Методы анализа антиоксидантной активности лекарственных препаратов

Введение
Методы анализа антиоксидантной активности лекарственных препаратов.
Фотометрические методы
Хемилюминесцентные методы
Флуориметрические методы
Электрохимические методы
Методы, использующие биологические маркеры
Заключение
Список литературы

Методы анализа антиоксидантной активности лекарственных препаратов

Схема вольтамперометрического определения антиокислительной активности фенолкарбоновых кислот растительного происхождения на ДНК-модифицированном углеродном трафаретном электроде основана на известном способе количественного определения нативной двунитевой ДНК с использованием комплекса [Co(phen)3]3+ в качестве электрохимического маркера. Количество [Co(phen)3]3+, связанного со слоем ДНК – снижается по мере разрушения последней в результате реакции расщепления. На антиокислительную активность тестировали два стандартных соединения фенолкарбоновых кислот и четыре экстракта растительного происхождения.
Использовался компьютеризованный вольтамперометрический анализатор ECA pol 110 (Istran, Словакия) с двухэлектродной системой (FACH, Словакия), включающей рабочий электрод поверхностью 25 мм2вместе с хлорсеребряным электродом сравнения и отдельным платиновым электродом, использованным для дифференциальной пульсирующей вольтамперометрии. Измерения проводили в стеклянной вольтамперометрической ячейке (10 мл) при температуре 22 °С. УФ-видимый спектрофотометр UV-1601 (Shimadzu, Япония) использовался для оптических измерений радикалов по методу DPPH. ВЭЖХ анализы выполняли на приборе HP 1100 (Hewlett-Packard, Германия).
Растительные экстракты получали экстракцией 2 г сухого растения в 100 мл воды при 70 °С в течение 1 ч.
Нанесение ДНК на электрод осуществляли без какой-либо предварительной электрохимической обработки. 5 мкл раствора ДНК наносили на поверхность электрода и оставляли на ночь для высыхания.
Модифицированный ДНК электрод погружался в раствор фосфатного буфера при рН 7,0, после чего споласкивался водой. Комплекс маркера [Co(phen)3]3+ сорбировали на электроде из его раствора концентрации 5×10–7 M в 10 mM фосфатном буфере при перемешивании в течение 120 секунд.
Дифференциальная импульсная вольтамперограмма получалась немедленно (без замены среды) при развертке от +0,4 до –0,5 V на амплитуде импульса 100 мВ при скорости развертки 25 мВ/с. С использованием программного обеспечения записывали величину тока через каждые 2 мВ развертки.
Простой электрохимический способ определения антиокислительной активности флавоноидов, основанный на измерении потенциала полуволны окисления на проточном колоночном электроде, предложен авторами [4]. Сообщается, что электрохимическая активность соединений коррелирует со способностью подавлять перекисное окисление липидов.
Антиокислительная емкость плазмы измерялась циклической вольтамперометрией на приборе Potentiostat Galvanostat Model 273, EG & G (Princeton Applied Research, США). Была использована трехэлектродная система. В качестве рабочего электрода применялся дисковый стеклоуглеродный электрод (Laboratory Instruments, Чехия) диаметром 2 мм. Перед каждым определением электрод полировали. Платиновая проволока служила вспомогательным электродом, а насыщенный каломельный электрод являлся электродом сравнения. Образец плазмы в количестве 0,3 мл смешивался с фосфатным буферным раствором (1,5 мл) при рН=7,4. Циклические вольтамперограммы снимали в диапазоне от –0,4 до –0,8 В со скоростью развертки 200 мВ/с.
Исследования антиокислительных свойств плазмы крови проводились на группе добровольцев из 29 человек, в возрасте от 18 до 32 лет, которым назначали силимарин или плацебо. Результаты определения АОА плазмы у обоих типов пациентов позволяют получить удовлетворительную информацию об антиокислительном состоянии плазмы. Метод подходит для контроля низкомолекулярных антиоксидантов в пищевых продуктах. Циклическая вольтамперометрия способна контролировать снижение АОА плазмы и эффективность диализа. Метод относительно простой и надежный для определения антиокислительной активности плазмы или сыворотки крови.
Методы, использующие биологические маркеры
