Почвенные и водные бактерии деструкторы полигидроксиалканоатов

Введение

1.1 Характеристика полигидроксиалканоатов

1.2 Области применения полигидроксиалканоатов

1.4 Выявление микроорганизмов-деструкторов

2.1 Объекты исследования микробной деградации в пресной воде

2.2 Объекты исследования микробной деградации в почве

2.2.1 Основные характеристики почвы дендрария

2.2.2 Определение активной кислотности почвы прикорневой зоны лиственницы

2.3 Определение способности бактерий к биодеградации

3.1 Исследование микробной биодеградации полигидроксибутирата и полигидроксигексаноата в прикорневой зоне лиственницы

Заключение

Список используемых источников

Введение

Одним из решений экологической проблемы утилизации и переработки полимерных отходов является получение биоразлагаемых материалов. Возможность получения полимеров, сохраняющих эксплуатационные характеристики в период потребления, а затем разлагающихся под воздействием природных факторов на углекислый газ, воду, гуминовые вещества и биомассу. Перспективными полимерами данного типа являются полигидроксиалканоаты (ПГА). Это группа полиэфиров, синтезируемых многими бактериями в качестве источника внутриклеточного углерода и запасаемого источника энергии [1,7].
Биологическая деградация ПГА осуществляется под воздействием ферментов-деполимераз, продуцируемых микроорганизмами, которые используют растворимые продукты расщепления полимеров в качестве субстрата для роста.
...

1.1 Характеристика полигидроксиалканоатов

Полигидроксиалканоаты (ПГА) являются запасными веществами в клетках бактерий. Они аккумулируются внутриклеточно в форме включений (гранул) и их масса может составлять до 90% от сухого веса клетки [4,5].
Мономерное строение полигидроксиалканоатов зависит от видовой специфики, условий роста и, особенно источника углерода в среде. Классифицируют ПГА по числу атомов углерода в мономере. Они могут быть короткоцепочечными (ПГАсцл, содержат 3-5 атомов углерода), среднецепочечными (ПГАмцл, 6-15 углеродных атомов) и длинноцепочечными (ПГАлцл, содержат более 15 атомов углерода). Многие бактерии могут одновременно синтезировать ПГАсцл и ПГАмцл, то есть являются гетерогенными [17].
Наиболее изученными из полигидроксиалканоатов являются полигидроксибутират и его сополимеры с оксивалериановой кислотой [4].
Полигидроксибутират (ПГБ) способны накапливать различные прокариотные микроорганизмы.
...

1.2 Области применения полигидроксиалканоатов

ПГА, как уже было отмечено ранее, по ряду физико-химических свойств сходны с широко применяемыми и выпускаемыми в огромных количествах и неразрушаемыми в природной среде синтетическими полимерами типа полипропилена. Линейная структура молекул ПГА придает им свойство термопластичности и изменения прочности. При нагревании молекулярные цепи в ПГА легко сдвигаются относительно друг друга, в результате этого материал размягчается и приобретает текучесть. Данное технологическое свойство имеет большую коммерческую ценность, так как позволяет с использованием различных методов получать из этих полимеров разнообразные изделия. Масштабы применения ПГА в настоящее время сдерживаются достаточно высокой стоимостью, тем не менее сферы их применения постоянно расширяются.
...

1.4 Выявление микроорганизмов-деструкторов

Важным вопросом, решение которого необходимо для понимания закономерностей и механизма биоразрушения ПГА, является выявление и идентификация микроорганизмов-деструкторов этих полимеров. Среди деструкторов ПГА описаны представители бактерий разных родов: Bacillus, Pseudomonas, Alcaligenes, Comamonas, Rhodococcus, Rhodocyclus, Syntrophomonas, Ilyobacter, Terrabacter, Terracoccus, Brevibacillus, Agrobacterium, Duganella, Ralstonia, Gracilibacillus, Enterobacter, Matsuebacter, Rhodoferax, Variovorax и Acinetobacter, Azospirillum, Mycobacterium и Streptomyces и др. [29,54,40,13,6].
При описании и идентификации бактерий изучают их культуральные свойства – характерные особенности бактерий на плотных и жидких питательных средах. Морфологическая характеристика и организация клеток бактерий включает такие признаки, как форма и размеры клеток, их подвижность, наличие жгутиков и тип жгутикования, способность к спорообразованию.
...

