Определение хлорамфеникола в молоке методом иммунохроматографического анализа

Оглавление
1 Введение 2
2 Обзор литературы 4
2.1 Иммунохроматографический анализ 4
2.1.1 Общие принципы ИХА 4
2.1.2 Основные компоненты тест-систем 7
2.1.3 Метки в иммунохроматографическом анализе 9
2.2 Хлорамфеникол. 15
2.3 Существующие методы определения хлорамфеникола. 16
3 Экспериментальная часть 19
3.1 Химические реагенты и биологические препараты 19
3.2 Оборудование 19
3.3 Приготовление растворов 20
3.4 Методы исследований 20
3.4.1 Получение конъюгатов сукцината ХАФ с БСА (ХАФ-БСА) 20
3.4.2 Получение наночастиц золота 21
3.4.3 Получение конъюгата наночастиц золота с антителами 21
3.4.4 Изготовление иммунохроматографической тест-полоски 21
3.4.5 Проведение иммунохроматографического анализа 22
3.5 Определение аналитических характеристик 22
4 Результаты и их обсуждение 23
4.1 Получение иммунореагентов 23
4.2 Разработка иммунохроматографической тест-системы для определения ХАФ 25
4.3 Определение хлорамфеникола в молоке. 29
5 Выводы 32
6 Список литературы 33

Введение ПАВ может оказывать влияние на следующие процессы:
• Капиллярная скорость протекания раствора вдоль мембраны.
Чтобы придать смачиваемость мембране, в ее поры вводят определенное количество ПАВ. Чаще всего это количество обеспечивает максимальную скорость потока жидкости вдоль мембраны.
• Адсорбция белков.
Введение различного рода ПАВ может оказать сильное влияние на сорбционные свойства мембраны. Избыток вводимых веществ может приводить к уменьшению количества белка, которое способна сорбировать на себе мембрана.
• Эффективность прохождения реагентов вдоль мембраны.
Эффективность прохождения реагентов вдоль мембраны напрямую обусловлена смачиваемостью мембраны. Количество ПАВ следует выбирать так, чтобы оптимизировать параметры сорбции реагентов по мембране и ширину окрашенной полосы, которая будет сохраняться на протяжении всего анализа.
• Ширина полосы.
...

2.1.1 Общие принципы ИХА
Иммунохроматографический метод анализа (ИХА) основан на принципах тонкослойной хроматографии и включает в себя реакцию между антигеном и соответствующим ему антителом с образованием специфических иммунокомплексов, которые можно регистрировать визуально при помощи меток [2]. В качестве меток используют окрашенные латексы, квантовые точки, магнитные частицы и другие. Но наиболее широкое распространение в методах ИХА получили наночастицы золота (НЧЗ) благодаря легкости получения частиц заданного размера и высокой чувствительности визуальной детекции [4].
ИХА проводится при помощи специальных мембранных полосок, которые включают в себя все необходимые реагенты, т.е. для проведения анализа достаточно лишь добавить анализируемый образец. Тест-полоска состоит из четырех частей (рис. 1), размещенных на опорной пластинке (как правило, пластиковой) [1].
1.
...

2.1.2 Основные компоненты тест-систем
Аналитическая мембрана.
Аналитическая мембрана тонкая и хрупкая, поэтому она крепится на пластиковый или нейлоновый опорный слой, чтобы ее можно было резать и брать руками. Чаще всего ее делают из нитроцеллюлозы, хотя используют и другие доступные материалы, например нейлон, полиэфирсульфон, полиэтилен.
Размер пор мембран на основе нитроцеллюлозы составляет от 0,05 до 15 мкм. Однако не только размер пор мембраны и материал, из которого она сделана, но и скорость переноса анализируемого образца вдоль полоски играет роль, поскольку она влияет на оптимальное время анализа [2].
На аналитической мембране располагаются иммобилизованные компоненты – специфические иммунореагенты. Обычно их наносят на специальном приборе в виде узких линий, находящихся недалеко друг от друга. Материал мембраны влияет на ее сорбционные свойства.
...

