Атф индуцированное изменение внутриклеточной концентрации кальция в нейронах неокортекса крыс

ВВЕДЕНИЕ Молекула АТФ давно известна как повсеместно распространенный источник энергии для внутриклеточного метаболизма . Но ее свойства как нейротрансмитера были обнаружены сравнительно недавно . Сегодня уже не осталось никаких сомнений , что АТФ являет ся нейротрансмитером в автономных нейромышечных соединениях , ганглиях и центральной нервной системе . К примеру , было показано , что АТФ вовлечена в генерацию болевых сигналов через Р 2 Х 1 и Р 2 Х 2 рецепторы . Однако роль и распределение пуринорецепторов в коре г оловного мозга и особенно в моторной коре до сих пор остается слабо изученной . Поэтому изучение механизмов действия АТФ в коре головного мозга представляет несомненный интерес . Мы изучали действие АТФ посредством измерения концентрации внутриклеточного кал ьция , - одного из найболее важных и универсальных регуляторов клеточных функций . Цель работы состояла в изучении механизмов генерации АТФ - индуцированных внутриклеточных кальциевых сигналов в нервных клетках моторной коры. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1 Гомеостаз кальция в нервных клетках Концентрация цитозол ьного кальция в эукариотических клетках регулируется трансмембранным транспортом и цитоплазматическим связыванием кальция . Движение ионов кальция через мембрану контролируется : 1) двумя семействами Са 2+ каналов , как то : кальциевыми каналами плазмалеммы и к альциевыми каналами , расположенными в мембране эндо ( сарко ) плазматического ретикулума ( ЭР или СР ), которые формируют пути входа кальция в цитоплазму ; 2) выводом кальция из цитоплазмы благодаря активности кальциевых насосов плазмалеммы и / или кальциевых обме нников ; и 3) аккумуляцией ионов кальция внутриклеточными кальциевыми депо и митохондриями . Последние служат системами кальциевого буфера , способными аккумулировать и накапливать ионы кальция , поддерживая таким образом гомеостаз кальция в цитоплазме. 1.1.1 Кальциевые каналы плазматической мембраны Нервные клетки экспрессируют различные типы кальциевых каналов плазмалеммы , которые могут быть активированы различными воздействиями . Основываясь на механизмы акт ивации , кальциевые каналы могут быть разделены на несколько типов потенциал - управляемых и рецептор - управляемых каналов. Потенциал - управляемые каналы вносят существенный вклад как в регуляцию входа кальция в цитоплазму , так и в нейрональный электроген ез . Белки , образующие кальциевые каналы , состоят из 5 субъедениц ( a 1 , a 2 , b , g , d ). Главная субъеденица a 1 формирует собственно канал и содержит места связывания для различных модуляторов кальциевых каналов . Было обнаружено несколько структурно различных a 1 субъедениц кальциевых каналов в нервных кл етках млекопитающих ( обозначенных как A, B, C, D и E). Функционально кальциевые каналы различных типов отличаются друг от друга активацией , кинетикой , проводимостью одиночного канала и фармакологией . В нервных клетках описано до 6 типов потенциал - управля емых кальциевых каналов (T-, L-, N-, P-, Q-, R- каналы ). Активность потенциал - управляемых каналов плазмалеммы регулируется различными внутриклеточными вторичными посредниками и мембраносвязанными G- белками ( 33 ,2 6 ). Второй важный путь потока ионов кальци я через мембрану связан с активацией агонист - управляемых каналов . Многие агонист - управляемые каналы обладают значительной кальциевой проницаемостью при физиологических условиях . Такую кальциевую проницаемость обнаруживают нейрональные ацетилхолин (Ach)- управляемые , глутамат - управляемые (NMDA и AMPA/ Каинат типы ) и пуринорецепторы ( 10 ,1 8 ,4 9 ,3 4 ). Кроме кальциевых каналов плазмалеммы , управляемых внешними воздействиями , в эукариотических клетках было открыто также несколько типов кальциевых каналов , контрол ируемых внутриклеточными вторичными посредниками . В частности , IP 3 - управляемые кальциевые каналы были обнаружены в нейронах Пуркинье мозжечка (3 4 ), а IP 4 - управляемые кальциевые каналы - в клетках эндотелия ( 35 ). Третий , недавно обнаруженный , особый тип Са 2+ каналов , который контролируется заполненностью внутриклеточных кальциевых депо , осуществляя таким образом прямую связь между освобождением Са 2+ в цитоплазму из депо и вход в нее Са 2+ через плазмалемму. 1.1.2 Кальциевые буферы Большая часть ионов Са 2+ , входящих в клетку , практически немедленно связывается цитоплазматическими местами связывания кальция . Показано , что только менее 1% ионов кальция , которые проникают в цитозоль , остается в несвязанном состо янии ( 11 ). Цитозольные кальциевые буферы представлены главным образом Са 2+ - связывающими белками , такими как парвальбумин , кальмодулин , тропонин- С , кальретинин , кальциунеурин , белок S-100 ( 25 ). Кроме того , цитозольная буферная емкость может быть опосредован а АТФ , которая способна связывать значительное количество Са 2+ ( 6 4). 20-50% цитозольных кальциевых буферов могут быть удалены из цитоплазмы при перфузировании клетки , что показывает их мобильность , в то время как оставшаяся часть Са 2+ - связывающей емкости о тносится к фиксированным буферам . Мобильные кальциевые буферы могут играть важную функциональную роль , способствуя диффузии ионов Са 2+ в цитоплазме и распространению Са 2+ сигнала по клетке . Внутриклеточное введение эндогенных Са 2+ буферов ( кальбиндина D 28k и парвальбумина ) через микропипетку приводило к увеличению скорости нарастания [Ca 2+ ] i на несколько порядков и существенно влияло на кинетику изменения [Ca 2+ ] i , что подтверждает роль мобильных Са 2+ буферов с низким молекулярным весом в эффективном регулир овании внутриклеточной концентрации кальция. 