Вход

Свечение сопровождающее биологические реакции

Реферат по биологии
Дата добавления: 03 февраля 2004
Язык реферата: Русский
Word, rtf, 220 кб
Реферат можно скачать бесплатно
Скачать
Данная работа не подходит - план Б:
Создаете заказ
Выбираете исполнителя
Готовый результат
Исполнители предлагают свои условия
Автор работает
Заказать
Не подходит данная работа?
Вы можете заказать написание любой учебной работы на любую тему.
Заказать новую работу
Энергично проте кающие химические реакции сопровождаются , как правило , выделением энергии в форме тепла ; существуют , однако такие реакции , кот орые сопровождаются излучением света . Свечение , сопровождающее химические реакции , называется хемилюминесценцией (ХЛ ) . Хемилюминесценция (ХЛ ) - свечение , сопровождающее химически е реакции . Она наблюдается в том случае , если в реакции происходит выделение большо го количества энергии , например в реакции взаимодействия двух радикалов или в реакциях с участием перекисей . В последнее время все больший интерес привлекает собс т венное ("сверхслабое ") свечение клеток и тканей животных и человека , которое обуслов лено реакциями свободных радикалов : радикалов липидов и кислорода , а также окиси азота , - соединениями , играющими огромную роль в жизни организма , а при определенных услов и ях - и развитии ряда патологическ их состояний . Молекулярный механ изм хемилюминесценции В настоящее время известно довольно много химических реакций , сопровождающих ся свечением . В большинстве случаев - это д овольно сложные процессы со многими промежуто чны ми стадиями . Но есть несколько прос тых случаев , в которых механизм превращения энергии химической реакции в свет вполне понятен . Один из них - это свечение , наблюдаемое при взаимодействии органических радикалов , п олучаемых электрохимическим пут ем . В раст вор люминесцирующего органического вещества (в опытах брали полициклические углеводороды ) в органическом электролите (проводящем электричество ) опускали пару электродов , с помощью кото рых через раствор пропускали электрический то к . Рис . 2. Хемилюминесценция при рек омбинации катион - и анион-радикалов полициклически х углеводородов . 1 - Между электродами , опущенными в раствор органического электролита , прик ладывают разность потенциалов . С катода электроны захватываются молекулами и образуютс я анион-радикалы . На аноде электроны отрываютс я от молекул и образуются катион-радикалы .2 - 5 - При взаимодействии катион-радикала и анион-радик ала в результате их столк н овения (2) электрон переходит с катион-радикала на анион-радикал (3). Однако при этом есть вероятнос ть того , что он окажется не на самом нижнем электронном уровне , а на более в ысоком . Образуется возбужденная молекула углеводо рода (красный кружок на схеме 4 ). При переходе электрона на более низкий у ровень происходит высвечивание кванта света (5). Схема электронных уровней в радикалах и молекулах продуктов реакции дана на рис . 3. С катода (-) на молекулы люми несцирующего вещества (обозначим их как НА ) перехо дят электроны и образуются анио н -радикалы (заряженные отрицательно ). На аноде (+) электроны отнимаются от молек ул и образуются катион -радикалы (заряженные положительно , см . рис . 2, вверху ). Если теперь раствор перемеш ать , катион-радикалы будут взаимодейств овать с анион-радикалами (рис . 2, внизу ); при этом образуется две молекулы исходного углеводорода , одна из которых может оказаться в элек тронно-возбужденном состоянии и переходит в о сновное состояние с испусканием кванта света ( фотона ) . На рис. 3 показаны верхние электронны е энергетические уровни в реагирующих радикал ах и продуктах их взаимодействия . В молеку лах на верхнем заполненном электронном уровне электроны расположены попарно (рис . 3, 1). У ка тион-радикала на верхнем уровне остается толь к о один , неспаренный электрон . У анион радикала появляется неспаренный электрон на следующем (расположенном выше ) энергетичес ком уровне (рис . 3, 2). Рис . 