПМ НИИ генетики и селекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ В 5652).
Исходный штамм поддерживали на агаризованной (2 %-ный агар) среде М9 [13] с метанолом (2 %). Штаммы хранили в водном 70 %-ном растворе глицерина при -10°.
Адаптированный к максимальному содержанию дейтерия в среде лейциновый ауксотроф В. met hylicum был получен в серии пассажей с последова тельным отбором хорошо растущих клонов на ага- ризованных средах (с 2 % С D зО D по объему), содержащих ступенчатое увеличение концентрации дейтерия (начиная с нсдсйтерированных сред, вплоть до полной замены воды и метанола на их дсйтери- рованные аналоги).
Адаптированный к дейтерию штамм В. methylicum поддерживали на агаризованных средах М9 (см. выше) с максимальным содержанием дсйтеро-ком- понентов.
Для приготовления питательных сред с различным содержанием СОзОО и D 2 O использовали соли марки «х. ч.», D 2О (99,9 % D ) и CD 3 OD (99,6 % О), получе нные из Всесоюзного центра «Изотоп» (Санкт-Пе тербург, РФ), а также L -лейцин ( Reanal , Венг рия). Для получения производных аминокислот использовали Н-диметиламинонафталин-5-сульфо- хлорид (дансилхлорид) ( Sigma , США) и диазометан. Для получения диазометана применяли N -нитрозо- метилмочевину, закупленную у Merck (Германия).
Посевной материал выращивали до ранней фазы экспоненциального роста бактериальной культуры на средах разного уровня дейтерирования, затем вносили в ферментационные среды с соответствую щим изотопным насыщением D 2 O и СОзО D (табли ца) в количестве 5 об. % и культивировали, как описано ниже.
Выращивание посевного материала и фермента цию проводили на синтетической среде М9 [13] с десятикратным избытком NH 4 C 1 (так как в предва-
Влияние изотопного состава питательной среды на величину лаг-фазы, выход биомассы и время генерации В. methylicum
Номер
опыта Компоненты среды, об. % Лаг-фаза, ч Выход биомассы, % от контрольного Время генерации, ч
Н 2 0 D 2 0 CHjOH CD 3 OD
1 98 0 2 0 24 100 2,2 2 98 0 0 2 30 92 2,4 3 73,5 24,5 2 0 32 90 2,4 4 73,5 24,5 0 2 35 86 2,6 5 49 49 2 0 40 70 3,0 6 49 49 0 2 44 60 3,2 7 24,5 73,5 2 0 46 56 3,5 8 24,5 73,5 0 2 49 47 3,8 9 0 98 2 0 60 33 4,4 10 0 98 0 2 64 30 4,8 Данные приведены для В. methylicum , не адаптированного к средам с высоким содержанием дейтерия.
рительных экспериментах по оптимизации состава питательных сред показано, что такое увеличение концентрации хлористого аммония в среде стимули рует биосинтез L -фенилаланина несмотря на неко торое увеличение продолжительности лаг-фазы) и L -лсйцином. После стериллизации рН доводили до величины 7,0— 7,2 при помощи NaOH . В качестве источника углерода использовали метанол (2 % от объема среды) или его дейтериймеченный аналог. Культивирование бактерий проводили при 37° в условиях интенсивной аэрации растущей культуры в колбах емкостью 750 мл с наполнением 100 — 150 мл среды. Морфологию клеток В. methylicum иссле довали с помощью поляризационно-интерфсрснци- онного микроскопа « Biolar » (Польша). Рост культу ры контролировали на спектрофотометре « Beckman DU 6» (США) при X 620 нм.
Все эксперименты по биосинтетическому включе нию дейтерия проводили параллельно с контроль ным (см. таблицу) на стандартной недейтерирован- ной среде.
