Иммунологическая специфичность

Содержание 1. Иммун ологическая специфичность 3 2. Взаимодействие антигена с субпопуляцией антит ел 8 1. И ммунологическая специфичность Антитела, образуемые в ответ на введение в организм антигенов, специфически взаимодействуют с этими антигенами. Образование специфического комплекса антиген — ан титело обеспечивается гидрофобными, ионными и в андерваальсовыми взаим одействиями, а также вод ородными связями. Наиболее существенную роль иг рают силы гидрофобного взаимодействия. Неполярное связывание возникае т в результате стремления гидрофобных групп в водном растворе к ассоциа ции друг с другом, что сопровождается стабилизацией всей системы. Эффект ивность таких взаимодействий возрастает с повышением температуры. Меньший вклад в связывание антигена с активным центром антитела вносят водородные и ионные взаимодействия. Водородные связи о бразуются при взаимодействии атома водорода, ковалентно связанного с к аким-либо отрицательно заряженным атомом, с неподеленной парой электро нов другого отрицательно заряженного атома. В реакции антиген — антите ло в качестве таких групп обычно выступают аминогруппы и гидроксильные группы/ Электростатические силы возникают при взаимодействии сильно з аряженных ионизированных групп, таких, как ионизированная аминогруппа и ионизированная карбоксильная группа. Степень соответствия между антигенной детерминантой и антигенсвязыва ющей областью активного центра антитела иммун ологическая специфичность) определяется химической и пространственной комплементарностью, которая обусловлена, с одной стороны, взаимодействием элек тронных облаков реагирующих химических групп, с другой — стерическими силами отталкивания. Если структуры антигена и активного центра не соот ветствуют друг другу, то их притяжение будет слабым, а отталкивание силь ным. Важным моментом в образовании прочных специфических комплексов яв ляется наличие множественных контактов, позволяющих, несмотря на слабость отдельных единич ных взаимодействий, прочно удерживать антиген в активном центре. Замена отдельных атомов или групп в молекуле антигена или в антигенсвязывающи х центрах приводит к ухудшению связывания. Вполне понятно, что один и тот же антиген могут узнавать антитела, имеющи е комплементарные ему структуры, но несколько отличающиеся по составу а минокислотных остатков в антигенсвязывающем центре. Например, антиген связывающая область антидекстранового антитела человека в одном случа е представляет собой неглубокий «желобок», в который укладывается до 6 о статков изомальтозы, в другом — состоит из глубокой полости, куда помещ ается 1-2 остатка, и более мелкой выемки для 2-4 остатков изомальтозы. С другой стороны, антигенсвязывающий центр молекулы антитела определе нной специфичности обладает способностью связывать антигены, отличные по структуре от основного. Можно представить себе, что в таком случае в св язывании принимают участие как часть общих аминокислотных остатков в а нтигенсвязывающих центрах, так и отличающихся по своей локализации и пр ироде. С количественной стороны специфичность взаимодействия антиген— анти тело характеризуется через аффинность антител или равновесную константу образования иммунокомплекса. В простейшем случае взаимодействие одного центра с вязывания антитела с моновалентным антигеном может быть представлено схемой где Аг — свободный антиген; Ат — свободное анти тело; Аг-Ат— комплекс антиген — антитело; k – константы скоростей ассоциации и диссоциации комплекса с оответственно. С учетом закона действующих масс в условиях равновесия можно записать где — равновесные концентрации Аг, Ат и комплек са Аг-Ат, соответственно, или при переходе к конс танте равновесия или внутренней аффинности : Равновесная константа образования К а им мунокомплекса имеет размерность. На практике часто используют равнове сную константу диссоциации комплекса Kd, связанную с Ка простым соотношением и имеющую размерность. Очевидно, что чем меньше Kd , тем прочнее образующийся иммунокомплекс. Константа комплексообразования является термодинами ческим параметром, характеризующим изменение свободной энергии взаимо действия антиген — антитело AF , которое может быть рассчитано по следующей формуле: ' где R — газовая постоянная; Ф — абсолютная температура. Общее изменение свободной энергии при комплексообраз ова-нии складывается из двух термодинамических величин — ' изменений эн тальпии и энтропии: Определение АН можно провести экспериментально — либо с помощью прям ых калориметрических измерений, либо из зависимости равновесной конст анты комплексообразования от температуры, описываемой законом Вант-Го ффа: Д# р ассчитывают из температурной зависимости логарифма константы равнове сия от обратной температуры . Зная изменения энтальпии равновесного процесса АН и свободной энергии AF, при данной температуре изменен ие энтропии находят из соотношения Реакция антиген — антитело.