3. Схема электронных энергетических уровней участни ков реакции взаимодействия катион-радикала и анион-радикала одного и того же вещества. 1 - исходная молекула ; 2 - анион-радикал ; 3 - катион-радикал ; 4 - перенос электрона с анион-радикала на кати он-радикал ; 5 - пе р енос электрона в э лектронно-возбужденной молекуле продукта реакции , который сопровождается высвечиванием кванта свет а хемилюминесценции . При взаимодействии радикалов (и меющих противоположный заряд и потому притяги вающихся друг к другу ) произойти перенос э лектрона может произойти таким образом , что два электрона окажутся на разных у ровнях (рис . 3, 4). Последнее означает , что один из ее внешних электронов оказывается не н а самом нижнем свободном электронном уровне , как у исходных молекул , а на вышележа щем э л ектронном уровне . Такая моле кула при переходе в основное состояние ис пускает квант света (рис . 3, 5). Мы видим , что весь процесс можно разделить на три стадии : 1. Восстановление одного из участ ников реакции (присоединение электрона ) и окис ление второго ( отрыв электрона ). Это прив одит к запасанию химической энергии в сис теме , которая позднее выделится в виде фот она . 2. Перенос электрона (оки слительно-восстановительная реакция ) не на самый нижний , а на один из более высоких энергетических уровней и образов ание таки м образом продукта реакции в электронно-возбу жденном состоянии . 3. Высвечивание фотона п ри переходе молекулы из электронно-возбужденного в основное состояние (люминесценция ). Обычно химические реакции , сопровождающиеся свечением , протекают через целый ряд промежуточных стадий , но основные этапы запасания и в ысвечивания энергии в общем сходны . Отечественный ученый А . Г . Гурвич был первым , кто указал на с уществование собственного слабого свечения клето к животных и растений , названного им "митоген етическими лучами " . Согласно А . Г . Гурвичу , митогене тические лучи - это очень слабое ультрафиолето вое излучение клеток , которое индуцирует деле ние окружающих клеток . Хотя сам А . Г . Г урвич использовал для обнаружения лучей тольк о "биологический детектор ", т . е . разные делящиеся клетки , его последователи в Росси и (С . Родионов и Г . М . Франк , 1934г .) и за рубежом (R. Aubert, 1938 и другие ) разработали физ ический детектор излучения : газоразрядный счетчик фотонов с кварцевым окном , прозрачным для УФ-лучей . В настояще время слабое св ечение удается изучать не только с раство рах или суспензиях клеток , но и на цел ых органах в составе организма например , п ечени или легкого . Таким способом было показано , что собственное свечение тканей могут быть ответственны три типа реакций : 1) Реакции так называемых активны х форм кислорода. 2) Реакции цепного (перек исного ) окисления липидов . 3) Реакции с участием окиси а зота . В последнее время все больший интерес привлекает соб ственное ("сверхслабое ") свечение клеток и ткан ей животных и человека , которое обусло влено реакциями свободных радикалов : радикалов липидов и кислорода , а также окиси азот а , - соединениями , играющими огромную роль в жизни организма , а при определенных условия х - и развитии ряда патологических состояни й . Почему оно "све рхслабое ", это свечение клеток и тканей ? Чем же объясняется низкая интенсивность хемилюминесценции , сопровождающей реакц ии свободных радикалов ? Причин целых три . Во-пер вых, сама концентрация радикалов в биологических системах очень мала из-за их высокой химической активности , поэт ому малы и скорости реакций , сопровождающихся свечением . Во-вторых, не всякое химическое взаимодействие ра дикалов непременно приводит к образованию эле ктронно-возбужденных молекул продуктов реакции , к ак это изображено на рис . 