Газовая хроматография и её применение в биологии и медицине

КУРСОВОЙ ПРОЕКТ
Дисциплина
Учебно-научный семинар по медицинскому материаловедению
Тема: «Газовая хроматография и её применение в биологии и медицине»
...

Оглавление

1. Сущность хроматографии……………………………………………………………….3
2. Краткая характеристика метода газовой хроматографии…………………………3
3. Газовая хроматография в медицине и биологии……………………………………10

3.2. Пиролиз микроорганизмов………………………………….……………………….11
3.1. Анализ жирных кислот и микроорганизмов………………………………………11
3.3. Гидролиз и экстракция компонентов микробных клеток………………………12

1. Сущность хроматографии
Хроматограафия — метод разделения и анализа смесей веществ, а также изучения физико-химических свойств веществ. Основан на распределении веществ между двумя фазами — неподвижной (твёрдая фаза или жидкость, связанная на инертном носителе) и подвижной (газовая или жидкая фаза, элюент).
Метод хроматографии был впервые применён русским учёным-ботаником Михаилом Семеновичем Цветом в 1900 году. Он использовал колонку, заполненную карбонатом кальция, для разделения пигментов растительного происхождения. Название метода связано с первыми экспериментами М.С.Цвета.
Компоненты анализируемой смеси вместе с подвижной фазой перемещаются вдоль стационарной фазы, которую обычно помещают в колонку (стеклянную или металлическую трубку). Если молекулы разных компонентов разделяемой смеси..