1.1.3 Кальциевые каналы эндоплазматического ретикулума Са 2+ каналы ЭР являются олигометрическими протеинами , встроенными в мембрану ЭР . Эти каналы можно относительно легко выделить из клетки для дальнейшего структурного анализа благодаря тому , что белки канала связываются специфически и с высоким сродством с IP 3 ( для IP 3 - управляемых каналов ) и с рианодином ( для Са 2+ - управляемых каналов ). Са 2+ - управл яемые Са 2+ каналы ЭР . Эти кальциевые каналы были впервые выделены из скелетных и сердечных мышц . Оказалось , что Са 2+ каналы ЭР в этих мышечных тканях имеют молекулярные различия и закодированы различными генами . Са 2+ каналы ЭР в сердечных мышцах непосредст венно связаны с высокопороговыми Са 2+ каналами плазмалеммы (L- тип ) через кальцийсвязывающие белки , образуя , таким образом , функционально активную структуру - « триаду » . В скелетных мышцах деполяризация плазмалеммы прямо активирует освобождение Са 2+ из сарко плазматического ретикулума благодаря тому , что Са 2+ каналы плазмалеммы служат потенциал - чувствительными передатчиками активирующего сигнала непосредственно Са 2+ каналам ЭР через связывающие белки ( 44 ). Таким образом , Са 2+ депо скелетных мышц обладают мех анизмом освобождения Са 2+ , вызываемым деполяризацией (RyR1- тип ). В отличие от скелетных мышц , саркоплазматические Са 2+ каналы кардиомиоцитов не связаны с плазмалеммой , и для стимуляции освобождения Са 2+ из депо требуется увеличение концентрации цитозольног о кальция (RyR2- тип ). ДНК , кодирующая белки двух типов каналов Са 2+ освобождения , была клонирована из тканей человека и кролика , что дало возможность экспрессировать Са 2+ - управляемые Са 2+ каналы в модельные клеточные системы . Белки , встроенные в липидный б ислой , формируют чувствительные к рианодину каналы , активируемые ионами Са 2+ (50 нмоль / л ) в присутствии АТФ ( 29 ). Кроме этих двух типов Са 2+ - активируемых Са 2+ каналов , недавно был идентифицирован третий тип Са 2+ каналов ЭР (RyR3- тип ), который является прод уктом другого гена . Этот третий тип Са 2+ каналов ЭР , как было показано , не чувствителен к кофеину ( 2 1). Эксперименты , проведенные на нервных тканях , продемонстрировали присутствие всех трех типов Са 2+ - управляемых Са 2+ каналов ЭР в мозге млекопитающих , одна ко RyR2- тип является доминантным ( 38 ). Са 2+ - управляемые Са 2+ каналы ЭР являются гомотетрамерами , состоящими из мономеров с молекулярным весом 500 КД ( 39 ) IP 3 - управляемые Са 2+ каналы ЭР. Существование IP 3 - управляемых Са 2+ каналов впервые было обнаружено в н ейронах Пуркинье . Позже было показано , что они встроены в мембрану эндоплазматического ретикулума . Структура IP 3 - управляемых Са 2+ каналов сходна со структурой Са 2+ - управляемых Са 2+ каналов ЭР . Они также являются гомотетрамерами с молекулярным весом мономер а 260 КД . 50% этих каналов активируется 15 мкмоль / л IP 3 и блокируется рутением красным и La 3+ . IP 3 - управляемые Са 2+ каналы были выделены из мозга млекопитающих , и их аминокислотная последовательность была расшифрована . Было показано , что семейство генов , э кспрессирующих IP 3 - управляемые Са 2+ каналы , состоит из трех или четырех различных генов ; они характеризуются различной чувствительностью к IP 3 и по- разному распределены в мозге млекопитающих ( 45 ). Порог активации этих каналов варьирует между 0.2 - 0.5 мкмо ль / л в нейронах Пуркинье мозжечка и возрастает до 9 мкмоль / л в астроцитах. 1.1.4 Кальциевые насосы Существует два семейства Са 2+ насосов , ответственных за устранение ионов Са 2+ из цитоплазмы : Са 2+ насосы плазмалеммы и Са 2+ насосы эндоплазматического ретикулума . Хотя они относятся к одному семейству белков ( так называемому P- классу АТФ- аз ), эти насосы обнаруживают некоторые различия в строении , функциональной активности и фармакологии. Кальциевый насос плазмалеммы. Са 2+ насос плазмалеммы , который удаляет ионы Са 2+ из цитоплазмы в межклеточное пространство , был открыт в 1966 году . Молекулярные свойства Са 2+ насосов плазмалеммы описаны в нескольких обзорах (1 8 ), однако достоверных данных о скорости вывода Са 2+ и регуляции Са 2+ насосов в нервных клетках немного . Недавно был разработан двухфлуоресцентный микрокапельный метод ( 5 8), позволяющий одновременно измерять [Ca 2+ ] i и выход Са 2+ наружу на одиночных клетках . Исследования , проведенные с помощью данного метода на нейронах моллюска и секреторных клетках , показали , что активность Са 2+ насоса плазмалеммы контролируется непосредственно [Ca 2+ ] i : увеличение концентрации цитоплазматического кальция активирует Са 2+ насос ( 5 8). В нейронах моллюска около 40% ионов кальция , входящих в клетку в ответ на деполяризацию мембраны , выводится из нейрона уже во время фазы нарастания [Ca 2+ ] i , отражая таким образом активацию кальциевого насоса плазмалеммы увеличением концентрации цитозольного Са 2+ ( 5 8). Кальциевый насос эндоплазматического ретик улума. Во многих эукариотических клетках , наряду с Са 2+ насосом плазмалеммы , существует кальциевый насос сарко ( эндо ) плазматического ретикулума (SERCA). В настоящее время описано по крайней мере 3 различных изоформы SERCA- насосов в клетках млекопитающих . SE RCA1- подтип сосредоточен исключительно в быстрых скелетных мышцах , SERCA2- насосы широко распространены в других тканях . Значимость SERCA3- насосов менее ясна ( 13 ). Белки SERCA2- насосов разделяются на две различные изоформы : SERCA2 а , характерные для кардиоми оцитов и гладких мышц , и SERCA2b, характерные для тканей мозга . Предполагается , что насосы SERCA различными способами регулируются цитоплазматической и интралюминальной концентрациями Са 2+ : Увеличение [Ca 2+ ] i активирует захват ионов кальция в ЭР , в то врем я как увеличение свободного кальция внутри ЭР ингибирует насосы SERCA ( 12 ). Насосы SERCA эффективно и селективно блокируются тапсигаргином в наномолярных концентрациях ( 37 ) и микромолярными концентрациями циклопиазоновой кислоты . Однако , тапсигаргин вызыва ет также блокаду потенциал - управляемых кальциевых каналов плазмалеммы , как это показано на клетках коркового слоя надпочечников и на сенсорных нейронах (Shmigol et al., 1995 ), поэтому его следует использовать с некоторой осторожностью. 