3 (4). Напротив , в подавляющем большинстве окислительно-восстановит ельных взаимодействий между молекулами или ра дикалами электрон переносится не на уровень возбужденного состояния , я на самый нижни й свободный уровень , и последующ е г о высвечивания кванта не происходит . В третьих, даже есл и и образовалась возбужденная молекула продук та , вероятность того , что высветится квант , а не произойдет растраты энергии в тепло , тоже обычно очень мала . Две последн ие причины приводят к тому , что кван товый выход хемилюминесценции в случае , скаже м , реакции двух перекисных радикалов составля ет всего 10 -8 -10 -10 . Это происходит потому , что кванто вый выход образования возбужденных молекул пр одукта равен всего 10 -4 -10 -5 , а квантовый выход л юминесценции продукта составляет для кетонов , образу ющихся при взаимодействии перекисных радика лов , в свою очередь , тоже около 10 -4 - 10 - 5 . Вот и в ыходит , что общий квантовый выход хемилюминес ценции составляет всего-навсего 10 -8 -10 -10 . Применение собствен ной (неактивированной ) хемилюминесценции. Почти сразу после того , как появи лись первые работы по собственной хем илюминесценции клеток и тканей , были сделаны попытки использовать этот показатель в целях клинической диагностики . По понятным причинам первыми объектами были цельная кровь и плазма крови больных людей . Поскольку собств енно е свечение было очень слабым и измерять его было трудно , было сделано много поп ыток усилить это свечение : к плазме крови добавляли красители , перекись водорода , ионы двухвалентного железа и т.д . [4]. Природа хим ических реакций , обусловливающих свечени е , была понятна далеко не всегда , но авторов предложений это не слишком беспоко ило : лишь бы была разница между больными и здоровыми , а еще лучше между разным и группами больных . Скорее удивительно , что при ряде патологий разница была довольно существенной . П ожалуй , наибольшее числ о публикаций в литературе посвящено свечению плазмы крови , к которой для инициирования цепного окисления липидов добавляли соли двухвалентного железа . Амплитуда сигнала хемилю минесценции хорошо коррелировала с количеством продуктов п ерекисного окисления липи дов , определяемых химическим методом , и зависе ла от липидного состава плазмы крови и концентрации в ней антиоксидантов , то есть веществ , тормозящих процессы , идущие с уч астием свободных радикалов . Во многих случая х данные таких ана лизов были признаны ценными в качестве дополнительных при по становке врачом диагноза заболевания , контроля за эффективностью лечения и прогноза течен ия болезни . Все же измерение неактивированной хемилюминесценции в широкую клиническую прак тику пока не во ш ло в отличие от хемилюминесценции в присутствии активатор ов. В присутств ии определенных соединений , обычно называемых в отечественной литературе "активаторами ", свечени е клеток и тканей может быть усилено на несколько порядков величины . Наибольшее ра спрос транение получило измерение хемилюминес ценции , связанной с выделением клетками актив ных форм кислорода (к которым относятся су пероксид , гидроксильный радикал , перекись водорода и гипохлорит ): хемилюминесценция наблюдается в присутствии активаторов люминол а и люцигенина . Активированная хемилюминесценция до вольно широко применяется в клиническом биохи мическом анализе . Активированная х емилюминесценция Собственная хемилюминесценция , сопровождающая биохимические ре акции в клетках и тканях , обладает , как пр авило , очень низкой интенсивностью и не случайно получила название "сверхслабого свечения " . Это оказалось главным и пока не преодоленным препятствием на пути к широкому использованию собственной хемилюминесценции в аналитических целях. Значительное рас пространени е получило однако измерение хемилюминесценции в присутствии определенных соединений , получивш их в отечественной литературе общее название "активаторов ", а за рубежом - "усилителей " (enhancer) хемилюминесценции . По механизму действия актив аторы р аспадаются на две четко различающиеся группы , которые можно соответственн о назвать химическими и физическими активатор ами . Химические активаторы ХЛ - это соединения , вступающие в реакции с активными формами кислорода или органическими свободными радика лами , в ходе которых образуются молекулы продуктов в возбужденном электронном состоянии. Наблюдаемое при этом hemilum связано с переходом молекул в основное состояние ., что приводит к вы свечиванию фотонов : Активатор + радикал ы ® продукт * ® продукт + ф отон Хорошо известными представителям и таких активаторов могут служить люминол (3-аминофталевый гидразид , см . Рис . 