Вход

Получение моноклональных антител

Курсовая работа по биологии
Дата добавления: 15 сентября 2002
Язык курсовой: Русский
Word, rtf, 176 кб
Курсовую можно скачать бесплатно
Скачать
Не подходит данная работа?
Вы можете заказать написание любой учебной работы на любую тему.
Заказать новую работу
Введение Для многих иссл едований , связанных с изучением биологич е ских структур большую ценность представляют р еагенты , способных специфически взаимодействовать с данной структурой . Универсальным реагентом , обладающим указанным свойством , считается моле кула иммуноглобулина . Несмотря на то , что иммуноглобулины , являясь а нтителами , вза имодействуют только с антигеном , то есть с молекулой способной вызвать иммунный ответ , для большинства структур удается подобрать условия , при которых они становятся антиг енами и индуцируют выработку комплиментарных антител (например , при ко н ъюгации с сильными иммуногенами ). Именно этим объясняе тся большое распространение иммунологических мет одов , связанных с использованием антител , в различных областях биологии и медицины. Серьезную проблему при применении антисывороток для идентификац ии и ко личественного определения антигено в в различных областях исследований представл яет неспецифическое связывание и перекрестная реактивность антител. История создания метода Многие исследователи пытались отыскать сп особы получения антител с узкой специфично стью . Так , при определенных условиях и ммунизации бактериальными полисахаридами удается получить высокогомогенный аппарат антител с узкой специфичностью . Кроме того , возможно сли яние плазмацитомы (опухоли , возникшей из антит елообразующей клетки или ее пред ш ественника ) с клетками селезенки иммунизированног о животного , получив таким образом гибридные клетки (гибридомы ), унаследовавшие от опухолев ых клеток способность неограниченно размножаться , а от клеток селезенки – синтезировать антитела предопределенной с п ецифично сти. Предпосылками для возникновения метода по лучения гибридом , синтезирующих моноклональные ан титела , были разработки двух методологических подходов : 1) получение ми елом , адаптация их к условиям культивирования вне организма ; 2) метод сомати ческ ой гибридизации клеток. У мышей довольно легко получить миеломы (плазмацитомы ). Эти опухоли являются потомками одной кл етки (то есть имеют моноклональное происхожде ние ) и секретируют уникальные иммуноглобулины , некоторые из которых могут взаимодействовать с известными антигенами . Опухоли индуциру ют у животных путем внутрибрюшинного введения минеральных масел или инертного твердого пластика . Для возникновения миелом большое значение имеет генетический статус животного , и только у двух линий инбредных мышей э кспериментаторам удалось получить та кие опухоли. Миеломные клетки мыши оказались чрезвычай но удобными для изучения биохимии продукции иммуноглобулинов и дали очень многое для понимания структуры , механизмов секреции и их функции . Однако , миеломная система как источник антител к большинству антигенов не оправдала надежды исследователей – н е удавалось иммунизировать животных , а затем получить мышиные миеломы , продуцирующие анти тела к иммунизирующие антигену . Из тысяч м иеломных опухолей , индуцированных у мыше й , лишь единичные вырабатывали иммуноглобулин ы , которые реагировали с известными антигенам и , что было обнаружено путем грубого скрин ирования с множеством потенциальных антигенов . Таким образом , миеломные белки оказывались с неизвестной антигенной специфичн о ст ью. Другой предпосылкой возникновения метода получения гибридом явилась техника гибридизации соматических клеток , разработка которых широ ко проводилась после открытия феномена спонта нной гибридизации . При слиянии плазматических мембран клеток образуются клетки с двум я или большим числом ядер – гетерокарион ы . После первого деления ядра сливаются и образуется одно ядро с набором хромосом от всех слившихся партнеров – образуетс я гибридная клетка . Низкую частоту образовани я гибридов можно было увеличить , исп о льзовав ряд агентов , вызывающих слияние : вирус Сендай , лизолецитин , полиэтиленгликоль . Даже при использовании агентов , повышающи х слияние , частота образующихся гибридов край не низка . Для их выделения необходимы селе ктивные среды , позволяющие расти преимущ е ственно образовавшимся гибридам . В настоящее время разработано несколько принципов селекции гибридных клеток . Одним из наиболее распрос траненных является метод , основанный на приме нении системы , содержащей гипоксантин , амидоптерин и тимидин (система ГАТ ). Селекция гибридных клеток основана на том , что в ГАТ среде родительские миело мные клетки погибают , а нормальные клетки селезенки не обладают способностью расти при данных условиях культивирования , так что выживают и размножаются только гибридные