протекает с выделен ием теплоты, но, как правило, изменение энтальпии невелико и составляет о коло 40 кДж/моль. Изменение энтропии в большинстве случаев положительно, т ак как активные центры антител в свободном виде доступны растворителю и гидратированы, а при взаимодействии с антигеном из них высвобождаются с вязанные молекулы воды, что приводит в целом к уменьшению упорядоченнос ти системы. Таким образом, говоря об иммунологической специфичности ант ител, мы всегда проводим сравнительную оценку эффективности взаимодей ствия антиген— антитело, которое характеризуется константой равновес ия или изменением свободной энергии системы при комплексообразовании. Можно оценивать как специфичность данного антитела по отношению к различным антигенам, так и данного антигена по отношению к р азличным системам. Если одна и та же популяция антител взаимодействует с двумя различными антигенами An и Аг 2 с константами комплексообразовании соответственно Кй и 2 , то говорят, что данные антитела являются высоко специфическими по отношению к Аг] и менее специфич ескими к Агг. Аналогично, если константа комплек сообразования антигена с популяцией антител Бфй много больше, чем с ант ителами Атг, то первые являются специфическими по отношению к антигену, а вторые нет. Еще раз подч еркнем, что понятие специфичности является отн осительным. Например, если для одной и той,же попу ляции антител взаимодействие с антигеном Аг] по сравнению с Аг 2 является специфическим, то при на личии третьего антигена Агз, для которого Ks^Ki, эти антитела будут менее специфич ны к Бг й , чем к Агз. На практике часто условно подразумевают, что есл и константа равновесия процесса комплексообразования больше, чем 10 8 л/моль, то антитела являютс я высокоаффинными. Обычный диапазон изменения аффинности антител составляет 10 5 — 10 й М -1 , что соответствует изменению свободной энергии связывания в области — 24-. — 52 кДж/моль. Максимальные значения констант связывания ха рактерны для антигенов, обладающих ярко выраженными гидрофобными свой ствами или же взаимодействующих с активным центром антитела достаточн о большой областью молекулы. Наименьшей эффективностью взаимодействия характеризуются антитела против углеводов. Таким образом, количественно специфичность можно оцен ить, измеряя изменение свободной энергии связывания или внутреннюю афф инность. В практических целях иногда очень важно провести сравнение спе цифичности взаимодействия ряда антигенов с антителами, индуцированным и одним из этих антигенов. Относительная специф ичность в этих случаях может быть выражена как о т ношение внутренних аф финностей взаимодействия с антителами рассматриваемого антигена и ант игена, индуцировавшего антитела. Подобного рода проблемы очень часто возникают, наприме р, при разработке методов иммуноферментного анализа лекарственных пре паратов, стероидных и белковых гормонов. В зависимости от способа получе ния антисыворотки антитела могут быть специфичны либо только к одному лекарственному пре парату, либо к целой группе близких по структуре химических соединений. В этих случаях распространен способ оценки специфичности, основанный на сравнении связывания антител в дан ной концентрации одного и того же количества го мологичного и гетероло гичного гап-тена. При этом концентрация образова вшегося иммунного комплекса для гомологичного гаптена принимается рав ной единице, а связывание всех гетерологичных гаптенов оценивается как доля от соответствующего связывания гомологичного гаптена. Представляет большой интерес и оценка специфичности различных популяц ий антител, например различных типов моиокло-нальных антител, продуциру емых разными клонами клеток. Такое сравнение может быть проведено на осн овании сопоставления значений внутренней аффинности: антитела с более высокой специфичностью характеризуются более высоким значением константы внутренней аффинности. 2. Вза имодействие антигена с субпопуляцией антител Ранее для количественного описания эффективности взаимодействия анти ген — антитело за основу была взята простая модель взаимодействия одно валентного антигена и одновалентного антитела. Но так как молекула анти тела имеет несколько антигенсвязывающих центров и, кроме того, способна взаимодействовать с несколькими антигенными детерминантами молекулы антигена, то такая характеристика образования иммуно-химического лекса является весьма упрощенной. Для описания более сложного реально существующего про цесса взаимодействия поливалентного антитела с поливалентным антиген ом введен термин авидность, или функциональная аффинность. В этом случае простые моновалентные взаимодейст вия характеризуются «внутренним сродством», или «внутренней аффинност ью». С биологической точки зрения именно функциональная аффинность игр ает основную роль в иммунном ответе на инфицирование организма вирусам и или бактериями, имеющими на своей поверхности повторяющиеся антигенн ые детерминанты. Процесс образования комплекса антиген — антитело состава 1:1, в котором р еализуются поливалентные взаимодействия, также является обратимым и