Инженерная энзимология.

Оглавление
Введение 3
Инженерная энзимология 4
Иммобилизованные ферменты 6
Носители для иммобилизованных ферментов 7
Органические полимерные носители 7
Синтетические полимерные носители 8
Носители неорганической природы 9
Методы иммобилизации ферментов 9
Иммобилизация ферментов на носителях, обладающих гидроксо-группами 13
Иммобилизация ферментов носителях, обладающих аминогруппами 13
Иммобилизация на носителях, обладающих активированными производными карбоксильной группы 14
Иммобилизация на носителях, обладающих сульфгидрилъными группами 14
Использование 17
Заключение 17
Список использованной литературы 18

Инженерная энзимология

Инженерная энзимология - это отрасль биотехнологии, базирующаяся на использовании каталитических функций ферментов (или ферментных систем) в изолированном состоянии или в составе живых клеток для получения соответст­вующих целевых продуктов. Биообъект здесь - фермент (или комплекс ферментов).

Развитие прикладной энзимологии долгое время сдерживалось дороговизной чистых ферментных препаратов, неустойчивостью их при хранении и невозможностью многократного использова­ния. Принципиально новые перспективы открылись перед при­кладной энзимологией в 60-е годы XX в. в результате появления на стыке химии и биологии новой отрасли - инженерной энзи­мологии. Ее задачи заключаются в развитии прогрессивных мето­дов выделения ферментов, их стабилизации и иммобилизации, а также разработке научных основ их применения. Слово "инженерная" здесь привносит свою специфику, заключающуюся в акценте на целенаправленное создание конструкции (от франц.
...

Иммобилизованные ферменты

Иммобилизованными ферментами называются ферменты, ис­кусственно связанные с нерастворимым в воде носителем, но сохраня­ющие свои каталитические свойства. При этом нерастворимый носитель представляет собой частицу (гранулу, нить, пространственную конструкцию с развитой поверхностью) размер которой на много порядков больше размера самой крупной молекулы фермента. Такую частицу можно видеть невооруженным глазом, держать в руках, загружать в различные устройства. Таким образом ферментативный катализ из гомогенного процесса, протекающего во всем объеме реакционной среды, превращается в гетерогенный, протекающий на поверхности такого носителя.
Еще в 1916 г. Дж. Нельсон и Е. Гриффин показали, что фермент сахараза, сорбированная на угле, сохраняла свою каталитическую ак­тивность, но лишь в 1953 г. Н. Грубхофер и Д.
...

Носители для иммобилизованных ферментов

Считается, что идеальные материалы, используемые для иммобилизации ферментов, должны обладать следующими основ­ными свойствами: нерастворимостью в воде; высокой химической и био­логической стойкостью; значительной гидрофильностью (смачиваемостью); доста­точной проницаемостью, как для ферментов, так и для коферментов, субстратов и продуктов реакции; способностью носителя легко активироваться (переходить в реакционно-способную форму). Кроме того, материал носителя должен быть нетоксичным для человека и микроорганизмов-продуцентов, а так же не влиять на физико-химические свойства реакционной среды (значение рН, концентрацию определенных ионов), которые могут повлиять на активность фермента.
Естественно, ни один из используемых в настоящее время в качестве носителя материал не отвечает полностью перечислен­ным требованиям. Тем не менее, существует широкий набор носи­телей, пригодных для иммобилизации определенных энзимов в конкретных условиях.
...

Органические полимерные носители

Иммобилизация многих ферментов осуществляется на полимерных носителях органичес­кой природы. Существующие органические полимерные носите­ли можно разделить на два класса: природные и синтетические полимерные носители. В свою очередь, каждый из классов орга­нических полимерных носителей подразделяется на группы в за­висимости от их строения. Среди природных полимеров выделя­ют белковые, полисахаридные и липидные носители, а среди синтетических- полиметиленовые, полиамидные и полиэфир­ные.
К преимуществам природных носителей следует отнести их доступность, полифункциональность и гидрофильность, а к недо­статкам - биодеградируемость и достаточно высокую стоимость.
Из полисахаридов для иммобилизации наиболее часто исполь­зуют целлюлозу, декстран, агарозу (агар) и их производные. Для прида­ния химической устойчивости линейные цепи целлюлозы и декстрана поперечно сшивают эпихлоргидрином.
...