Анализ восстанавливающей способности и количественную оценку
антиокислительной активности in vitro гидрида кремния и семи коммерчески доступных водорастворимых антиоксидантов. Эксперимент включает определение окислительно-восстановительных потенциалов, рН и клеточную фотосенсибилизацию методом спектрофотометрии, что позволило объективно оценить антиокислительную эффективность соединений.
Для оценки абсолютной восстановительной способности антиоксидантов было использовано модифицированное Кларком (1923) уравнение Нернста, связывающее парциальное давление водорода и восстановительный потенциал в единицах rH:
Eh = 1,23 – RT(pH/F + ln[1/Po]/4F),
где Eh – измеренный окислительно-восстановительный потенциал; F – константа Фарадея; R – универсальная газовая постоянная; T – абсолютная температура. Число 1,23 – разность измеренного потенциала при парциальном давлении кислорода в одну атмосферу и в растворе при том же значении рН. rH определяется как:
rH = –log Po,
где Ро – парциальное давление кислорода.
Величина rH характеризует абсолютный восстановительный потенциал соединения, исключая влияние рН на величину измеренного окислительно-восстановительного потенциала. Сравнивая величины rH до и после обработки антиоксидантом, можно получить представление о восстановительной активности соединения, а заодно и сравнить их (табл. 1).
Таблица 1. Значения величин ΔrH ряда коммерческих антиоксидантов.
Соединение
ΔrH
+/-
Стандартное отклонение
Microhydrin®
6,83
0,03
0,04
Total Antioxidant
5,48
0,04
0,05
Vitamin C
4,54
0,03
0,05
Antioxidant Plus
3,02
0,04
0,03
Multi Vitamin
2,06
0,03
0,04
CoQ10
1,45
0,02
0,03
Zinc
0,26
0,03
0,04
Nanohydrate® -
0,55
0,03
0,05
Для измерений окислительно-восстановительного потенциала и рН в сосуд с магнитной мешалкой помещали 250 мл бидистиллированной воды и замеряли рН на приборе «Hanna HI 9023», (Hanna Instruments, США) и ред–окс потенциал на приборе «Orion quiсkchek Model 108» (Beverly, США). 100 мг антиоксиданта помещали в 250 мл бидистиллированной воды, перемешивали в течение 2-х минут и снова измеряли рН и редокс-потенциал, разность потенциалов и дает величину ΔrH.
Однако измерение восстановительного потенциала хорошо только in vitro, проблема моделирования in vivo при этом сохраняется. В самом деле, если сделать предположение о том, что наилучшими антиоксидантами являются энергичные восстановители, то можно дойти до абсурдного вывода об эффективности таких соединений, как борогидрид натрия NaBH4 или алюмогидрид лития LiAlH4, которые в физиологических условиях окажутся, скорее всего, сильнейшими цитотоксикантами. Поэтому наряду с величиной абсолютного восстановительного потенциала исследователи оценили и эффективность антиоксидантов на живой модели.
В качестве таковой подходят яйцеклетки китайского хомяка (СНО), а в качестве удобных для контроля реакционноспособных кислородных частиц – поглощающие излучение радикалы красителя малахитового зеленого. Генерирование свободных радикалов из молекул красителя осуществляется при облучении прокрашенных им клеток при помощи гелий-неонового лазера при длине волны 632,8 нм в течение 1 ч и мощности 2000 Вт/м2. Это и есть процесс фотосенсибилизации клеток. По ее завершении аликвоты по 500 мкл взвеси клеток с содержание 6×104 клеток/мл переносили в две 1 мл кюветы, в одну из которых добавляли 500 мкл бидистиллированной воды, а в другую – 500 мкл раствора антиоксиданта концентрацией 400 мкл/мл.
Кюветы стояли в течение 15 мин, после чего определяли поглощение в каждой из них на длине волны 629 нм.
Процент восстановления свободных радикалов определяли по формуле:
% Reduced = 100%{(A(629)sam – A(629)min)/(A(629)max – A(629)min)}.
Затем каждый образец клеток окрашивался в течение 30 мин смесью «живой/мертвый» («LIVE/DEAD®», L-3224, Molecular Probes, США), состоящей из 1 мл 2 мкМ кальцеина-АМ и 4 мкМ этидиум гомодимера-1 (EthD-1), и анализировали методом флуоресцентной микроскопии. Результаты исследований с фотосенсибилизацией клеток приведены в таблице 2.
Таблица 2. Восстановление свободных радикалов в клетках.
Соединение %
Reduced
+/–
Стандартное отклонение
Microhydrin®
91,6
0,39
0,04
Total Antioxidant
77,7
0,22
0,05
Vitamin C
71,0
0,40