2.1.3 Метки в иммунохроматографическом анализе
Метка играет огромную роль в быстрых иммунохроматографических анализах, поскольку с ее помощью можно оценить результат визуально, не прибегая к дополнительным процедурам или использованию специального оборудования.
Идеальная метка для анализа должна [5]:
• регистрироваться несколькими методами или технологиями в очень большом диапазоне;
• просто и эффективно связываться с биологическими веществами в конъюгаты без потери химической и биологической активности;
• обладать низким или вообще не обладать неспецифическим взаимодействием, то есть отношение сигнал/шум в многокомпонентных системах должно быть наибольшим;
• быть устойчивой в данных химических условиях анализа и при данной температуре;
• быть коммерчески доступной, иметь низкую стоимость;
• легко переносится потоком жидкости;
• быть способной к использованию для обнаружения нескольких аналитов.
...

2.2 Хлорамфеникол.
Хлорамфеникол (ХАФ) или левомицетин является антибиотиком широкого спектра действия. Название по ИЮПАК: D-(-) – трео-1-(n-нитрофенил)-2дихлор-ацетиламино-1,3-пропандиол (рис. 4). Он активен к грамположительным и грамотрицательным бактериям, а также к штаммам, устойчивым к пенициллину, стрептомицину, сульфаниламидам. Устойчивость микроорганизмов к хлорамфениколу вырабатывается медленно [3]. ХАФ был одним из первых антибиотиков, которые стали получать синтетически в промышленных масштабах.
ХАФ используют для лечения таких заболеваний, как менингит, холера, чума, брюшной тиф, конъюнктивит . В настоящее время он сравнительно мало используется в медицине, поскольку имеет множество побочных эффектов, таких как апластическая анемия, лейкемия, угнетение головного мозга. Также у людей, принимающих данный антибиотик, были описаны головная боль, легкая депрессия, спутанность сознания и делирий. Ввиду этого ХАФ используется только в случаях, когда нет альтернативы.
...

2.3 Существующие методы определения хлорамфеникола.
На сегодняшний день существует множество методов определения хлорамфеникола в пищевых продуктах как физико-химических, так и иммунохимических.
Хроматографические методы для определения ХАФ применяют уже сравнительно давно. Предложено большое число вариантов таких методов с применением различных видов хроматографии, условий ее проведения и способов детектирования. Одним из часто встречающихся методов является газовая хроматография в сочетании с электронно-захватным детектором [30] или с масс-спектрометром [31].
Еще один широко применяемый метод – высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) [32]. Она позволяет измерять концентрацию ХАФ в молоке с разной степенью точности.
...

3.1 Химические реагенты и биологические препараты
В работе использовали следующие реагенты: золотохлористоводородную кислоту (ЗХВК), Твин 20 («Fluka», Швейцария); хлорамфеникол, сукцинат хлорамфеникола, 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)-карбодиимид хлорид , N–гидроксисукцинимид, бычий сывороточный альбумин (БСА), цитрат натрия («Sigma», США); диметилформамид (ДМФА), карбонат, азид, хлорид натрия; одно- и двузамещенные фосфаты калия, сахарозу («Химмед», Россия), поликлональные антитела к ХАФ, белок А стафилококка (ЗАО «НВО Иммунотех», Россия).
В мультимембранных тест-полосках для иммунохроматографии использовали следующие мембраны:
• аналитические нитроцеллюлозные мембраны – CNPC (размер пор 15 µ) (MDI, Индия);
• мембраны для нанесения конъюгата – РТ-5 (MDI, Индия));
• мембраны для нанесения образца – GFB-R7L, GFB-R4, (MDI, Индия), MAPDS-0300 (Arista Biologicals, США);
• абсорбирующая мембрана – АР045 (MDI, Индия).
Образцы молока были взяты из торговой сети.
...

