Выявление генетических вариантов геномной ДНК у патогенных штаммов стафилококка золотистого

Глава 1. Обзор источников по теме исследования 3
1.1. Характеристика возбудителя золотоститого стафилококка 3
Глава 2. Методы идентификации патогенных штаммов золотистого стафилококка 17
1.1. Метод двойного расщепления и избирательного мечения 19
1.2. ПГЭ-метод 20
Глава 3. Идентификация патогенных бактериальных штаммов золотистого стафилакокка 24
3.1. Описание возбудителя 24
3.2. Проведение исследования Дрим-методом 24
3.3. Результаты исследования 26
3.4. Вывод по проделанной работе 28
Список использованных источников 30

1.1. Метод двойного расщепления и избирательного мечения
На сегодня самым точным методом генотипирования является метод ДРИМ (двойное расщепление и избирательное мечение), который впервые был разработан для клинических изолятов патогенных микроорганизмов Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus и Salmonella spp. [8,18].
Метод основан на одновременном расщеплении геномной ДНК микроорганизма двумя рестрикционными эндонуклеазами и избирательном мечении отдельных фрагментов ДНК. Одна из рестриктаз при расщеплении ДНК образует ограниченное число фрагментов с так называемыми 3'-усеченными «липкими концами». Присутствие в реакционной смеси фермента Taq-полимераза и метки биотинилированный дезоксицитозинтрифосфат (Bio-14-dCTP, Invitrogen™) обеспечивает эффективное мечение фрагментов ДНК, имеющих хотя бы один 3'- усеченный конец в реакции достройки (fill-in reaction).
...

1.2. ПГЭ-метод
Макрорестрикционный анализ ДНК микроорганизмов с использованием гель-электрофореза в пульсирующем поле (PFGE-ти-пирование, пульс-электрофорез) используется в молекулярной биологии для изучения клональной структуры и типирования возбудителей инфекционных заболеваний. Гель-электрофорез в пульсирующем поле (пульс-электрофорез; англ. Pulsed Field Gel Electrophoresis; PFGE) - один из широко используемых в молекулярной биологии методов, позволяющих за счет периодически изменяющегося направления напряженности электрического поля, прилагаемого к агарозной пластине с нанесенными на нее образцами, разделять фрагменты ДНК большого размера (от нескольких сотен тыс.пар нуклео-тидов - т.п.н. - до нескольких млн п.н.) [28]. В настоящее время метод пульс-электрофореза сохраняет свою актуальность и находит применение в различных фундаментальных и прикладных областях молекулярной биологии и генетики.
...

3.2. Проведение исследования Дрим-методом
Поиск in silico, используя компьютерную программу [9], доступную на сайте http://insilico.ehu.es/ в отношении золотистого стафилококка позволил подобрать фермент рестрикции Cfr9I (Thermo Fisher Scientific™), который можно использовать в качестве продуцента фрагментов ДНК с усеченными концами. Программа позволяет проводить симуляцию эксперимента. Для этого необходимо выбрать опцию «DDSL», далее выбрать две эндонуклеазы рестрикции. Программа рассчитывает теоретическое количество фрагментов ДНК и их распределение в агарозном геле при генотипировании.
Естественно, реальное распределение фрагментов на полевых изолятах отличается от теоретически ожидаемой картины, получаемой на референтном штамме из базы данных NCBI секвенированных геномов бактерий. В качестве второй эндонуклеазы рестрикции оптимальным оказался фермент HaeII (Thermo Fisher Scientific™).
...

3.3. Результаты исследования
Результат генотипирования методом ДРИМ проявляется в виде набора около 45 фрагментов ДНК типа «штрих-кода», характерного для каждого бактериального штамма (рис. 13). После оптимизации метода было проведено генотипирование изолятов. Валидацию метода ДРИМ проводили в сравнении с ПГЭ.

Рисунок 13. Генотипирование методом ДРИМ 16 изолятов S. aureus (дорожки 1-8, изоляты из инфицированных кур, дорожки 9-16 - индеек). М – маркер размеров фрагментов ДНК, выраженный в парах нуклеотидов.

В анализ брали 15 изолятов антибиотикорезистентных Staphylococcus aureus (MRSA), которые генотипировали одновременно указанными двумя методами (таблица 1).
Таблица 1.
...

3.4. Вывод по проделанной работе
Таким образом, генотипирование методом ДРИМ, хорошо зарекомендовавшее себя на ряде видов бактерий, может использоваться при идентификации штаммов S. aureus. Дискриминационная способность метода не уступает таковой пульс-гель электрофореза, при этом генотипирование может быть проведено в течение одного дня без использования дорогостоящего и специализированного оборудования.

Заключение
В процессе работы были изучены особенности функционирования предприятия. Были рассмотрены регламенты, техника безопасности предприятия, изучено оборудование производства. Была достигнута цель производственной практики (научно-исследовательской работы) - приобретение практических умений и навыков самостоятельной научно-исследовательской работы.
...