Примеси в лекарственных препаратах. Разработка методики определения свободной салициловой кислоты в ацетилсалициловой кислоте

ПРИМЕСИ В ЛЕКАРСТВЕННЫХ ПРЕПАРАТАХ. РАЗРАБОТКА МЕТОДИКИ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СВОБОДНОЙ САЛИЦИЛОВОЙ КИСЛОТЫ В АЦЕТИЛСАЛИЦИЛОВОЙ КИСЛОТЕ

Примеси в лекарственных препаратах. Разработка методики определения свободной салициловой кислоты в ацетилсалициловой кислоте

Рабочее уравнение (1), описывающее ДСК кривую плавления, также основывается на законе Вант-Гоффа:
DT = N2×R×Tпл.2 / DHпл.×g (1)
где:
DT – понижение (депрессия) температуры плавления по отношению к чистому веществу, К,
Tпл. – температура плавления чистого образца без примеси, К,
N2 – мольная доля примеси в образце,
g – доля вещества, расплавленная при температуре Т,
DHпл. – теплота (энтальпия) плавления изучаемого вещества, Дж/моль,
R – универсальная газовая постоянная, 8,314 Дж/моль×К.
Количество примеси в мольных долях может быть определено, если известна молекулярная масса изучаемого вещества и точная масса самого образца.
Определяя всю площадь под кривой ДСК, например, планиметрированием, рассчитывают значение энтальпии плавления (DHпл.). Общую площадь (А) делят графически на ряд произвольных парциальных площадей, например, размером А1 (10 %), А2 (20 %), А3 (30 %), А4 (40 %), которые также измеряются планиметром. Парциальные площади соответствуют долям исходного расплавленного вещества, которые обозначается g1, g2, g3, g4 и т. д.
Теплота плавления при Т1 соответствует площади А1, т.е. количеству тепла, необходимому для плавления доли твердого образца при Т1. Доля расплавленного вещества g1 = А1/А. Температуры Т1, Т2, Т3, как уже указывалось выше, определяется по температурным штрихам, нанесенным прямо на ДСК кривую. Таким же путем рассчитывается 1/g1, 1/g2, 1/g3. Для большей точности желательно определить как можно больше точек 1 / g так, чтобы они ложились в интервале 2 < 1 / g < 5. Значение 1 / g откладывается по оси абсцисс, а значение температур – по оси ординат. Если провести через полученные точки линию, то она, как правило, не будет прямолинейной. Для ее линеаризации надо ввести корректирующий фактор К для всех g1, g2, g3, …, а затем рассчитать g по уравнению (2):
g = (А1 + К)/(Аобщ. + К) (2)
Через полученные точки g1, g2, g3 можно провести прямую. Значение К рассчитывается методом наименьших квадратов по уравнению (3):
К = [[(Т3 – Т2)/(Т2 – Т1)]×А3 – [(А3 – А2)/(А2 – А1)]×А1]/[(А3 – А2)×(А2 – А1) – (Т3 – Т2)×(Т2 – Т1)] (3)
Полученная прямая пересекает ординату в точке То и показывает значение температуры плавления чистого вещества без примеси, а наклон прямой по отношению к оси абсцисс дает нам величину DT и по уравнению (1) рассчитывается N2.
Методом ДСК авторы зарегистрировали термограммы салициловой и ацетилсалициловой кислот, рассчитали их теплоты плавления, криоскопические константы и мольные доли примесей, содержащиеся в исследуемых веществах (таблица 3).
Таблица 3. Температуры плавления, теплоты плавления, криоскопические константы, мольные доли примесей исследуемых веществ, определенные методом ДСК.