4) и люциг енин [Бис (N-метилакридиний )] Физич еские активаторы не вступают в химические реакции и не влияют на ход реакций , сопровождающихся he milumм , но тем не менее многократно усиливают интенсивность хемилюминес ценции . В основе их действия лежит физичес кий процесс процесса переноса ( миграции ) энер гии с молекулы продукта хеми люминесцентной реакции на активатор : Радикалы ® продукт * ® продукт + ф отон 1 (неактивированная ХЛ ) Продукт * + активатор ® продукт + активатор * ® фотон 2 (активированная ХЛ ) Хемилюминесцентный иммунный анализ По идеологии хемилюминесцентный иммунный анализ не отличается от радиоиммунно го , с той только разницей , что вместо радиоактивно-меченных субстратов или антите л используются субстраты и антитела ,"меченные " соединением , которое вступает в реакции , сопровождающиеся хемилюминесценцией , в присутствии перекиси водорода и катализатора (обычно эт о фермент пероксидаза ). Хем илюминесцентной меткой ( ХЛ -меткой ) ча ще всего служат низкомолекулярные соединения , по химической структуре близкие люминолу и люцигенину , такие как изолюминол , сукцинилирова нный люминол , эфиры акридиния и другие . Пр исоединение хемилюминесцентной метки прои зво дится либо к антигену , т . е . низкомолекуляр ному соединению либо к антителу на этот антиген . В первом случае метод называется CIA (Chemiluminescent Immuno Assay), во втором - ICMA (ImmunoChemiluminoMetric Assay). По русски это соответствовало бы ХИА (Хе м илюминес центный Иммунный Анализ ) и ИХМА (Иммуно-Хемилюм иноМетрический Анализ ). Оба метода направлены на определение биологически-важных низкомолекулярных соединений (н апример , гормонов ) в тех концентрациях (как правило , очень низких ), в которых они вст р ечаются в биологических объектах . При использовании метода CIA к раствору , соде ржащему интересующее нас анализируемое соединени е (обозначим его как A) добавляют определенное количество того-же , но ХЛ -меченного соединения (обозначим его как A* ) и антите ла ( анти -A ). Образуется смесь меченных и н емеченных иммунных комплексов ( A-анти -A и A*-а нти -A , соответственно ): A + A* + анти -A ® A- анти -A + A*- анти -A. Очень важно , что пропорция между меченным и немеченым иммунными комплексами зависит от того , скол ько меченного антигена мы добавили ( A* ) и сколько немеченого было в исследуемой пробе ( A ), а именно : чем больше было немеченого антигена , тем меньше доля меченных антител. Теперь остается очистить сме сь иммунных комплексов и определить количеств о A*-анти -A по хемилюминесценции . Интенсивность ХЛ будет тем меньше , чем больше было немеченых антигена A (т . е . анализируе мого вещества ) в исследуемой пробе . Чтобы анализ был количественным , предварительно строят калибровочную кривую , т . е . измеряют завис имость инте нсивности ХЛ в конечной пробе от кон центрации стандартного раствора изучаемого вещес тва A . Затем измеряют интенсивность ХЛ в растворе с неизвестной к онцентрацией антигена ( A ), повторяя те же процедуры , и по калибровочной кривой находят концентрацию A . П ри использовании метода ICMA берут избыток ХЛ -м еченного антитела ( анти -A* ) и добавляют к нему раствор с изучаемым веществом ( A ). Образуется ХЛ -меченный иммунный комплекс : A + анти - A * ® A - анти - A * Остается отделить иммунные комплексы от других участников реакции и измерить интенсивность ХЛ . В данном случае она будет тем выше , чем больше было анализируемого вещества A в пробе . Для количественного анализа и здесь пред варительно строят калибровочную кривую. В обоих методах одна из практических трудностей - это очистка иммунных комплексов . Она решается также методами имм унохимии . Детали этой техники мы здесь рас сматривать не будем , но один из подходов заключается , например , в использовании порошк а сорбента (см . Рис . 