Для каждого эксперимента по биосинтетическому введению дсйтериевой метки в В. methylicum клетки на ранней фазе экспоненциального роста осаждали центрифугированием (10000 мин" 1 , 5 мин). После отделения биомассы супернатант лиофилизовали. Сухой остаток супернатанта, содержащий фенила- ланин, переводили в метиловые эфиры N -дансил-производных аминокислот, как описано в работе [3]. ТСХ осуществляли на пластинках « Silufol » (Че- хо-Словакия) в системах: (А) — изопропанол-амми ак (7:3) и (Б) — хлороформ-метанол-ацетон (7:1:1). Количественное определение секретируемого фе- нилаланина производили методом ТСХ на пластин ках « Silufol » в системе (А). Образцы КЖ объемом 10 мкл наносили на пластинки. Элюирование прояв ленных нингидрином пятен фенилаланина проводи ли 0,5 %-ным раствором хлористого кадмия в 50 %- ном этаноле. Концентрацию аминокислоты опреде ляли спектрофотомстрически с использованием кри вой корреляции при X 540 нм.
Очистку метиловых эфиров N -дансил-производ ных аминокислот из КЖ, содержащей дейтерий, осуществляли с помощью колоночной (150 х 40 мм) хроматографии на силикагеле L 40/100 ( Chemapol , Чехо-Словакия) с градиентной элюцией системой хлороформ-метанол (от 0 до 10 % метанола).
Детекцию при ТСХ проводили 0,2 %-ным раство ром нингидрина в ацетоне. N -Дансильные производ ные аминокислот идентифицировали в системе (Б) по характерной флуоресценции в УФ-свете.
Аминокислоты идентифицировали сопоставлени ем их спектральных и хроматографичсских характе ристик с литературными данными [14], сравнением со стандартными аналогами, а также подтверждали данными масс-спсктрометричсского (МС) анализа их производных.
Масс-спектры электронного удара производных аминокислот измерены на приборе МВ-80 A ( Hitachi , Япония) при энергии ионизирующих электронов 70 эВ.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Как известно, большинство микроорганизмов, рас пространенных в природе, к которым относятся ме- тилотрофы, не могут служить хорошими продуцен тами ароматических аминокислот, вследствие нали чия эффективных механизмов регуляции биосинтеза этих соединений в микробной клетке, хотя эта спо собность появляется у ряда их мутантных форм [15 — 17]. Активными микробными продуцентами L -фснилаланина являются, как правило, мутанты, у которых снят негативный контроль со стороны таких ключевых ферментов биосинтеза этой аминокисл оты, как префенатдегидратаза (ПД) и дезоксиара- биногептулозофосфатсинтстаза (ДАГФ-синтетаза) [18, 19]. Определенный интерес в связи с этим представляет исследование способности продуциро вать L -фенилаланин лейцинзависимым метилотроф-ным мутантом В. methylicum , достаточно удобным, хотя и малоизученным объектом для биотехнологи ческого применения. Поэтому начальный этап биохи мических исследований В, methylicum был связан с получением ауксотрофных мутантов, для которых в большинстве случаях характерны ограниченный спектр мутантных фенотипов и кроме того довольно высо кий уровень реверсий [20 — 23]. Исходный лейцин- зависимый штамм В. methylicum , продуцент L -фени лаланина, был отобран в лаборатории генетики ме-тилотрофов НИИ генетики и селекции промышлен ных микроорганизмов на предыдущем этапе работы после обработки В. methylicum нитрозогуанидином по устойчивости к аналогу фенилаланина мета- фторфенилаланину (50мкг/мл.). Выделенные таким образом аналогорезистентные мутанты конвертиро вали метанол и накапливали при этом фенилаланин
в ферментационной среде. Сравнительные анализы аминокислоты методом тонкослойной хроматографии и масс-спектрометрии показали, что фенилаланин, секретиру- емый В. mcthylicum , полностью идентичен коммер ческому L -фенилаланину.
Мы изучали влияние степени замещенности дей терием низкомолекулярных субстратов воды и мета нола в составе питательных сред на рост полученного ауксотрофа, величину лаг-фазы и времени клеточ ной генерации (см. таблицу), а также секрецию дейтериймеченного фенилаланина. Продолжитель ность лаг-фазы, время генерации и максимальная секреция фенилаланина В. melhylicum в условиях изотопных экспериментов (см. таблицу, опыт 2, 4, 6, 8, 10) представлены на гистограмме (рис. 1).