Исследуемое вещество
Температура плавления, C
Теплота плавления
(после очистки), кДж/моль
Криоско-пическая конс-танта, мол.д./К
Количество примесей,
мол. %
До очист-ки
После очист-ки
До очист-ки
После очист-ки
Кислота салициловая
158,0
158,9
22,58
0,01463
1,32
0,16
Кислота ацетилсали-циловая
134,0
135,1
24,79
0,01801
1,98
0,14
4. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПРИМЕСИ САЛИЦИЛОВОЙ КИСЛОТЫ В АЦЕТИЛСАЛИЦИЛОВОЙ КИСЛОТЕ ПО ГФ‑Х
Определение примеси салициловой кислоты в субстанции. 0,3 г препарата растворяют в 5 мл этанола и прибавляют 25 мл воды (испытуемый раствор). В один цилиндр помещают 15 мл этого раствора, в другой ‑ 5 мл того же раствора, 0,5 мл 0,01 % водного раствора салициловой кислоты, 2 мл спирта и доводят водой до 15 мл (эталонный раствор). Затем в оба цилиндра добавляют по 1 мл кислого 0,2 % раствора железоаммониевых квасцов. Окраска испытуемого раствора не должна быть интенсивнее эталонного раствора (не более 0,05 % в препарате) [2; 4].
5. ОЦЕНКА КАЧЕСТВА ТАБЛЕТОК КИСЛОТЫ АЦЕТИЛСАЛИЦИЛОВОЙ
АЦЕТИЛСАЛИЦИЛОВАЯ КИСЛОТА, таблетки КИШЕЧНОРАСТВОРИМЫЕ
Содержание ацетилсалициловой кислоты (C9H8O4) должно быть не менее 95.0 % и не более 105.0 % от заявленного.
Таблетки должны соответствовать требованиям общей статьи «Таблетки» и следующим требованиям.
Идентификация. На хроматограмме испытуемого раствора, полученной при количественном определении кислоты ацетилсалициловой, время удерживания основного пика должно совпадать с временем удерживания пика кислоты ацетилсалициловой на хроматограмме раствора сравнения.
Тест «Растворение»: Определение проводят в соответствии с требованиями общей статьи в следующих условиях:
– прибор с корзинкой;
– среда растворения 1 – 0,1 М кислота хлороводородная;
– среда растворения 2 – 0,1 М кислота хлороводородная - фосфатный буферный раствор (750 : 250);
– объем среды растворения 1– 750 мл;
– объем среды растворения 2– 1000 мл;
– скорость – 100 об/мин;
– время растворения в среде 1– 120 мин;
– время растворения в среде 2– 90 мин;
– температура сред растворения – 37 0С.
В сосуд для растворения помещают одну таблетку.
Фосфатный буферный раствор. 380,1 мг натрия фосфата Р растворяют в воде Р, прибавляют 22.8 мл 25 % кислоты хлороводородной Р (об/об) и доводят водой Р до объема 5000,0 мл.
Испытуемый раствор (а). Через 120 мин отбирают 5 мл раствора из центра сосуда для растворения, фильтруют через мембранный фильтр диаметром 0,8 мкм, отбрасывая первые 2 мл фильтрата. При необходимости полученный раствор разбавляют до концентрации кислоты ацетилсалициловой 0,5 мг/мл.
Испытуемый раствор (b). В сосуд для растворения прибавляют 5 мл среды растворения 1 и 250 мл фосфатного буферного раствора, нагревают до температуры 37 0С и продолжают растворение 90 мин, отбирают 10 мл раствора из центра сосуда для растворения, фильтруют через мембранный фильтр диаметром пор 0.8 мкм, отбрасывая первые 5 мл фильтрата. При необходимости полученный раствор разбавляют до концентрации кислоты ацетилсалициловой 0,5 мг/мл.
Раствор сравнения (а). 66,0 мг СО ГФ РК кислоты ацетилсалициловой растворяют в 2 мл метанола Р, доводят средой растворения 1 до объема 100,0 мл. 5,0 мл полученного раствора доводят средой растворения 1 до объема 50,0 мл.
Раствор сравнения (b). 50,0 мг СО ГФ РК кислоты ацетилсалициловой растворяют в 2 мл метанола Р, доводят средой растворения 2 до объема 100,0 мл. 10,0 мл полученного раствора доводят средой растворения 2 до объема 50,0 мл.