2.1 Объекты исследования микробной деградации в пресной воде

Объектом исследования в настоящей работе были пресноводные тропические бактерии, обладающие способностью к биодеградации ПГА.
Материалом для исследования служили образцы полигидроксиалканоатов (ПГА) двух типов – гомополимера 3­гидроксимасляной кислоты (П3­ГБ) и сополимера 3-­гидроксимасляной и 3­гидроксивалериановой кислот (­П3ГБ/3­ГВ), имеющие близкие физико-химические свойства. Образцы помещали в чехлы из мелкоячеистого мельничного газа и погружали на глубину 0,3-0,5 м в искусственный водоем на климатической испытательной станции (г. Нячанг, Вьетнам) (Рисунок 1).

Рисунок 1 - Размещение чехлов с образцами полимеров
Морская научно-исследовательская и испытательная станция (МНИИС) «Дам Бай» расположена на острове Че в заливе Дам Бай (12º 14' с.ш., 109º 11' в.д.). Удалённость от моря ≈ 50 м. Является береговой и надводной станцией и занимает по площади 2 га на суше и 1,7 га морской акватории.
...

2.2 Объекты исследования микробной деградации в почве

Материалом для исследования являлась почва, взятая из прикорневой зоны лиственницы (Larix sibirica L.), в которую размещали полимерные пленки из гомополимера (П3ГБ) и сополимера поли-3-гидроксибутирата с 3-гидроксигексаноатом (П3ГБ/3ГГ). Объектом исследований служила микрофлора, выделенная из этой почвы. Эксперимент проводился на территории дендрария Института леса СО РАН им В.Н. Сукачева.
Для изучения процессов биодеструкции ПГА в почве, образцы полимеров в виде пленочных дисков массой 60±6.5 мг (диаметр 30 мм, толщина 80±7 мкм) в нейлоновых сетчатых контейнерах, размещали в почве на глубине 5 см в прикорневой зоне лиственницы (Larix sibirica L.) (рисунок 2).

Рисунок 2 - Полимерные образцы 3ГГ и 3ГБ заложенные в почву

Эксперимент проведен в течение полевого сезона 2012 года в период с 23 мая по 4 ноября. Выявление микроорганизмов-деструкторов ПГА проводили в четыре этапа через 1 месяц экспонирования.
...

2.2.1 Основные характеристики почвы дендрария

Биодеградацию ПГА исследовали в реальных природных условиях, в почве дендрария Института леса СО РАН. Сотрудниками Института леса СО РАН исследованы основные характеристики почвы дендрария и показано, что эта почва характерна для дерново-карбонатного типа. Этот тип почвы сформирован на известняках и других карбонатных почвообразующих породах под хвойными, лиственно-хвойными и широколиственными лесами. Профиль почвы состоит из гумусового горизонта мощностью от 10-15 до 30-40 см и подстилающей его карбонатной породы, окрашен в тёмно-серый цвет.
...

2.3 Определение способности бактерий к биодеградации

Определение биодеструктивной способности микромицетов изучали на среде следующего состава (г/л):
ПГБ - 5,0; NaNO3 - 2,0; KH2PO4 – 1,0; KCl, MgSO4×7H2O – 0,5; FeSO4×7H2O – 0,01; Пептон – 0,1; Дрожжевой экстракт «Difco» - 0,1; Агар – 20,0. Среда содержала в качестве источника углерода 0,25% порошкообразного полимера (ПГБ).
Рост микроорганизмов, обладающих ПГА­-деполимеразной активностью, сопровождался образованием вокруг колоний на поверхности ага­ризованной среды характерных прозрачных зон (Рисунок 3).

Рисунок 3 - Рост бактерий на среде с ПГА; 1 – деполимеразная активность

2.4 Методы идентификации микроорганизмов

Изучение фенотипических признаков микроорганизмов-деструкторов проводили стандартными микробиологическими методами [12,14]. При идентификации бактериальных изолятов проводили сравнительный анализ их морфологических, культуральных, биохимических свойств.
...

3.1 Исследование микробной биодеградации полигидроксибутирата и полигидроксигексаноата в прикорневой зоне лиственницы

Микробиологический анализ показал, что в контрольной почве количество бактерий на момент отбора образцов в июне и ноябре было значительно выше, чем в июле и октябре, что объясняется погодными условиями – лето было аномально жарким и сухим. Однако на поверхности полимерных пленок общая численность гетеротрофных бактерий варьировала незначительно (рисунок 7, приложение В).

Рисунок 7 - Общее количество почвенных бактерий (РПА)

По данным литературы полимер является субстратом для микроорганизмов, на нем формируются пленки обрастания, что приводит к увеличению численности микроорганизмов в пленках по сравнению с нативной почвой [3]. В наших исследованиях количество почвенных гетеротрофных бактерий в контрольной почве было выше, чем на поверхности образцов полимеров, или достоверно не отличалась.
...