1.1.5 Кальциевые обменники Дополнительным механизмом , ответственным за вывод ионов кальция из цитоплазмы , является натрий- кальциевый обменник , который выводит Са 2+ , используя энергию натриевого электрохимического градиента . Наличие Na + - Са 2+ обменника было показано в различных типах возбудимых и невозбудимых клеток ; в клетках нервной системы он был обнаружен в конце 60- х годов ( 9 ). В нейронах моллюска , помещенных в среду с пониженным натрием ( т. е . с обратным натриевым гради ентом ), наблюдалось увеличение [Ca 2+ ] i , что является результатом работы обменника в инвертированной форме . Однако , вклад Na + - Са 2+ обменника в регуляцию [Ca 2+ ] i в нейронах млекопитающих до сих пор не оценен . В некоторых работах было показано , что обменник принимает незначительное участие в удалении цитоплазматического Са 2+ , в то время как в других работах представлены данные о том , что обменник играет существенную роль в переносе Са 2+ через мембрану ( 5 7). 1.1.6 Са 2+ -связывающие органеллы Кроме быстрого связывания цитозольного Са 2+ внутриклеточными Са 2+ - связывающими белками , ионы кальция , попадающие в цитозоль , могут аккумулироваться аппаратом Гольджи или клеточным ядром , захватываться митохондриальными Са 2+ депо , имеющими достаточн о невысокое сродство к Са 2+ , или быстрыми депо , связанными с ЭР или СР , имеющими высокое сродство к Са 2+ . Однако если [Ca 2+ ] i превышает 0,5 мкмоль / л , наблюдается существенное перераспределение [Ca 2+ ] i в область митохондрий . Буферные системы митохондрий при нимают участие в удалении избыточного Са 2+ из цитоплазмы в клетках кишечника , некоторых типах нервных клеток ( 5 9) и в секреторных клетках после повышения [Ca 2+ ] i , стимулированного агонистами . Связывание кальция митохондриями обеспечивается активностью сист ем , расположенных на внутренней митохондриальной мембране . Са 2+ поступает в митохондрии по электрохимическому градиенту ; разность потенциалов , обеспечивающая транспорт кальция , создается переносом электронов во время клеточного дыхания и связанного с ним п ереносом протонов . Перенос электронов по дыхательной цепи является основным механизмом , обеспечивающим энергетику транспорта кальция . Подавление дыхательной цепи карбонил- цианид- м- хлорофенил- гидразоном ( СССР ) эффективно блокирует аккумуляцию кальция митохо ндриями ( 41 ). 1.2 Влияние АТФ на кальциевый гомеостаз Последние исследования показали , что АТФ занимает прочное место в ряду нейромедиаторов центральной и периферической нервной систем (Burnstock 1990). Н е вызывает сомнения , что АТФ является не только важнейшим внутриклеточным метаболитом , но и служит важным объектом межклеточного взаимодействия. 1.2.1 Строение и свойства АТФ АТФ ( см . рис .1) представляет собой нуклеотид и как всякий нуклеотид состоит из трех компонентов : азотистого основания , сахара пентозы и фосфата . В качестве азотистого основания в нуклеотидах присутствуют производные пурина и пиримидина . Фосфаты соединены в полифосфатную цепь , количество которых в естественных нуклеотидах не превышает трех . Однако синтезированы нуклеотиды , содержащие линейные цепи из более чем 3- х фосфатов , к примеру аденозинтетра - и аденозинпентафосфаты. Названия нуклеотидов , содержащих в качестве сахара рибозу , складываются из названия соответствующего нуклеозида , приставки , обозначающей количество фосфа тных групп в нуклеотиде и слова фосфат . Для наиболее распространенных нуклеотидов приняты сокращенные названия , например АТФ для аденозинтрифосфата , ГТФ - для гуанозинтрифосфата , ИМФ - инозинмонофосфата. В области нейтральных значений pH нуклеиновые основа ния и рибоза в растворе не заряжены ( Мартин , Мариам , 1982). Нуклеотиды , из- за наличия фосфатов , представляют собой сильные кислоты . АТФ содержит четыре ОН группы , способные к ионизации , три из которых имеют pKa ниже 3, а pKa четвертой - 6,5 ( Ленинджер , 197 6). Таким образом , при pH 7,4 подавляющее большинство молекул АТФ представляют собой четырехзарядные анионы АТФ 4- , кроме того , в растворе присутствует небольшое количество АТФ 3- . 1.2.2 Номенклатура и субклассификация пуринорецепторов. Первое разделение пуринорецепторов на Р 1 и Р 2 типы основывалось на следующем критерии : нуклеозиды такие как аденозин активировали Р 1 пуринорецепторы , в то время как АТФ стимулировала Р 2 пуринорецепторы , а метилксантины ( кофеин , теофиллин ) являются с елективными антагонистами Р 1 пуринорецепторов . Также Р 1 пуринорецепторы связаны с аденилатциклазой , а активация Р 2 пуринорецепторов может приводить к выработке простогландинов ( Burnstock 1978 ). 1.2.3 Р 1 пуринорецепторы. В 1979 го ду ( Van Calker et al 1979) показали , что аденозиновые , Р 1 - пуринорецепторы можно подразделить на две группы . Рецепторы одной из них обладали очень высоким сродством к аденозину ( константа диссоциации К d = 3 - 10 нМ ). При взаимодействии аденозина с этой гр уппой рецепторов наблюдалось ингибирование аденилатциклазы и , следовательно , уменьшался уровень внутриклеточного цАМФ . Этот класс рецепторов был назван А 1 - рецепторами ( R i рецепторы по ( Londos et al 1980 ) ). Аденозиновые рецепторы , относящиеся ко второй гру ппе , имели более низкое сродство к аденозину ( К d комплекса аденозина с рецептором 5-10 мкМ ). Активация этого типа рецепторов приводила к стимуляции аценилатциклазы . Эти рецепторы Ван Колкер назвал А 2 - рецепторами ( R a рецепторы по ( Londos et al 1980 ) ). Были обнаружены также и мощные антагонисты для А 1 - R - N 6 - Фенилизопропиладенозин ( R - PIA ). Для А 2 более сильным антагонистом был 5 ’ - N - этилкарбоксамидаденозин ( N ЕСА ). Также существуют работы , в которых описываются аденозиновые рецепторы , не связанные с аденилатцик лазой эти пуринорецепторы было предложено назвать А 3 ( Ribeiro and Sebastiao 1986 ) . Предпосылкой к разделению А 2 пуринорецепторов на А 2 а и А 2 b подтипы стало открытие разного сродства NECA к Р 1 пуринорецептору , - высокого в стриатуме ( А 2 а ) и низкого в фиброб ластах ( А 2 b ) ( Bruns et al 1986 ) . 