Определение проводят методом абсорбционной спектрофотометрии в ультрафиолетовой и видимой областях при длине волны 280 нм относительно среды растворения 1 и 265 нм относительно среды растворения 2.
Параллельно измеряют оптическую плотность раствора сравнения (a) и (b), используя в качестве компенсационных растворов среду I и среду II.
Количество кислоты ацетилсалициловой, перешедшее в раствор через 120 мин должно быть не более 10,0 % и через 90 мин – не менее 75,0 % от заявленного.
Салициловая кислота. Определение проводят методом жидкостной хроматографии.
Испытуемый раствор. К точной навеске порошка растертых таблеток, эквивалентной 100 мг кислоты ацетилсалициловой, прибавляют 70 мл подвижной фазы, обрабатывают в ультразвуковой бане в течение 20 мин, охлаждают до комнатной температуры, доводят той же подвижной фазой до объема 100,0 мл, перемешивают и центрифугируют.
Раствор сравнения. 30,0 мг СО ГФ РК кислоты салициловой растворяют в 70 мл подвижной фазы, обрабатывают в ультразвуковой бане в течение 20 мин, доводят той же подвижной фазой до объема 100,0 мл. 1,0 мл полученного раствора доводят подвижной фазой до объема 10,0 мл.
Хроматографирование проводят на жидкостном хроматографе с УФ‑детектором в следующих условиях:
– колонка размером 150 мм × 4,6 мм, заполненная сорбентом RP 8 с размером частиц 5 мкм;
– подвижная фаза: ацетонитрил Р – 1 % раствор кислоты уксусной (об/об) (20 : 80);
– скорость подвижной фазы 1,2 мл/мин;
– температура колонки – комнатная;
– детектирование при длине волны 280 нм.
Хроматографируют 10 мкл раствора сравнения.
Хроматографическая система считается пригодной, если выполняются следующие условия:
– относительное стандартное отклонение, рассчитанное для площади пика кислоты салициловой, на хроматограммах раствора сравнения должно быть не более 2,0 %.
На хроматограмме испытуемого раствора площадь пика кислоты салициловой не должна превышать площадь пика соответствующей примеси на хроматограмме раствора сравнения (3,0 %).
Микробиологическая чистота. В соответствии с требованиями статьи.
Количественное определение. Определение проводят методом жидкостной хроматографии в соответствии с описанием в разделе «Салициловая кислота».
Испытуемый раствор. Готовят в соответствии с описанием в разделе «Салициловая кислота».
Раствор сравнения. 102,9 мг СО ГФ РК кислоты ацетилсалициловой растворяют в 70 мл подвижной фазы, обрабатывают в ультразвуковой бане в течение 20 мин, доводят той же подвижной фазой до объема 100,0 мл. 1,0 мл полученного раствора доводят подвижной фазой до объема 10,0 мл.
Хроматографируют 10 мкл испытуемого раствора и 10 мкл раствора сравнения.
Хроматографическая система считается пригодной, если выполняются следующие условия:
– коэффициент ассиметрии пика, рассчитанный по пику кислоты ацетилсалициловой на хроматограммах раствора сравнения должен быть не менее 2,0.
Содержание C9H8O4 рассчитывают с учетом содержания C9H8O4 в СО ГФ РК кислоты ацетилсалициловой [1].
6. СПОСОБЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПРИМЕСИ САЛИЦИЛОВОЙ КИСЛОТЫ В АЦЕТИЛСАЛИЦИЛОВОЙ КИСЛОТЕ
Салициловая и ацетилсалициловая кислоты отличаются в первую очередь температурой плавления (158 – 161 0С и 133 – 138 0С, соответственно), следовательно, на начальном этапе для определения чистоты ацетилсалициловой кислоты необходимо определить температуру плавления исследуемого образца.
На следующем этапе исследований примесь салициловой кислоты можно определить химическим способом согласно ГФ Х, которая рекомендует взять для исследования 0,3 г препарата (максимально допустимое содержание салицилатов в данной навеске может составлять 0,00015 г).