3.2 Оборудование
Измерение рН проводили на рН-метре фирмы «Mettler-Toledo» (Швейцария) с точностью до 0,02 ед. рН, измерение рН растворов коллоидного золота проводили с использованием рН-полосок фирмы Fisher (США) с диапазоном определения рН от 5 до 9 единиц.
Навески реагентов взвешивали на электронных весах «Mettler-Toledo» (Швейцария) с точностью до 0,1 мг.
Измерения оптического поглощения проводили на спектрофотометре Shimadzu UV-1202 («Shimadzu», Япония).
Нанесение конъюгатов ХАФ с БСА на мембрану производили при помощи автоматического диспенсера бесконтактного типа BioDot XYZ 3050 (BioJet Quanti 3000, BioDot, США).
Для резки тест-полосок использовали резак гильотинового типа Index Cutter-I, (A-Point Technologies, США).
Центрифугирование производили, используя Eppendorf 5810R (Eppendorf, Германия).
...

3.4.3 Получение конъюгата наночастиц золота с антителами
К 1 мл раствора коллоидного золота с pH 7,0-7,5 (10 мкл/мл 0,1 М раствора Na2CO3) добавляли по каплям 100 мкл раствора антител (0,22 мг/мл в деионизованной воде), перемешивали 30 минут при комнатной температуре. После чего добавляли 20% раствор БСА до конечной концентрации 0,2%, выдерживали 20 минут при комнатной температуре, затем вводили 50% раствор сахарозы (до 10%) и азид натрия (до 0,01%) и хранили при температуре +4˚С.
Для удаления несвязавшихся антител конъюгат центрифугировали (30 мин, 11000g, 4˚С). Супернатант удаляли, осадок перерастворяли в требуемом объеме ФБ, содержащего 0,1% БСА, 10% сахарозы и 0,01% азида натрия. Полученный раствор наносили на полоску стекловолоконной мембраны 4×4 мм из расчета 5 мкл на полоску.
3.4.
...

3.4.4 Изготовление иммунохроматографической тест-полоски
На аналитическую нитроцеллюлозную мембрану CNPC(15µ) наносили раствор конъюгата ХАФ-БСА в выбранной концентрации в ФБС с помощью программируемого автоматического диспенсера BioDot XYZ 3050 (BioJet Quanti 3000, BioDot, США) для формирования аналитической зоны. Для формирования контрольной зоны иммунохроматографической системы на расстоянии 5 мм от аналитической наносили раствор белка А с концентрацией 1 мг/мл в ФБС. Использовали следующие параметры насоса BioJet Quanti 3000 для нанесения образцов: размер капли – 30 нл, шаг – 0,3 мм, скорость – 50 мм/сек. Полоски высушивали при температуре 37˚С (относительная влажность 25-30%) в течение 24 ч и хранили при комнатной температуре в герметично закрытой упаковке.
Растворы конъюгатов антител с наночастицами коллоидного золота наносили на мембраны РТ-5 и высушивали на воздухе при комнатной температуре. Собирали тест-полоски в соответствии со схемой на рис. 1.
3.4.
...

3.5 Определение аналитических характеристик
При выявлении промахов использовали тест Граббса и Q-критерий.
Предел обнаружения определяли как концентрацию, соответствующую значению интенсивности сигнала градуировочной кривой
За предел определения принимали концентрацию, соответствующую значению интенсивности сигнала градуировочной кривой , где , – значение интенсивности сигнала каждого измерения пробы при отсутствии аналита, – среднее значение интенсивности сигнала пробы при отсутствии аналита, n – количество измерений (n=10).
Предел обнаружения при визуальной регистрации определяли как минимальную концентрацию антибиотика, при которой не наблюдается окрашенной линии в тестовой зоне.
Воспроизводимость анализа. Проводили по пять повторных измерений стандартных растворов ХАФ. Рассчитывали стандартное отклонение и относительное стандартное отклонение для каждого раствора по формуле:
.
...