1.2.4 Р 2 пуринорецепторы Накопленные фармакологические доказательства , как- то : тип ответа , порядок активности агонистов , десенситизация , вызываемая АТФ и ее структурными аналогами , послужили основ ой для первого субделения Р 2 пуринорецепторов . В 1985 году Бернсток и Кеннеди (10) указали на неоднородность популяции Р 2 - пуринорецепторов . Этот вывод был сделан исходя из того , что в некоторых тканях ( например продольная мышца слепой кишки ) АТФ вызывал ра сслабление гладких мышц , а в других ( мышечная стенка мочевого пузыря ) - сокращение . Первый подтип рецепторов был обозначен как Р 2 у , а второй - Р 2 х . Для Р 2 х пуринорецепторов наиболее активным агонистом был , - метилен АТФ ( , - мАТФ ), а для Р 2 у - 2 - метилтио АТФ (2- Ме S АТ P ). Так как порядок активности лигандов может зависеть от скорости их гидролиза до неактивных соединений , которая может зна чительно различаться в зависимости от ткани , более четким доказательством для подразделения Р 2 - рецепторов на подтипы служит наличие селективных блокаторов . Сейчас известны селективные антагонисты как для Р 2 х , так и Р 2 у - рецепторов для Р 2 х - , - мАТФ ( десенситизирующее действие ), арилазидаминопропионил АТФ ( АНАПП 3 ), пиридоксалфосфат -6- азофенил -2 ’ ,4 ’ - дисульфидная кислота ( PPADS ), сурамин и другие ; для Р 2 у пуринорецепторов - реактив голубой 2, сурамин . В 1986 году Гордон ( 23 ) предложил выделить из класса Р 2 пуринорецепторов еще два подтипа Р 2 t и Р 2 z . Первый рецептор располагается в тромбоцитах и управляет их агрегацией . Он , в отличие от всех остальных подтипов P 2 - рецепторов , активируется АДФ , и блоки руется АТФ . Р 2 z рецепторы расположены в тучных клетках . В них АТФ в очень больших концентрациях (> 100 мкМ ) , а точнее четырехзарядный анион АТФ 4- , вызывал кальцийзависимую секрецию гистамина. Другие пур иновые нуклеотиды , включая негидролизуемые аналоги АТФ , не активировали р ецептор . Также был обнаружен неселективный антагонист данного типа рецепторов DIDS - аналог PPADS ( Soltoff et al 1993 ) . В 1991 году O ’ Connor предложил так называемый нуклеотидный рецептор одинаково чувствительный как к АТФ , так и к УТФ , но не чувствительный к 2 - MeSATP . Этот рецептор получил обозначение Р 2 u . Возможным антагонистом данного рецептора является сурамин . Также было обнаружено , что аденин динуклеотид полифосфаты также присутствуют в фармакологической периферии ( Hoyle 1990 ) . Hi ldermann (1991) индентифицировал сайт связывания для диаденозин тетрафосфата ( Ap 4 A ) в мозге крысы , который получил название дипуринергического рецептора , а позднее Р 2 d ( Pintor et al 1993). Антагонисты данного вида пуринорецепторов пока не обнаружены. пури норецепторы Р 1 - пуринорецепторы Р 2 - пуринорецепторы A 1 A 2a A 2b A 3 P 2x P 2y P 2t P 2z P 2u P 2d Таблица 1. Классичес кая схема субклассификации пурино- рецепторов . 1.2.5 Реклассификация пуринорецепторов. Из - за всевозрастающих трудностей и несогласований в классической схеме классификации Р 2 пуринорецепторов и увеличивающемся числе подтипов рец епторов , стало очевидным , что классическая схема требует пересмотра . В 1994 году Abbracchio and Burnstock предложили новую схему классификации Р 2 - пуринорецепторов . Из всех Р 2 - пуринорецепторов они вычленили три основных семейства : Р 2 Х семейство , связанн ое с ионотропными каналами , которое включало четыре подтипа ; Р 2 У - связанное с активацией G - белков , включающее семь подтипов и семейство Р 2 Z - семейство неселективных пор . Их гипотеза основывалась в основном на изучении литературных источников и анализе фармакологического профиля новообнаруженныж агонистов . В дальнейшем теория подтвердилась клонированием различных подтипов Р 2 - пуринорецепторов . В настоящее время семейство Р 2 Х насчитывает шесть , а Р 2 У - семь подклассов . Благодаря интенсивным исследованиям , практически не остается сомнений в том , что данные семейства будут расти и дальше ( Collo et al 1996 ). Р 2 - пуринорецепторы P2Z - неселективные поры Р 2 Х - семейство ионотропных рецепторов Р 2 У - семейство метаботропных рецепторов Р 2 Х 1 Р 2 Х 2 Р 2 Х 3 Р 2 Х 4 Р 2 Х 5 Р 2 Х 6 Р 2 У 1 Р 2 У 2 Р 2 У 3 Р 2 У 4 Р 2 У 5 Р 2 У 6 Р 2 У 7 Таблица 2. Современная классификация Р 2 типа пуринорецепторов. ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 2. ОБ ЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 2.1 Подготовка препарата Исследования проводились на пирамидальных нейронах моторной области новой коры в тонких срезах мозга , выделенного из 14 дневных крыс . После декапитации мозг помещался в холодный солевой раствор (0 - 4 0 С ). Процедура от начала декапитации до выделения мозга длилась не более 60-90 секунд . Затем мозг закреплялся полиакриламидным клеем на подложке вибротома (Campden, Campden Instruments LTD, U.K.); камера вибр отома заливалась холодным солевым раствором . Срезы нарезались сагитально толщиной 250 - 300 мкм ; скорость подачи лезвия - 1 см / с с частотой 10 Гц . После приготовления срезы помещались в раствор постоянно насыщаемый карбогеном (5% СО 2 + 95% О 2 ). Перед загру зкой флуоресцентным красителем срезы инкубировались в постоянно оксигенируемом растворе 30 минут при температуре 32 градуса . Окраска среза осуществлялась в течении 30 - 35 минут в СО 2 насыщенном термостате при температуре 35 градусов . После окраски срезы о тмывались 1 - 1,5 часа в постоянно оксигенируемом растворе при комнатной температуре . Все эксперименты проводились при температуре 32 градуса. 2.2 Характеристики кальциевого зонда Для количественного определения концентрации кальция в пирамидальных нейронах моторной области новой коры использовался краситель Фура -2 AM ( рисунок 2) (16). На рисунке 3 представлен спектр зонда Фура -2 AM . При связывании с кальцием происходит характерное изменение спектра возбуждения этого красителя : при возбуждении светом с длиной волны 390 нм происходит уменьшение флуорес ценции , а при возбуждении светом , с длиной волны 340 нм - увеличение . Однако , 340 нм является уже ультрафиолетовым светом , и для ее использования необходим микроскоп с кварцевыми линзами . Поскольку в нашем случае был использован обычный микроскоп , то втора я волна была выбрана длиной 390 нм . 