клет ки , у наследовавшие от родительских клеток способность размножаться и синтезировать спе цифические иммуноглобулины. Подготовительные этапы перед проведением слияния Полностью процедура получения моноклональных антител включает в себя следующие этапы : я иммуниз аци я животных ; я подготовка кле ток к слиянию ; я слияние ; я отбор индуциру ющих специфические антитела клонов ; я клонирование и реклонирование ; я массовая нараб отка гибридомных клеток ; я получение куль туральной жидкости или асцита , содержащих ант итела ; я выделение анти тел. Обычно вся проц едура от момента начала иммунизации до вы деления антител занимает 3-4 месяца. Организация работы и оборудован ие . Для работы по получению гибридом желательно выделить отдельное помещение . Эксперимент можно проводить и в ча сти большой комнаты , максимально удаленной от входной двери . Это помещение надо оснасти ть следующим оборудованием : 1. Ламинарный бокс с вертикальной или горизонтальной подачей стерильного воздуха . Стерильность обеспечивается наличием фильтров , задержи вающих частицы крупнее 0,3 мкм. 2. Инкубатор , в котором автоматически поддерживается влажность , температура и концентрация СО 2 . 3. Низкоскоростная центрифуга с подвесными стаканами , желательн о с охлаждением. 4. Обычный и инвертированный микроскопы с фаз ово-констра стным устройством. 5. Холодильник на +4 и на – 20 0 С. 6. Водяная баня на +37 и +56 0 С. Помимо это го в отдельном помещении желательно иметь морозильник на – 70 0 С и сосуд Дьюара с жидким азотом дл я хранения клеток . Для получения гибридом нужно пр иобрести также специальную пласти ковую посуду для культуры клеток : 96-луночные планшеты с плоским дном , 24-луночные планшеты , флаконы с площадью роста 25, 75 см 2 и др ., пластиковую посуд у для проведения иммуноферментного и радиоимм унологического анализов , среды для культивир ования , необходимые реактивы , сыворотку плода коровы (СПК ). Приготовление отдельных компонентов сред для культивирования . Основ ными средами , употребляемыми для получения ги бридом , являются среда RPMI 1640 и среда Игла в модификации Дуль бекко . Применяются и другие среды , в частности , среда Дульбек ко в модификации Иксова . Среды выпускаются в виде готовых растворов , 10-кратных концентр атов и сухих порошков . Лучшие результаты п олучаются при приготовлении сред в условиях лаборатории из сухих порошков , од нако при этом важное значение имеет качес тво воды . Для приготовления сред необходима деионизированная и дважды перегнанная в кв арцевой посуде вода. Выбор экспериментального животного . Обычно для иммунизации использ уют мышей и крыс . Это связано с тем , что подходящие миеломные клетки мышей и крыс широко распространены и , кроме э того , не представляет сложностей выращивание полученных гибридом в организме этих животных . Другие животных практически не используют ся. При иммунизации животных иммунный о твет вырабатывается на все антигенные детерми нанты всех компонентов вводимого материала . Э то значительно осложняет отбор клонов , продуц ирующих антитела к интересующей антигенной де терминанте , так как их доля может быть крайне незначительной . Поэтому по в о зможности для иммунизации применяют очище нные антигены , по крайней мере на последни х этапах иммунизации . Одним из основных до стоинств гибридомной техники и является как раз то обстоятельство , что специфические антитела против данного антигена можно получи т ь , взяв для иммунизации неочищенн ый препарат антигена , и употребив впоследстви и эти антитела для очистки антигена. Способы иммунизации . Назначение процесса иммунизации состоит в том , чтобы увеличить долю клеток , продуци рующих антитела заданной специфичност и , и перевести эти клетки в функциональное со стояние , при котором они способны сливаться и образовывать антителообразующие гибридные кл етки . Экспериментально установлено , что для ги бридизации необходимы выделять селезеночные клет ки животных через 3-4 суто к после последнего введения антигена , то есть тогда , когда в лимфоидных органах много активно пролиферирующих клеток. Конкретная схема иммунизации сильно завис ит от природы антигена и его иммуногеннос ти . Антигены клеточной поверхности являются с ильными имму ногенами , тогда как большинст во растворимых белков – слабые иммуногены . В последнем случае необходимо применять ра зличные адъюванты , усиливающие иммунный ответ . Среди адъювантов наибольшее распространение полу чил полный адъювант Фрейнда (ПАФ ). Помимо э тог о , используют введение антигена , п реципитированного на квасцах , и введение вмес те с антигеном убитых клеток Bordetella Pertussis . Обычно антиген вводят неоднократно , что необходимо для развития сильного иммунного ответа , хотя чрезмерная иммунизация может и м еть обратный эффект – отмечено , что иногда у клеток гипериммунизированных животн ых снижается способность образовывать гибридомы . В некоторых случаях бывает достаточно и одной иммунизации. По ходу иммунизации необходимо определять титр антител к антигену ( титр антит ел – величина , обратная разведению сыворотки , при которой степень иммунологической реакци и снижается в два раза по сравнению с максимальной ). Обычно это делают перед по следней иммунизацией . В опыт набирают животны х с высоким титром антител . Не с л едует ожидать хороших результатов гибриди зации , если при иммунизации животных нет о бразования антител или они образуются в н изком титре . Для большинства растворимых антигенов мож но использовать следующую схему иммунизации. 