По мере продвижения по колонке вещества постоянно перераспределяются между фазами вследствие многократного повторения процессов сорбции-десорбции и разделяются из-за разницы в коэффициентах распределения. Затем разделенные вещества элюируются из хроматографической колонки потоком газа-носителя, регистрируются детектором и фиксируются на хроматограмме в виде пиков.Первым из колонки элюируется вещество с низким коэффициентом распределения, то есть хуже растворимое в жидкой фазе и более летучее при данной температуре. Соединение с высоким коэффициентом распределения, то есть лучше растворимое и менее летучее, задерживается колонкой и мигрирует медленнее.Выходящие из колонки вещества вместе с газом-носителем поступают, как было отмечено выше, в детектор, который реагирует на изменение какого-либо физического свойства проходящей через него газовой смеси. Сигнал детектора преобразуется в электрический, который после усиления передается регистрирующему прибору, например потенциометру. Зависимость величины сигнала детектора от времени называется хроматограммой. Такая хроматограмма имеет вид, представленный на рис. 1. Отдельное вещество проявляется на хроматограмме в виде пика.Рис. 1. Хроматографический пик и его параметры:– ввод пробы; АВ – время удерживания;СDE – хроматографический пик; АС – базовая линия;h-высота пика;– ширина хроматографического пика на половине его высоты.Как видно из рис. 1, хроматограмма имеет базовую линию. Она соответствует тому промежутку времени, в течение которого детектор регистрирует сигнал только от подвижной фазы. Хроматографический пик – кривая, описывающая постепенное увеличение концентрации вещества на выходе из колонки и постепенное ее уменьшение. Основными параметрами пика являются время удерживания, высота и ширина пика на половине его высоты, площадь пика. Время появления максимума пика на хроматограмме называется временем удерживания.Анализ методом ГЖХ проводится с помощью специального прибора – газового хроматографа, схема которого представлена на рис. 2.9810754295775Рис. 2. Схема газового хроматографа1– источник газа; 2-4 – регуляторы скорости потока газа; 5 – испаритель; 6 – газохроматографическая колонка; 7 – термостатирующее устройство; 8 – микрошприц для ввода пробы; 11 – детектор; 13 – усилитель; 14 – регистрирующее устройствоОсновными узлами газового хроматографа являются: источник газа-носителя, устройство для ввода пробы, хроматографическая колонка, термостатирующее устройство, детектор, блок регистрации и обработки результатов анализа.Устройство для ввода пробы имеет испаритель, в котором анализируемый раствор образца превращается в парообразное состояние и в таком виде поступает в колонку.В качестве подвижной фазы используются азот, аргон, водород, гелий. Они должны быть инертными по отношению к исследуемым веществам, твердым носителям и жидким фазам. Главным узлом хроматографа является газохроматографическая колонка. Она представляет собой прямую, спиральную или U-образную трубку, изготовленную из нержавеющей стали или стекла с внутренним диаметром от 2 до 4 мм. Наиболее часто используются колонки длиной 1–5 метра, заполненные твердым носителем с нанесенной жидкой фазой. Такие колонки называют насадочными (рис. 3).Рис. 3. Газохроматографические колонкиВ современных приборах используются капиллярные колонки (рис. 3), в которых неподвижная жидкая фаза наносится на внутреннюю поверхность капилляров. Капиллярные колонки изготавливаются из кварца или металла и имеют форму спирали. Внутренний диаметр таких колонок составляет 0,2–0,5 мм. Благодаря отсутствию твердого носителя значительно увеличивается скорость потока газа. Это, в свою очередь, приводит к сокращению продолжительности анализа. Высокая скорость потока газа позволяет использовать колонки огромной длины от 5 до 100 метров. Вследствие этогозначительно увеличивается эффективность и разрешающая способность колонок. Если насадочные колонки можно использовать для разделения смесей, содержащих не более 10–20 компонентов, то в капиллярных колонках их число может достигать несколько сотен.В качестве неподвижной фазы в ГЖХ применяют различные жидкости.По полярности их делят на три категории:– неполярные (сквален – высокомолекулярный насыщенный углеводород;апиезоны – сложные смеси углеводородов, полиалкилсилоксаны – силиконовые полимеры);– умеренно полярные (сложные эфиры двух- или трехосновных кислот:себациновой, фталевой, лимонной, фосфорной );– сильнополярные (полиэтиленгликоли, полиэфиры – сложные зфирыдвухосновных кислот и двухатомных спиртов, например неопентилгликольсукцинат).Применяемые жидкости должны удовлетворять таким требованиям, как низкая летучесть при рабочей температуре колонки, термическая устойчивость, химическая инертность, невысокая вязкость, способность растворять хроматографируемые вещества.Жидкая фаза наносится в виде тонкой пленки на твердый носитель, в качестве которого чаще всего используют диатомиты, состоящие главным образом из диоксида кремния. Они выпускаются под названием хромосорб, сферохром, целит и т.д. Носители изготавливают также из полимеров (тефлон, полистирол) или мельчайших стеклянных шариков. Такие носители используют для анализа сильнополярных или очень агрессивных веществ. Важной характеристикой носителя является размер частиц. Оптимальный размер частиц составляет от 125 до 150 мкм.Твердые носители должны быть химически инертными, каталитически неактивными, механически прочными, термостабильными и не должны обладать адсорбционной активностью.Анализируемая проба проходит через разделительную колонку в виде газа или пара. Поэтому температура, как рабочий параметр процесса, играет в газовой хроматографии большую роль, чем в других хроматографических методах. С увеличением температуры сокращается время проведения анализа, так как ускоряется процесс десорбции веществ и соответственно снижается время удерживания их на колонке. С другой стороны, увеличение температуры может вызвать разложение термолабильных соединений. Таким образом,температура колонки должна быть оптимальной. Она определяется, прежде всего, летучестью пробы и может достигать 350° С.Рабочая температура колонки должна быть постоянной, поскольку при ее колебаниях изменяется время удерживания веществ. Постоянство температуры обеспечивается с помощью термостатирующих устройств.Для анализа смесей с широким диапазоном температур кипения компонентов применяют газовую хроматографию с программированием температуры, когда во время разделения температура колонки периодическиили непрерывно повышается. Программирование температуры позволяет получить четко выраженные пики компонентов и сократить время анализа.качестве детекторов чаще применяют пламенно-ионизационный детектор (ПИД) благодаря его высокой чувствительности к большинству органических соединений.2032635172085Рис. 4. Пламенно-ионизационный детектор– газ-носитель; 2 – ввод для водорода; 3 – подвод для воздуха; 4 – анод; 5- горелка; 6 – катод; 7 – выход для продуктов горения.