360 нм - это изобестическая точка зонда Фура -2, т. е . флуоресцентный сигнал при возбуждении светом этой длины волны не зависит от концентрации Ca 2+ и есть функция лишь концентрации зонда. Измерение флуоресценции при возб уждении двумя длинами волн позволяет легко рассчитать [Ca 2+ ] i в клетке по формуле ( 24 ): [Ca 2+ ] i = K d * b * (R - R min )/(R max -R) где К d - константа диссоциации комплекса Фура -2 с кальцием , R=F 360 /F 390 - текущее отношение флуоресцентных сигналов , R min = F 360 / F 390 |Ca0 - то же отношение в растворе с низкой концентрацией Ca 2+ , R max = F 360 /F 390 |Ca Ґ - то же отношение в растворе с высокой концентрацией Ca 2+ , b = F 390 |Ca0/F 390 |Ca Ґ - отношение флуоресцентны х сигналов в низкой и высокой концентрации Ca 2+ при возбуждении длиной волны 390 нм . Параметры R min , R max и b определяли экспериментально . Для этого были приготовлены базовый раствор ( в ммоль / л ) : KCl - 100, Tris-Cl - 10 (pH=7.2), Фура -2 - 0.005; раствор с низкой концентрацией Ca 2+ готовился без добавления Ca 2+ с добавкой EGTA - 10; раствор с высокой концентрацией Ca 2+ - с добавкой Ca С l 2 - 10. Отношение величин флуоресценции определялось в каплях приведенных выше растворов , помещенных на дно эксперименталь ной камеры . В результате для нашей системы R min = 0.33, R max = 8.9 и b=12.8. Параметр К d был взял из работы [Grinkiewicz et al, 1985] и равнялся 224 нмоль / л. 2.3 Окраска срезов флуоресцентным красителем Для введения кальций - чувств ительного зонда в клетку , срезы инкубировались в растворе Тироде , содержащим эстерифицированную незаряженную форму красителя Фура -2 ацетоксиметилэстер в концентрации 5 мкмоль / л , растворенную в диметилсульфоксиде с добавлением детергента Плуроник F-127 (0.0 2%). В такой форме краситель проникает в клетку , затем эндогенными эстеразами эфирные группы отщепляются , зонд становится заряженным и покинуть клетку не может . Окраска производилась 20 минут при температуре 35 о С . Концентрация зонда в клетке определялась п утем титрования окрашенных клеток раствором красителя , который добавлялся во внеклеточный раствор . Оцененная таким способом концентрация зонда в клетке была в диапазоне 30 - 70 мкмоль / л. 2.4 Структура экспериментальной установки для двух-волно вого измерения концентрации кальция Принципиальная схема установки представлена на рисунке 4 . Основными элементами ее являются : источник света , система смены фильтров , микроскоп , ФЭУ , модуль предварительной обработки сигнала и компьютер. Источ ником возбуждающего света служит ртутная лампа мощностью 50 ватт . Поскольку в качестве кальций - чувствительного зонда использовали индикатор Фура -2 АМ , являющийся по возбуждению двухволновым ( см . выше ), то для количественного определения [Ca 2+ ] i необходи мо было одновременно индуцировать флуоресценцию обеими длинами волн . В нашей конфигурации периодическая смена фильтров возбуждения была реализована при помощи вращения колеса с вмонтированными в него двумя интерференционными фильтрами 360 и 390 нм . Частота вращения была 5 Гц . Управление системой смены фильтров осуществлялось при помощи кальций - измерительного модуля фирмы Luigs und Neumann, Германия . Этот же модуль являлся интерфейсом предварительной обработки. Оптич еская часть установки была смонтирована на базе микроскопа Axioskop, Zeiss. Разделение потоков возбуждающего света и флуоресценции производилось при помощи дихроического зеркала . Свет , прошедший через фильтр для возбуждения флуоресценции , отклонялся дихрои ческим зеркалом и при помощи высокоаппертурного иммерсионного объектива (40*, апертура 0.75) фокусировался на объекте . Флуоресцентный свет проходил через соответствующий интерференционный фильтр и подавался на фотоэлектронный умножитель ( ФЭУ ). Для уменьшен ия уровня шумов фиксированная диафрагма (1 мм ) была расположена перед ФЭУ . В результате флуоресцентный сигнал собирался с фокальной плоскости диаметром 50 мкм , что позволило значительно улучшить соотношение сигнал / шум. Модуль предварительной обработки позв олял производить компенсацию автофлуоресценции и , при необходимости , усиливать сигнал , после чего он оцифровывался при помощи цифрового интерфейса TIDA и обрабатывался компьютером при помощи программ Tida 5.0 и Wintida, разработанных в Гейдельберге , Герман ия. Рисунок 4. Принципиальная схема экспериментальной установки для двухволнового измерения кальция. 2.5 Растворы и смена растворов При ра боте со срезами все растворы готовились на основе раствора Тироде ( в ммоль / л ): NaCl - 125, KCl - 5.4, MgCl 2 - 1, CaCl 2 - 2.5, NaHCO 3 - 26, KH 2 PO 4 - 1.6, глюкоза - 10, постоянно аэрировавшийся газовой смесью 95% О 2 + 5% СО 2 (pH=7.4). Бескальциевый раствор г отовился эквимолярной заменой CaCl 2 на MgCl 2 и добавкой 1 ммоль / л EGTA, растворы с повышенным содержанием калия или кофеина - заменой NaCl на соответствующее количество K С l или кофеина. Смена растворов производилась протоком , скорость которого можно было в арьировать от 10 до 20 мл / мин . Объем экспериментальной камеры составлял 0.5 мл . Все эксперименты были проведены при температуре (32 С ). РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ Аппликация АТФ в большинстве нейронов моторной коры (98 из 102) вызывает быстрое и кратковременное повышение концентрации цитозольного кальция [Ca 2+ ] i . Концентрация [Ca 2+ ] i достигает своего максимума на протяжении 6-8 секунд и затем восстанавливается до базального уровня при продолжающемся присутствии АТФ . Отмывание АТФ приводит к восстановлению [Ca 2+ ] i до уров ня покоя . Характерный вид АТФ - индуцированного кальциевого транзиента представлен на рисунке 5. Амплитуда АТФ - индуцированного кальциевого транзиента варьировалась в пределах от 50 до 450 нМ . Среднее значение выброса [Ca 2+ ] i вызванного приложением АТФ в концентрации 100 мкМ находилось в пределах 200-250 нМ . Наблюдалась доза - зависимость амплитуды ответа от концентрации АТФ в пределах от 10 до 2000 мкМ . На рисунке 7 представлена апрок симация экспериментальных точек сигма - функцией . Концентрация АТФ , при которой амплитуда ответа составляет половину максимальной , - 220 ± 20 мкМ. Целью наши х исследований было определение подтипов пуринорецепторов вовлеченных в генерацию [Ca 2+ ] i транзиента . Известно , что АТФ активирует несколько типов пуринорецепторов , а именно Р 2 пуринорецепторы подтипов Р 2 х и Р 2 у (Peter Illes et al, 1993, Burnstock and Kenn edy 1985), а также Са 2+ каналы плазмалеммы ( Кришталь , 1983). С целью обеспечения достоверности полученных данных , принимая во внимание тот факт , что работа проводилась на тонких срезах мозга , мы провели серию экспериментов с подавлением распостранения пот енциалов действия с помощью тетродотоксина ( TTX ) . При использовании TTX выяснилось , что амплитуда и форма [Ca 2+ ] i транзиентов не изменяется или изменяется незначительно . Полученные результаты позволяют нам предполагать , что получаемые нами данные отображаю т процессы происходящие в отдельной наблюдаемой клетке . К сожалению мы не имели возможности проводить все эксперименты c тетродотоксином из- за дороговизны препарата . Для изучения характеристик рассматриваемых пуринорецепторов , принимающих участие в генерац ии [Ca 2+ ] i транзиента , применялись следующие протоколы экспериментов . 1. Приложение АТФ в растворе не содержащем Ca 2+ . Удаление кальция из внеклеточного раствора незначительно влияло на кальциевый транзиент , вызванный аппликацией 10 мкМ АТФ , но в тоже время подавляло на 45% ± 7% кальциевый транзиент вызванный 100 мкМ АТФ . ( Рис . 8) . 1. Для исследования способности внутриклеточного Ca 2+ депо к перезап олнению мы последовательно апплицировали АТФ несколько раз с интервалом в 60 секунд в обычном растворе и в растворе не содержащем Ca 2+ . Как видно из рисунка 9 вторая аппликация АТФ вызывала Ca 2+ транзиент меньшей ( на 30% 4% ) амплитуды по сравнению с первой ( контрольной ) аппликацией . Последующие аппликации АТФ разделенные 60 ти секундным интервалом не вызывали заметного уменьшения амплитуды [Ca 2+ ] i транзинета по сравнению со второй аппликацией в стандартном растворе В бескальциевом растворе - наоборот , вторая аппликация АТФ вызывала значительное уменьшение Ca 2+ транзиента на 40% 5% от контроля . Последующие аппликации А ТФ в бескальциевом растворе приводили к последовательному уменьшению амплитуды [Ca 2+ ] i транзиента и после двух - трех последовательных аппликаций сигнал исчезал вообще ( рисунок 10). Такое уменьшение вероятно обусловлено истощением внутриклеточных депо . 1. Ингибирование захвата Ca 2+ эндоплазматическим ретикулом тапсигаргином ( спецефическим блокатором Ca 2+ насоса эндоплазматического ретикулума ) уменьшало [Ca 2+ ] i транзиенты , вызванные пр иложением АТФ , на 63% 5% для концентрации АТФ 100 мкМ АТФ ( рис . 11). Как видно из рисунка 11 приложение тапсигаргина не влияло на базальный уровень Ca 2+ в клетке. 1. Приложение кадмия в концентрации 50 мкМ , верапамила в концентрации 100 мкМ и 50 мкМ никеля обратимо уменьшало амплитуду [Ca 2+ ] i транзиента вызванного приложением 100 мкМ АТФ на 35%, 20%, и 15% сответственно . Данные представлены на рисунке 12. 1. Приложение различных агонистов пуринорецепторов вызывало различные по амплитуде ответы . Порядок относительной активности лигандов для данного объекта был следующим ATP S AT Ф A ДФ , -methylene ATP AM Ф УТФ аденозин ( ADO ), данные преставлены на рисунке 13. 1. Сурамин , известный антагонист Р 2 типа пуринорецепторов , уменьшал [Ca 2+ ] i транзиенты , выз ванные приложением 100 мкМ АТФ на 76% 7% и также не изменял концентрацию [Ca 2+ ] i в покое . Данные представлены на рисунке 14. ОБСУЖДЕНИЕ 4. ОБСУЖДЕНИЕ При исследовании средних слоев неокортекса крыс мы обнаружили их способность отвечат ь на приложение АТФ . Таким образом мы можем сделать вывод о наличии в данном объекте пуринорецепторов . Ответ на АТФ является доза - зависимым с амплитудой половинного ответа в 220 нМ . Последовательные приложения АТФ , после второго приложения , не вызывали у меньшения амплитуды [ Ca 2+ ] in транзиентов . Из этого можно сделать вывод об отсутствии десенситизации данного типа рецепторов. Исследуя источники повышения цитозольного кальция мы обнаружили , что АТФ активирует как ионотропные так и метаботропные рецепторы . Блокаторы потенциал - управляемых кальциевых каналов такие как кадмий , никель и верапамил уменьшали АТФ - индуцированные кальциевые транзиенты на 35% - 15%, что говорит об опосредованном АТФ активировании потенциал - управляемых каналов . Для исследования активацию метаботропных рецепторов . Для этого мы прилагали АТФ в бескальциевом растворе , - амплитуда ответа при этом уменьшалась на 45% 7%. Этот результат говорит о том , что внутриклеточные депо принимают участие в генерации [ Ca 2+ ] in ответов , причем их вклад близок к половине . При повторных аппликациях АТФ в бескальциевом растворе Ca 2+ ответ исчезал полностью после второй аппликации , т. е . внутриклеточные депо полностью истощаются . Исследуя путь высвобождения внутриклеточного кальция мы апплицировали тапсигаргин - спецефический блокатор АТФ - азы эндоплазматического ретикулума . [ Ca 2+ ] in транзиенты уменьшались на 63% 5% в присутствии тапсигаргина . Аппликация коффеина , агониста рианодиновых рецепто ров , в клетках моторной коры 14 дневных крыс не вызывали повышения уровня [ Ca 2+ ] in . Следовательно выброс [ Ca 2+ ] in из внутриклеточного депо происходит по IP 3 - чувствительному механизму. В дальнейшем мы исследовали более подробно типы присутствующих пурино рецепторов . Построив ряд активности агонистов для Р 1 и Р 2 пуринорецепторов по амплитудам ответов , мы сделали заключение базирующееся на отсутствии ответа на аденозин , что в нашем объекте присутствуют только Р 2 пуринорецепторы . Проводя дальнейшую субклассиф икацию Р 2 типа рецепторов мы использовали сурамин - блокатор некоторых типов Р 2 х и Р 2 у рецепторов . Приложение сурамина уменьшало амплитуду [Ca 2+ ] i транзинета вызванного приложением 100 мкМ АТФ на 76% 5%, что говорит о наличи и этих типов рецепторов в исследуемом объекте. ВЫВОДЫ 5. ВЫВОДЫ 1. Приложение АТФ в различных концентрациях вызывает Ca 2+ транзиенты в клетках моторной коры крыс. 2. Ответ на АТФ является доза - зависимым с амплитудой половинного ответа в 220 нМ. 3. АТФ активирует как ионотропный так и метаботропные пути повышения внутриклеточного кальция. 