1. Вводят 1-100 мкг антигена в ПАФ или в виде преци питата на квасцах внутрибрюшинно . Если есть возможность , то одновременно вводят 2*10 9 убитых клеток B. Pertussis . 2. Через 2-3 недел и вводят антиген на физиологическом растворе внутрибрюшинно или внутривенно . Эту процедур у можно повтор ять до появления высоко го титра антител. 3. Последнюю им мунизацию делают внутривенно , через 3 суток жив отные забиваются , и готовится суспензия клето к для гибридизации. При примен ении в качестве иммуногена различных клеток (опухолевые клетки , чужеродные кл етки крови , бактерии , паразиты и т.д .) делают нес колько инъекций без адъюванта внутрибрюшинно с интервалом в 2-3 недели по (1-5)*10 7 клеток . Последнюю инъекцию делают внутривенно и через 3 дня выделяют клетки селезенки для гибридизации. В последнее время а ктивно развива ются методы полной иммунизации вне организма с целью получения гибридомы . Иммунизация in vitro имеет ряд су щественных преимуществ : a) укорачивается период иммунизации до 4-5 суток ; b) требуется с ущественно меньшее количество антигена ; c) ко многим антигенам можно получить более выраженный иммунный ответ (частично за счет снижения вклада толерантности и супрессии ); d) повышается процент отвечающих клеток ; e) легко прове рять факторы , влияющие на эффективность иммун изации. Современные метод ы иммунизации in vitro основаны на двух системах культ ивирования лимфоцитов , разработанных в конце 1960-х годов . Метод суспензионного культивирования был первым методом , в котором иммунизация полностью проходила вне организма . Критическими факторами в данн ом методе были н изкая концентрация кислорода в атмосфере (7%), вы сокая плотность клеток , легкое покачивание ку льтуры , ежедневное добавление свежей среды и выбор подходящей партии СПК и антигена (использовали эритроциты барана ). Другой основной системой имм унизации in vitro является мет од Д . Марбрука . Клетки культивируют в мале нькой камере на диализной мембране , через которую идет обмен средой из большого рез ервуара. Одним из основных недостатков иммунизации in vitro является дол я IgM-образующих клонов . Это связано с тем , что при иммунизации in vivo клетки берут во время вторично го иммунного ответа , при котором образуются в основном антитела IgG класса , тогда как in vitro реакция идет по первичному типу , для которого характерна продукция IgM антител . Эта проб лема може т быть преодолена после отработки способов получения вторичного иммунного ответа in vitro . Слияние Существуют два основных варианта добавления ПЭГ , используемых в настоящее время . Первый метода заключаетс я в следующем . В течение 1 мин добавляют 1 мл 50% раствора ПЭГ при 37 0 С с постоянным перемешив анием . Затем раствор постепенно разбавляют до 10 мл в течение нескольких минут средой без сыворотки , после чего клетки центрифуги руют и ресуспендируют в среде культивировани я. Во втором методе использу ют более длительную обработку клеток раствором ПЭГ . К осадку клеток добавляется 30-35% ПЭГ при комнатной температуре . Клетки центрифугируют 2 мин , затем их оставляют при комнатной темпера туре еще на 5-7 мин . Затем их разводят в большом объеме среды с сыво р откой , обмывают и культивируют. Клонирование гибридомных клеток Клонирование осуществляется для выделения стабильных клонов гибридомных клеток . Для н едавно образованных гибридомных клеток характерн а высокая нестабильность , связанная с утратой хромосом . При культивировании могут поя вляться клетки , потерявшие способность продуциров ать антитела и они могут перерастать анти телообразующие гибридные клетки. К основным методам клонирования клеток относятся клонирование методом лимитирующих ра зведений , клонирова ние в полужидком агаре и клонирование с помощью прибора – проточного цитофлуориметра. Клонирование методом лимитирующих разведений . Если клетки посеяны в 96-луночные планшеты очень редко , то до ля лунок , в которой наблюдается рост клето к , подчиняется распре делению Пуассона : где f (0) – фракция лунок , в которых отсутствует рост ; – среднее число кл еток на лунку. При = 1 f (0) = 0,37. Для того , ч тобы получить разумную вероятность только одн