4 Результаты и их обсуждение
При разработке тест-системы для определения хлорамфеникола использовали непрямую схему конкурентного иммунохроматографического анализа с конъюгатом ХАФ-БСА и мечеными наночастицами золота поликлональными антителами против ХАФ (рис. 3). В присутствии определяемого антигена (ХАФ) в образце по мере продвижения вдоль полоски происходит образование комплекса антигена с мечеными наночастицами золота специфическими антителами (Ат-НЧЗ), сорбированными на стекловолоконной мембране. Далее образовавшийся иммунокомплекс под действием капиллярных сил движется в направлении тестовой зоны с иммобилизованным конъюгатом ХАФ-БСА. В случае образования комплекса между специфическими антителами, мечеными НЧЗ, с иммобилизованным в составе конъюгата ХАФ-БСА хлорамфениколом наблюдается появление окрашенной полосы, интенсивность которой уменьшается при увеличении концентрации ХАФ в образце.
...

4.1 Получение иммунореагентов
Первоочередная задача в ходе разработки метода ИХА для определения ХАФ состояла в получении иммунохимических реагентов. Для иммобилизации в тестовой зоне синтезировали конъюгаты сукцината ХАФ с БСА (в соотношении 20:1 и 5:1) по методу активированных эфиров (с использованием водорастворимого карбодиимида и N-гидроксисукцинимида). Метод включает в себя активацию карбоксильной группы сукцината ХАФ путем образования N-гидроксисукцинимидного эфира и взаимодействия последнего с аминогруппой лизина белка с образованием пептидной связи (рис. 5).

Рис. 5. Схема синтеза конъюгата ХАФ-БСА
Выбор данного метода синтеза конъюгатов обусловлен тем, что, по сравнению с использованием одного карбодиимида, он дает меньше побочных продуктов и обеспечивает более высокий выход продукта за счет формирования лучшей уходящей группы и более стабильного промежуточного продукта. Для иммобилизации использовали концентрацию полученных конъюгатов 0,5 мг/мл в ФБС.
...

4.2 Разработка иммунохроматографической тест-системы для определения ХАФ
Разработка тест-системы происходила в несколько этапов. На первом из них изучали влияние количества сорбированных специфичных к ХАФ антител на поверхности наночастиц золота и состава конъюгата ХАФ-БСА на аналитические характеристики метода.
Для этого сравнивали интенсивности сигналов при концентрациях хлорамфеникола 0 и 1 нг/мл в ФБСТ. Концентрации иммунореагентов были одинаковы. Результаты приведены на рис. 7.

Рис. 7. Зависимость интенсивности сигнала от состава иммунореагентов
Чтобы понять, во сколько раз изменяется интенсивность при повышении концентрации ХАФ от нуля до единицы, считали отношение I1/I0, где I1 – интенсивность сигнала при концентрации ХАФ 1нг/мл, а I0 – интенсивность сигнала при отсутсвии ХАФ в растворе. Результаты представлены в таблице 1.
Таблица 1.
...

4.3 Определение хлорамфеникола в молоке.
Задача настоящей работы заключалась в создании тест-системы для определения остаточных количеств ХАФ в цельном молоке.
Прежде всего необходимо было подобрать условия для свободного протекания анализируемого образца вдоль тест-полоски, поскольку молоко является достаточно сложной биологической жидкостью, и в неразбавленном виде плохо течет по мембране. Для проведения анализа молоко разбавляли в 4 раза ФБСТ (разбавление молока в 2 раза было недостаточным), предел обнаружения разработанного метода позволяет это делать.

Рис. 9. Градуировочные зависимости в молоке (1:3 в ФБСТ) и в буферном растворе
Из градуировочных зависимостей на рис. 9 видно, что кривые, полученные на основе стандартных растворов ХАФ в буферном растворе и на основе стандартов ХАФ в разбавленном молоке (3,2%, Домик в деревне) сильно расходятся.
...

6