6 В ), к поверхности к оторого "пришиты " (т . е . присоединены ковал ентной химической связью ) антитела к анти-А (назовем их анти-анти-А ). В присутст вии растворенных комплексов ( А-а нти-А и /или А *-анти-А ) образуется трой ной комплекс ("сандвич "): ( анти- анти-А )-( анти-А )-А и /или ( ант и-анти-А )-( анти-А )- А * . Адсорбент можно осадить и затем оп ределить в осадке (после дополнительных обраб оток ) количество меченного антигена . Биолюминесценция Биолюминесценция - (БЛ ) - это hemilum живых организмов , види мое простым глазом . Способностью к БЛ обладают организмы , принадлежащие к самым разным системати ческим группам : бактериям , грибам , моллюскам , на секомым . Механизм реакций , сопровождающихся hemilumм , весьма различен у разных видов ; однако обычно включает в себя химическое превращение определенного низкомолекуляр н ого суб страта , называемого люциферином , катализируемое фе рментом , называемым люциферазой . С развитием техники измерения очень слабых световых потоков стало ясно , что свечение при химич еских реакциях ( хемилюминесценция ) - не такая уж экзотика . Слабое свече ние сопровождает по существу все хими ческие реакции , идущие с участием свободных радикалов . Собственное свечение животных клеток и тканей обусловлено преимущественно реакция ми цепного окисления липидов и реакциями , сопровождающими взаимодействие окиси азо т а и супероксидного радикала . Известное с древних времен ви димое простым глазом свечение некоторых орган измов , например светляка , которое называют био люминесценцией , также нашло широкое применение в клинических анализах и медико-биологических научных иссле дованиях . Биолюминесценция светляка Всем известное hemilum светлячков прои сходит в результате биохимической реакции оки сления светлячкового люциферина кислородом возду ха в присутствии аденозинтрифосфорной кислоты ( ATP ): E + LH 2 + ATP ® E-LH 2 -AMP + PP E-LH2-AMP P*-E-AMP ® E + P + AMP + фотон Здесь AMP - аденозинмонофосфат , PP - пирофосфат , E - люцифераза , LH 2 - люциферин , P* и P - продукт реакции ( оксилюциферин ) в возбужденном и основном сост ояниях , соответственно. В отсутствие АТФ биолюминесцен ция не наблюдается ; на этом основан один из самых чувствительных методов анализа АТФ в различных объектах . Для определения содержания АТФ смотрят хемилюмине сценцию в изучаемом растворе , к которому д обавляют смесь люциферина и люциферазы , выдел енных из свет лячков либо полученных с интетически и методом генной инженерии. Удается определять содержание АТФ в образце от 10 -17 моля и выше. Поскольку биосинтез АТФ — показатель нормал ьной жизнедеятельности клеток , люциферин — люцифераза светляка испол ьзуют дл я обнаружения бактериального заражения в како й-либо среде , оценки жизнеспособности эритроцитов при консервировании крови , изучения действия на микроорганизмы антибиотиков и т В последнее время используют препараты иммобилиз ованной люциферазы (т . е. фермента , молеку лы которого химически связаны с полимерной пленкой ), стабильность которой выше ; такой п репарат можно использовать многократно . Биолюминесценция с ветящихся бактерий К числу светящихся относится немного видов бактерий . Хемилюминесцентна я реакция , непосредственно сопровождаемая hemilumм , катализируется ферментом — бактериальной люциферазой и включает в себя процессы окисления восстановленного флавинмононуклеотида ФМН-Н 2 до ФМН и одновременно - алифатического (С 14) альдегида до миристинов о й (С 14) кислоты В последние годы получают все большее распространение биохимическ ие анализы , в которых в качестве тест-объе кта используют целые бактериальные клетки (в суспензии ), экстракты светящихся бактерий , изо лированный фермент - люциферазу . Пре жде всего , измерение биолюминесце нции бактерий можно