м ожет быть охарактеризован константой комплекс ообразования. С энергетической точки зрения обр азование поливалентного комплекса намного выгоднее, чем моновалентног о. Например, было показано, что IgG -антитела с внутренней аффинностью к 2,4-динитрофенольно му гаптену 10 7 л/моль имею т функциональную аффинность по отношению к комплексу ДНФ — фаг 4-174— 10 10 л/моль, т. е. бивалентные вза имодействия являются в 1000 раз более прочными, чем моновалентные. Ранее полагалось, что присутствующие в системе антитела характеризуют ся одинаковой константой ассоциации с антигеном или же одинаковой энер гией связывания. В качестве такой субпопуляции может выступать субпопу ляция антител, продуцируемых одним клоном антителпродуцирующих клеток ,— моноклональные антитела. ', · Синтезируемые в живом организме антитела гетерогенны по физико-хими ческим свойствам. Общая популяция антител иммунной сыворотки включает в себя антитела с различными значениями изменения свободной энергии вз аимодействия с гаптеном, т. е. антитела различной аффинности; Схему взаим одействия- антигена с общей популяцией антител, представляющей совокуп ность субпопуляций, может быть представлена в следующем виде: ; Для общей характеристики такой популяции антит ел по аффинности взаимодействия с антигеном используют некоторое среднее значение аффинности Ко для л-го числа субпопуляций. Как правило, истинная форма рас пределения антител по значениям констаит взаимодействия неизвестна и обычно определяемая тем или иным способом равновесная константа взаим одействия является некоторым эффективным параметром. При разработке методов иммунохимического анализа, базирующихся на реа кции антиген — антитело, знание физико-химических характеристик специ фических взаимодействий очень важно, поскольку позволяет оценить чувс твительность и специфичность метода, осуществить правильный подбор ре агентов для анализа. Так как образуемые в ответ на введение в организм антитела являются гете рогенными по константам связывания, средняя аффинность Ко — это, в действительности, некот орое среднее значение для неизвестного распределения частных констант Ki , где число з — неизвестно. Для характеристики получаемой антисыворотки. целесообр азно ввести некоторую функцию распределения антител по аффинности. Про стейшее приближение — нормальное распределение, описываемое функцией Гаусса: Графическое представление функции Гаусса где стандартное отклонение характеризует гетерогенность антител. В иммунохимии распределение антител по константам час то описывают одним из приближений нормального распределения, предложе нного Сипсом. Приближение Сипса отклоняется от нормального при /Со± or , и значительные отк лонения наблюдаются при Кп±2у. Широкое распространение этой функции для описания рас пределения антител по константам связывания обусловлено его сходством с обычно используемыми простыми методами обработки результатов иммун охимических равновесий. Функция Сипса применительно к взаимодействию антигена с антителом валентности з позволяет получить соотношение где AO — средняя аффинность; а — индекс гетерогенности. Распределение Сипса является симметричным и унимодал ьным и может быть полностью охарактеризовано средней константой аффин ности Ко и индексом гете рогенности «а». Произво льное предположение о симметричном распределении антител по аффинност и имеет свои ограничения. Истинная форма распределения остается неизве стной. Часто все же на практике используют распределение Сипса для описа ния гетерогенной популяции антител. В действительности распределение антител по К бывает неси мметричным и мультимодальным, поэтому, строго говоря, распределение ант ител по аффинности нельзя аппроксимировать распределением Сипса. В частности, например, описаны распределения, сильно смещенные в сторону антител с низкой аффинностью. Вследствие этого представление всей попу ляции антител как популяции, взаимодействующей с одной средней аффинно стью или даже как бимодальной, не всегда точно отражает распределение ан тител по аффинности. В предположении об отсутствии внутри- и межмолекулярных взаимодействи й Муккур с сотрудниками ввели понятие об общей к онстанте аффинности Ки представляющей собой су мму произведений равновесных констант каждой из m с убпопуляций антител на множители, учитывающие концентрационный вклад каждой из фракций в общей популяции антител: > т.е. общая константа аффинности для гетерогенной популяции является сре дневесовым параметром и представляет собой сумму средневесовых аффинн остей яг-субпопуляций в реакционной смеси. Концентрацию антигена, связа нного в комплексы с антителами, можно представить в виде Можно показать, что предельное значение функции Q , являющейся формальным выражением для константы равновесия, при концентрации в системе, а графически зависимость IgQ от имеет вид кривой с отрица тельным наклоном. Экстраполируя экспериментальную зависимость IgQ от к нулевой концентр ации =0, можно получить предельное значение Q , равное Kt .