ого клона в лунке , в более 37% лунок не должно наблюдаться роста клеток . Поскольку эффективность клонирования редко бывает равной 100%, клетки необходимо засеват ь при плотно сти 10, 3 и 0,5 клеток на лунку . В тех планше тах , на которых наблюдается рост в половин е лунок , содержатся изолированные клоны. При первом клонировании активной может оказаться только небольшая часть клонов . Не обходимо всегда производить повтор ное кло нирование , при котором доля положительных кло нов будет возрастать. Для клонирования надо применять клетки питающего слоя . Используются те же виды клеток , что и для начального роста гибр идом. Клонирование в полужидком агар-а гаре . Для клонирования гиб ри дом можно применять полужидкий агар . Обычно берется система , состоящая из двух слоев . Нижний (твердый ) слой содержит 0,5% агар-агара в среде культивирования . Ему дают затвердеть . Затем добавляют второй слой – мягкий , содержащий 0,3% агар-агара , в которы й вк лючаются клонируемые клетки . При использовании клеток питающего слоя их засевают в ча шку Петри до заливки агар-агара , и среду культивирования удаляют непосредственно перед добавлением нижнего слоя агара. Колонии становятся видимыми через 7-14 суток , их переносят на жидкую культуру . Клонирование с помощью проточно го цитофлуориметра . Приготавливают ф луоресцентные микрошарики из латекса и покрыв ают их антигеном . Такие шарики адсорбируются на антигенспецифических гибридомных клетках , что позволяет выделять их на этом п риборе. После выделения тем или иным способом положительных клонов , клетки этих клонов размножают в достаточном количестве и образцы их замораживаются. Массовая наработка моноклональных антител После отбора гибридомных клеток , синтезир ующих и нтересующие исследователя антитела , можно приступить к их массовому наращивани ю с целью получения больших количеств мон оклональных антител . В начале культивирования гибридомные клетки могут расти медленно и плохо переносить низкую плотность посева . В связ и с этим при пересеве к леток их надо разводить не более чем в 3-5 раз . Ускорению роста клеток может спосо бствовать добавление клеток питающего слоя . Г ибридомные клетки необходимо поддерживать в л огарифмической фазе роста и избегать повышени я концентрации к л еток выше 0,5 млн /мл . Клетки можно культивировать как в с тационарной культуре , так и в роллерной , а также в различного рода культиваторах (фе рментерах ). Для получения максимальной продукции моно клональных антител клеткам позволяют расти до предельной плотн ости . В такой культур е через определенное время наблюдается гибель гибридомных клеток . Надосадочная жидкость со бирается , а клеточный осадок отбрасывается , то есть не пытаются культивировать дальше о ставшиеся живые клетки. Для получения больших количеств ан тител вводят гибридомные живые клетки в организм животных и получают от них асцитную жидкость . Предварительно животным в водят агенты , повышающие способность гибридом расти в брюшной полости . В качестве таког о агента чаще всего выступает пристан – 0,5 мл з а 10-14 суток до введения клеток. Очистка антител Для многи х целей не требуется очистка антител , и они используются в виде культуральных жидк остей или асцитных жидкостей . Грубую иммуногл обулиновую фракцию можно получить высаливанием белков сульфатом аммон ия с последующим диализом . Если антитела необходимо выделить в чистом виде , то предварительно определя ют их класс и подкласс , так как способ ы очистки различаются для антител разных классов . Это можно сделать с помощью метод а иммунодиффузии по Ухтерлони . В ыделение чистых антител лучше вс его проводить на иммуносорбентах . При этом методе , однако , есть опасность , что при ф иксации изменяется антигенная структура клеточно й поверхности . Если не удается выделить антитела пря мым способом , то получают иммуноглобули но вую фракцию с помощью различных методов а ффинной и ионообменной хроматографии на сефар озес пришитым ковалентно белком А. Заключение Одна из задач клеточной инженерии сос тоит в создании клеточных систем с новыми свойствами на основе клеточных взаимодейс твий . В настоящее время совершенствуются методы иммунизации вне организма и изуча ются механизмы активации В-лимфоцитов . Это осо бенно важно для получения моноклональных анти тел человека . Одним из условий дальнейших успехов н а пути получения клеток и клеточ ных систем с новыми свойствами является углубл ение знаний , касающихся фундаментальных основ биологии : механизмов регуляции процесса клеточной дифференциации , физиологии протопластов как объекта биологической трансформации клеток , взаим оотношений клеточных органелл . Следователь но , прогресс в развитии клеточной инженерии будет в значительной степени определяться успехами в области клеточной биологии и к леточной физиологии .
© Рефератбанк, 2002 - 2017