4. В генерации АТФ индуцированного повышения [ Ca 2+ ] in принимают участие некоторые типы потенциал - управляемых кальциевых каналов. 5. Высвобождение внутриклеточного кальция происходит из IP 3 чувствительных депо. 6. В данном объекте присутсвуют только Р 2 подтипы пуринорецепторов. 7. Сурамин - ан тагонист Р 2 Х 2 и Р 2 Х 5 и Р 2 У рецепторов уменьшает амплитуду [ Ca 2+ ] in транзиенты , что говорит присутствии некоторых из вышеперечисленных рецепторов. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 6. СПИСО К ЛИТЕРАТУРЫ 1. A.Shmigol, A.Verkhratsky & G. Isenberg (1995): Calcium-induced calcium release in rat sensory neurones. Journal of Physiology (London), 489.3 627-636. 2. A.Shmigol, G. Isenberg, P.Kostyuk & A. Verkhratsky (1994): Calcium-induced Ca 2+ release from internal stores in rat dorsal root ganglion neurones. In: European Journal of Neuroscience, Suppl. 7, Proceedings of the 16th Annual ENA Meeting, p. 146. 3. A.Shmigol, N.Svichar, P.Kostyuk & A.Verkharatsky . (1995): “ Incr emental” caffeine-induced calcium release in mouse sensory neurones. European Joutnal of Neuroscience, Supple № 8. p111. Proceedings of the 16th Annual ENA Meeting. 4. A.Shmigol, Yu.Usachev, N.Pronchuk, S.Kirischuk, P.Kostyuk & A.Verkhratsky (1994): Prop erties of the caffeine sensitive intracellular calcium stores in mammalian neurons. Neurophysiology /Neirophiziologia, v. 26 No. 2, p. 16 - 25. 5. A.V erkhratsky , A. S hmigol , S. K irischuk , N. Pronchuk & P. K ostyuk (1994): Age-dependent changes in calcium currents and calcium homeostasis in mammalian neurons. Annals of the New York Academy of Sciences, v. 747, p365 - 381. 6. Abbracchio, M. P., Burnstock, G. (1994) Purinoceptors: are there families of P 2x and P 2y purinoceptors? Pharmac. Ther . 64: 445-475 7. Anatoly Smigol, Platon Kostyuk, Alexey Verhratsky (1994) Role of caffeine-sensitive Ca 2+ stores in Ca 2+ signal termination in adult DRG neurones // NeuroReport v.5, 2073-2076. 8. Anatoly Smigol, Sergey Kirischuk, Platon Kostyuk, Alexey Verhratsky (199 4) Different properties of caffeine-sensitive Ca 2+ stores in peripherial and central mammalian neurones // Pflugers Arch v.426, 174-176. 9. Baker P. F., Blaustein M.P., Hodgkin A.L. and Steinhardt R. A. (1969) The influence of calcium on sodium efflux in squid axons. J. Physiol., Lond. 200, 431-458. 10. Bean B.P. (1992) Pharmacology and electrophysiology of ATP-activated ion channels. Trends Pharmacol. Sci. 13, 87 - 90. 11. Belan P., Kostyuk P., Snitsarev V. and Tepikin A. (1993) Calcium clamp in isola ted neurones of the snail Helix pomatia . J. Physiol., Lond. 462, 47 - 58. 12. Bronner, F. (1990). Intracellular Ca 2+ regulation .. New York: Wiley-Liss. 13. Burk S. E., Lytton J. , MacLennan D. H. and Shull G. E. (1989). cDNA cloning, functional express ing, and mRNA tissue distribution of a third organellar Ca 2+ pump. J. Biol. Chem. 164, 18561-18568. 14. Burnstock, G. (1972) Purinergic nerves. Pharmacol. Rev. 24: 509-581 15. Burnstock, G. (1978) A basis for distinguishing two types of purinergic rec eptor. in: book 16. Burnstock, G. (1990) Co- transmission. Arch. Int. Pharmacodyn . 304: 7-33 17. Burnstock, G., Kennedy, C.(1985) Is there a basis for distinguishing two types of P 2 purinoceptor? Gen.Pharmacol . 16: 433-440 18. Carafoli E. (1992) Calcium pump of the plasma membrane. Physiol. Rev . 71, 129 - 153. 19. Chen, C.-C., Akopian, A.N. et al, (1995) A P 2x purinoceptors expressed by a sybset of sensory neurones. Nature 377: 428 - 431 20. Кришталь О. А ., Марченко С. М . (1983 ). Рецепторы АТФ в сенсорных нейронах млекопитающих . Докл . Акад . Наук УССР. 21. Gianini G., Clementi E., Ceci R., Marziali G., and Sorremtino V. (1992) Expression of a ryanodine receptor Ca 2+ that is regulated by TGF-b, Science , 257, 91 - 94. 22. Ginett a Collo et al, (1996) Cloning of P2X 5 andP2X 6 receptors and the distribution and properties of an extended family of ATP-gated ion channels. The J. of Neurosci. 16(8): 2495-2507 23. Gordon, J. L. (1986) Extracellular ATP: effects, sources and fate. Bioch em.J. 233: 309-319 24. Grynkiewicz, G., Poenie, M., and Tsien, R.Y. A new generation of Ca 2+ indicators with greatly improved fluorescent properties. J. Biol. Chem., 260, 3440-3450, 1985. 25. Heizmann C.W. and Hunziker W. (1991) Intracellular calcium- binding proteins: more sights than insights. Trends Biochem. Sci. 16, 98 - 103. 26. Heschler J. and Schultz G. (1993) G-proteins involved in the calcium channel signalling system. Curr. Opin. Neurobiol. 3, 360-367. 27. Hiderman, R. H., Martin, M., Zimm erman, J. K., Pivorun, E. B. (1991) Identification of a unique membrane receptor for adenosin 5 ,5 - P 1 ,P 4 -tetraphosphate. J. Biol. Ch em . 266: 6915-6918 28. Hoyle, C. H. V. (1990) Pharmacological activity of adenine dinucleotides in the periphery: possible receptor classes and transmitter function. Gen. Pharmacol . 21: 827-831 29. Hymel L., Inui M., Fleischer S. and Schindler H. (1988). Purified ryanodine receptor of skeletal muscle sarcoplasmic reticulum forms Ca 2+ - activated oligomeric Ca 2+ channels in planar bilayers. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 85, 441-445. 30. Kirischuk S.I., Voitenko N.V., Kettenmann H.O. and Verkhratsky A.N. (1994) Mechanisms of cytoplasmic calcium signalling in cerebellar Bergman glial cells // Neurophysiology v.26, 417-419. 31. Kirischuk, V.Matiash, A.Kulik, N.Voitenko, P.Kostyuk, A.Verkhratsky (1996) Activation of P 2 -purino, 1 -adren o and H 1 -histamine receptors triggers cytoplasmic calcium signalling in cerebellar Pupkinje neurons // Neuroscience v.73, 643-647 32. Kostyuk and A. Verhratsky (1994) Calcium stores in neurones and glia //Neuroscience v. 63, N.2, 381-404. 