Носители неорганической природы

В качестве носителей наи­более часто применяют материалы из стекла, глины, керамики, графитовой сажи, силикагеля, а также силохромы, оксиды ме­таллов. Их можно подвергать химической модификации, для чего носители покрывают пленкой оксидов алюминия, титана, гаф­ния, циркония или обрабатывают органическими полимерами. Основное преимущество неорганических носителей - легкость регенерации, механическая и химическая прочность. Подобно синтетическим полимерам неорганическим носителям можно придать любую форму и получать их с любой степенью пористости.
Таким образом, к настоящему времени создано огромное число разнооб­разных носителей для иммобилизации ферментов. Однако для каж­дого индивидуального фермента, используемого в конкретном тех­нологическом процессе, необходимо подбирать оптимальные варианты, как носителя, так и условий и способов иммобилизации.
...

Методы иммобилизации ферментов

Существуют два принципиально различных метода иммобили­зации ферментов: без возникновения ковалентных связей между ферментом и носителем (физические методы иммобилизации) и с образованием ковалентной связи между ними (химические методы иммобилизации). Каждый из этих методов осуществляется разными способами.

Рис.3. Методы иммобилизации ферментов (ф-молекула фермента)

Физические методы иммобилизации ферментов реализуются либо посредством адсорбции фермента на нерастворимом носителе, либо путем включения их в поры поперечносшитого геля, в по­лупроницаемые структуры или различные двухфазные системы.
Адсорбция ферментов на нерастворимых носителях. При ад­сорбционной иммобилизации белковая молекула удерживается на поверхности носителя за счет электростатических, гидрофобных, дисперсионных взаимодействий и водородных связей. Адсорбция была первым методом иммобилизации ферментов (Дж. Нель-сон, Э.
...

Иммобилизация на носителях, обладающих сульфгидрилъными группами

Сульфгидрильные группы носителя и фермента легко окисляются с образова-нием дисульфидных связей под действием кислорода воздуха:
 

Рассмотренные выше методы иммобилизации универсальны для всех видов иммобилизованных биокатализаторов - индивидуальных ферментов, клеток, субклеточных структур, комбинированных препаратов.
Несмотря на все преимущества иммобилизованных ферментов перед неиммобилизованными их широкое применение сдерживается несколькими отрицательными факторами.

1. Прежде всего это высокая стоимость получения таких препаратов. Фермент сначала нужно получить, выделить его в чистом виде и затем провести процедуру иммобилизации.
2. Многие ферменты-протеиды, содержащие коферментные группы или кофакторы невозможно выделить в чистом виде без потери активности.
3. Процессы иммобилизации, как правило, проводятся вслепую и часто сопровождаются снижением активности фермента.
4.
...

Использование иммобилизованных клеток имеет и целый ряд недостатков:
1. Иммобилизованная живая клетка в отличие от молекулы фермента нуждается в питательной среде и выделяет различные метаболиты, что приводит к загрязнению целевого продукта.
2. Аэробные клетки нуждаются в кислороде и выделяют углекислый газ. Поэтому такой ферментер необходимо снабжать системами аэрирования, отвода газов и пеногашения, что усложняет и удорожает его конструкцию.

3. Растущие в размерах и делящиеся клетки разрушают структуру носителя. Образующиеся при делении дочерние клетки, покидая носитель, загрязняют целевой продукт. Поэтому в промышленных процессах для иммобилизации чаще используют покоящиеся клетки или споры бактерий. Для подавления роста иммобилизованных клеток растений используют дефицит фитогормонов, а рост клеток бактерий тормозят добавлением антибиотиков.
4. Большинство клеточных ферментов являются эндометаболитами, т.е. локализованы внутри клетки.
...