Секреция
, г/л
Рис. 1. Характеристики бактериального роста В. methylicutn выход биомассы, время генерации и максимальная секреция фенилала нина) на средах с изотопным составом, соответствующим номерам экспериментов 2, 4, 6, 8, 10 в таблице
Как видно из представленных данных, в отсутст вие дейтериймеченных субстратов при росте исходной бактерии на протонированной среде продолжитель ность лаг-фазы не превышала 24 ч (см. таблицу, опыт 1). С увеличением содержания тяжёлой воды в среде продолжительность лаг-фазы увеличивалась до 64 ч на средах с 98 % D 2 O и 2 % CD 3 OD по объему (см. таблицу, опыт 10). Если замена метанола на его дейтерированный аналог не вызывала существенного ингибирования роста бактерий и не сказывалась на выходе микробной биомассы, то на средах с высоким содер жанием оксида дейтерия микробный рост был замет но подавлен. Вследствие этого в экспериментах, где оксид дейтерия преобладал в среде (см. таблицу, опыт 9, 10), выход биомассы был значительно ниже, чем в контрольных экспериментах и в тех случаях, когда использовали простую воду и дейтеро-метанол (см. таблицу, опыт 2).
Как видно, длительность времени генерации бактериальной культуры с уве личением изотопного насыщения среды дейтерием увеличивается. Из данных таблицы видно, что про должительность лаг-фазы и время клеточной гене рации бактерии при переходе со стандартной на дейтерирован ные среды находятся в определенной корреляции. Так например, в условиях эксперимента 10 продол жительность лаг-фазы увеличивается в 2,6 раза, а время генерации возрастает в 2,2 раза.
С целью увеличения эффективности изотопного мечения клеточных БАС и аминокислот и интенси фикации роста метилотрофа на полностью дейтери рованных средах мы адаптировали полученный му тант В. methylicum к максимальному содержанию дейтерия в среде культивирования. Для этого были проведены пять серий адаптационных пассажей на агаризованных средах (с 2 % С D 3ОО по объему) при ступенчатом увеличении концентрации оксида дей терия в них (см. таблицу). Последовательно отбира ли наиболее продуктивные по уровню накопления дейтерированной биомассы клоны В. methylicum и пересевали их на среды с большей степенью дейте рирования, вплоть до полной замены воды и мета нола на их дейтерированные аналоги (выживаемость на полностью дейтерированных средах не более 40 %). Полученный в результате ступенчатого отбора шта мм В. methylicum , адаптированный к дейтерию, пе реносили затем с максимально насыщенных дейте рием агаризованных сред на жидкие среды М9, приго товленные исключительно из 98 % D 2 O (99,9 % D ) и содержащие 2 % СОзО D , и культивировали, как описано в эксперименте.
Динамика роста бактерии В. m е thylicum , адаптированного к высокому содержанию дейтерия в среде, и способ ность секретировать L -фенилаланин в условиях мак симально насыщенных дейтерием сред представлены на рис. 2.
дО время, ч
Секреция
Рис. 2 . Динамика роста В. methylicum ( la , 10'а, 10 d ) и секреция фенилаланина (16, 10'б, 10 б) на средах с изотопным составом, соответствующим номерам эксперимента в таблице: I а,б — исходный метилотроф на стандартной среде М9; 10'а,б — адап тированный к высокому содержанию дейтерия В. melhylicum на полностью дейтерированной среде; 10 а,б — неадаптированный метилотроф на полностью дейтерированной среде
Выход биомассы, время генерации и максималь ная секреции фенилаланина исходным мутантом (10) и мутантом, адаптированным к высокому содер жанию дейтерия в среде (10'), на средах, максималь но насыщенных дейтерием, приведены в гистограм ме на рис. 3 относительно контрольного (У). Срав нивали ростовые данные адаптированного к дейте рию метилотрофа и секрецию фенилаланина (опыт 10') с исходным В. methylicum на стандартной среде М9 (опыт I ) и на полностью (98 % D 2О) дейтери рованных средах с 2 % CD 3 OD (опыт 10).
Как видно из графиков на рис. 2, степень заме щенности дейтерием воды и метанола не оказывает
м •
и биомассы, % 0тк0нтрол»н