33. Kost yuk P. G. (1992). Calcium ions in nerve cell function. Oxford, New York, Tokyo: Oxford University Press . 34. Kuno M., Maeda N. and Mikoshiba K. (1994) IP 3 - activated Ca 2+ - permeable channels in the incide-out patches of cultured cerebellar Purkinje cells. Biochem. Biophys. Res. Comm . 199, 1128 - 1135. 35. L у ckhoff A. and Clapham D.E. (1992) Inositol 1,3,4,5-tetrakisphosphate activates an endothelial Ca 2+ - permeable channel. Nature 355, 356-358. 36. Londos, C., Cooper, D. M. F., Wolff, J. (1980) Subclasses of external adenosine receptors. Proc. Natl. Acad. Sci . 77: 2551-2554 37. Lytton J., Westlin M. and Hanley M. R. (1991). Thapsigargin inhibits the sarcoplasmic or endoplasmic reticulum Ca-ATPase family of calcium pums. Biol. Chem. 266, 17067-17071. 38. Mackgrill J. J. and Lai F. A. (1994). Solubilization of the type 3 ryanodine receptor from rabbit brain. Biophys. J. 66, A147 39. McPherson P. S., Kim Y. K., Valdivia H., Knudson C. M., Takekura H., Franzini-Armstrong C., Coronado R. and Campbell K. P. ( 1991). The brain ryanodine receptor: A caffeine-sensitive calcium release channel. Neuron 7, 17-25. 40. N.Voitenko, S.Kirischuk, A.Kulik, A.Verkhratsky (1995) Calcium signalling in granule neurones of the mouse cerebellar slices // Pflugers Archiv Europe an Journal of Physiology, v.430, Supplement 4, R124. 41. Nicholls D.G. (1985) A role for the mitochondria in the protection of the cell against calcium overload. Prog. Brain Res. 63, 97-106. 42. Pintor, J., Diaz-Rey, M. A., Torres, M., Miras-Portugal, M . T. (1992) Presence of diadenosine polyphosphates-A p4 A and A p5 A-in rat brain synaptic terminals. Ca 2+ -dependent release evoked by 4-aminopyridine and veratridine. Neurosci. Lett . 136: 141-144 43. Ribeiro, J. A., Sebastiao, A. M. (1986) Adenosine receptor s and calcium: basis for proposing a third (A 3 ) adenosine receptor . Prog. Neyrobiol. 26: 179-209 44. Rios E. and Pizarro C. (1991) Voltage-sensor of excitation-contraction coupling in skeletal muscle. Physiol. Rev . 76, 849 - 908 45. Ross C. A., Danoff S . K., Schell M. J., Snyder S. H. and Ullrich A. (1992). Three additional inositol 1,4,5-trisphosphate receptors: Molecular cloning and differential localization in brain and peripheral tissues. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89, 4265-4269. 46. S.Kirischuk , N.Voitenko, P.Kostyuk, A.Verkhratsky (1995) Calcium signalling in granule neurones studied in cerebellar slices // Cell Calcium v.18, 464-476 47. S.Kirischuk, N.Voitenko, P.Kostyuk, A.Verkhratsky (1996) Age-associated Changes of Citoplasmic Calcium Home ostasis in Cerebellar Granule Neurones in situ : Investigation on Thin Cerebellar Slices. // Experimental Gerontology 48. S.Kirischuk, N.Voitenko, T.Moller, H.Kettenmann and A.Verkhratsky (1995) ATP-induced cytoplasmic calcium mobilization in bergman glial cells // J. Neuroscience v.15, 8234-8248. 49. Scheggerburger R., Zhou Z., Konnerth A. and Neher E. (1993). Fractional contribution of calcium to the cation current through glutamate receptor channels. Neuron 11, 133-143. 50. Sergej Kirischuk and Alexej Verkhratsky (1996) [Ca 2+ ] i recordings from neural cells in acutely isolated cerebellar slices employing differential loading of the membrane-permeant form of the calcium indicator fura-2 // Pflugers Arch. -Eur. J. Physiology v.431, 977-983 51. Sergej Kir ischuk, Nana Voitenko, Platon Kostyuk, Alexej Verkhratsky (1996) Calcium signalling in granule neurones studied in cerebellar slices // Cell Calcium v.19, 59-71 52. Shmigol A., Kirischuk S., Kostyuk P. and Verkhratsky A. (1994). Different properties of ca ffeine-sensitive Ca 2+ stores in peripheral and central mammalian neurones. Pfl ь gers Arch. 426, 174-176. 53. Shmigol, D.Eisner & A.Verkhratsky (1995): Cyclic ADP ribose enhances Ca 2+ -induced Ca 2+ release in mouse sensory neurones. Journal of Physiology, London, v. 483P, p63P. 54. Shmigol, N. Svichar, P. Kostyuk & A. Verkhratsky (1996) Gradual caffeine-induced Ca 2+ release in mice DRG neurones is controlled by cytoplasmic and intraluminal Ca 2+ . Neuroscience, 73 N 4, 1061-1067 55. S hmigol, P. Kostyuk & A. Verkhratsky (1995): Thapsigargin blocks plasmalemmal voltage-operated calcium channels in mouse DRG neurones. Journal of Physiology, London, v. 483P, p64P. 56. Soltoff, S. P., McMillian, M.K., Talamo, B.R., Cantley, L. C.(1993) Blo ckade of ATP binding site of P 2 purinoceptors in rat parotid acinar cells by isothiocyanate compounds. Biochem. Pharmacol . 45: 1936-1940 57. Tatsumi H. and Katayama Y. (1993) Regulation of intracellular free calcium concentration in acutely dissociated ne urones from rat nucleus basalis. J.Physiol., Lond. 464,165-181. 58. Tepikin A. V., Kostyuk P. G., Snitsarev V. A. and Belan P. V. (1992a). Extrusion of calcium from a single isolated neuron of the snail Helix pomatia . J. Membrane Biol. 123, 43-37. 59. Th ayer S.A. and Miller R.J. (1990) Regulation of the intracellular free calcium concentration in single rat dorsal root ganglion neurones in vitro. J.Physiol. (London) , 425, 85 - 115. 60. Ursula Windscheif, (1996) Purinoceptors: from history to recent prog ress. Review. J. Pharm. Pharmacol. 48: 993-1011 61. Van Calker, D., Muller, M., Hamprecht, B. (1979) Adenosine regulates via two different types of receptors, the accumulation of cyclic AMP in cultured brain cells. J. Neurochem . 33: 999-1005 62. Verk hratsky & A.Shmigol (1996) Calcium-induced calcium release in neurones. Cell Calcium , v.19, No 1 , 1-14. 63. Voitenko N., Kirischuk S., Verkhratsky A. (1995) Mechanisms of cytoplasmic calcium signalling in cerebellar granule neurones in situ. // Експеримен тальна та клінічна фізіологія , збірник наукових праць до 100- річчя кафедри фізіології Львівського медичного університету , р .357. 64. Zhou Z. and Neher E. (1993). Calcium permeability of nicotininc acetylcholine receptor channels in bovine adrenal chromaff ine cells. Pflugers Arch. 425, 511-517. 65. Zhou Z. and Neher E. (1993). Mobile and immobile calcium buffers in bovine adrenal chromaffin cells. J.Physiol., Lond. 469, 245-273.