использовать для определе ния низких концентраций кислорода . Дело в том , что в отсутствие кислорода фотобактерии не обладают hemilumм , hemilum усиливается пропорциональн о концентрации кислорода в среде в интервале концентраций О 2 от 2• 10 -8 до 5• 10 -6 моль /л. Можно использовать светящиеся бактерии и в качестве "лабораторного животного ", т . е . живых организмов , на которых изучают , к примеру , действие различных токсических веществ . Светящиеся бактерии весьм а чувствительн ы к примесям токсических веществ в воде , и измерение биолюминесценции можно использоват ь для оценки загрязнения воды токсическими соединениями , скажем ионами тяжелых металлов. С другой стороны , hemilum бактерий можно и спользовать для предв арительной оценки эф фективности новых антибиотиков . Но наиболее п ерспективно , несомненно , применение очищенных преп аратов бактериальной люциферазы . Фермент , очищенны й от примесей низкомолекулярных соединений , о бладает способностью к излучению света лишь в присутствии всех трех субстрато в : кислорода , ФМН-Н 2 и длинноцепочечного альдегида (с длиной цепи не менее 8 углеродных атомов ). Д обавив к изолированной бактериальной люциферазе ФМН-Н 2 , исс ледователь получает высокочувствительную систему для определения али фатических альдегидов ; к их числу принадлежат , в частности , полов ые гормоны насекомых , феромоны , которые обнару живаются в количестве 10 -14 моль , что позволяет изучать м етаболизм этих веществ у одной особи. Биолюминесценция медузы Aequorea В последнее в ремя для обнаружения малых количеств ионов кальция широко используется хемилюминесценция белка , выде ленного из медузы Aequorea . Этот фотопротеин , называемый акворино м , содержит в себе ковалентно связанный лю циферин , который в присутствии ионов Са 2+ подверг ается химическим превращениям с образованием проду кта в возбужденном электронном состоянии . Всл едствие малой инерционности и высокой чувстви тельности биолюминесцентный метод весьма эффекти вен при изучении высвобождения и связывания Са 2+ в б иологических сис темах , например , во время мышечного сокращения . При этом экворин до бавляют прямо к изучаемому объекту и по интенсивности биолюминесценции следят за динам икой изменения содержания свободного кальция . Заключение Подобно многим другим разделам науки , хемилюм инесценция и биолюминесцен ция вначале были объектом исследования , а потом стали методом исследования других объек тов . На сегодняшний день химические и физи ческие явления , лежащие в основе чудесного превращения энергии биохимических реакций в световое излу ч ение , в основном расшифрованы. Началось более или менее широкое использование хеми - и биолюминесценции в биохимических лабораторных и клинических исследованиях . Создаются серийные приборы - хеми люминометры и биолюминометры , выпускаются наборы реактивов для анализа определенных ант игенов , антител и ферментов в крови больны х и в других биологических жидкостях . Веде тся поиск новых соединений , обладающих способ ностью вступать в химические реакции , сопрово ждающиеся hemilumм , с химически-активными продуктами жиз н едеятельности живых клеток , так ими как свободные радикалы и пероксиды (хи мические активаторы ХЛ ), равно как и веществ , усиливающих квантовый выход хемилюминесценции (физические активаторы ХЛ ). Одновреме нно с этим расширяется применение в анали тичес ких целей методов биолюминесценции . Прогресс органической химии , молекулярной биологи и и биотехнологии избавил нас от необходи мости путешествовать на юг , чтобы ловить п о ночам светляков , или охотиться в океане за медузами , чтобы выделить из живых существ ф ермент люциферазу и субстр ат биолюминесцентных реакций - люциферин : люциферин ы научились синтезировать , а многие люцифераз ы можно получить сейчас методами генной и нженерии . Короче говоря , применение методов хе ми - и биолюминесценции безусловно поможет про л и ть свет на многие загадки , е ще не решенные учеными .
© Рефератбанк, 2002 - 2017