Навеску препарата растворяют в 5 мл этанола и прибавляют 25 мл воды (испытуемый раствор). В один цилиндр помещают 15 мл этого раствора, в другой ‑ 5 мл того же раствора, 0,5 мл 0,01 % водного раствора салициловой кислоты (0,00005 г), 2 мл спирта и доводят водой до 15 мл (эталонный раствор). Затем в оба цилиндра добавляют по 1 мл кислого 0,2 % раствора железоаммониевых квасцов. Окраска испытуемого раствора не должна быть интенсивнее эталонного раствора (не более 0,05 % в препарате).
Таким образом, в эталонном растворе содержание салициловой кислоты может составлять 0,0002 г (0,00005 г + 0,00015 г), что соответствует чувствительности реакции салицилатов с ионами железа 0,002 – 0,01 г.)
Для более точного установления примеси салициловой кислоты в субстанции ацетилсалициловой кислоты возможно использование жидкостной хроматографии.
Испытуемый раствор. К 100 мг (точная навеска) кислоты ацетилсалициловой прибавляют 100 мл подвижной фазы (ацетонитрил Р – 1 % раствор кислоты уксусной (об/об) (20 : 80)).
Раствор сравнения. 30,0 мг СО ГФ РК кислоты салициловой растворяют в 100 мл подвижной фазы. 1,0 мл полученного раствора доводят подвижной фазой до объема 10,0 мл.
Хроматографирование проводят на жидкостном хроматографе с УФ‑детектором в следующих условиях:
– колонка размером 150 мм × 4,6 мм, заполненная сорбентом RP 8 с размером частиц 5 мкм;
– подвижная фаза: ацетонитрил Р – 1 % раствор кислоты уксусной (об/об) (20 : 80);
– скорость подвижной фазы 1,2 мл/мин;
– температура колонки – комнатная;
– детектирование при длине волны 280 нм.
Хроматографируют 10 мкл раствора сравнения.
Хроматографическая система считается пригодной, если выполняются следующие условия:
– относительное стандартное отклонение, рассчитанное для площади пика кислоты салициловой, на хроматограммах раствора сравнения должно быть не более 2,0 %.
На хроматограмме испытуемого раствора площадь пика кислоты салициловой не должна превышать площадь пика соответствующей примеси на хроматограмме раствора сравнения (3,0 %).
Для разработки методики определения содержания примеси кислоты салициловой в кислоте ацетилсалициловой выбран оптический аналитический метод спектрофотометрии.
СПЕКТРОФОТОМЕТРИЯ, метод исследования и анализа веществ, основанный на получении спектров поглощения в оптической области электромагнитного излучения. По типам изучаемых систем спектрофотометрию обычно делят на молекулярную и атомную; спектрофотометрию в инфракрасной, видимой и ультрафиолетовых областях спектра.
Применение спектрофотометрии в ультрафиолетовой и видимой областях спектра основано на поглощении электромагнитного излучения соединениями, содержащими хромофорные (например, С = С, С=С, С=О) и ауксохромные (ОСН3, ОН, NH2 и др.) группы. Поглощение излучения в этих областях связано с возбуждением электронов s-, p-и n-орбиталей основного состояния и переходами молекул в возбужденные состояния: s : s*, n : s*, p : p* и n : p* (переходы перечислены в порядке уменьшения энергии, необходимой для их осуществления). Переходы s : s* находятся в далекой ультрафиолетовой области, например, у парафинов при ~ 120 нм. Переходы n : s* наблюдаются в ультрафиолетовой области; например, органические соединения, содержащие n-электроны, локализованные на орбиталях атомов О, N, Hal, S, имеют полосы поглощения при длине волны около 200 нм. Линии, соответствующие переходам p : p*, например, в спектрах гетероциклических соединений проявляются в области около 250 ‑ 300 нм и имеют большую интенсивность. Полосы поглощения, соответствующие переходам n : p*, находятся в ближней ультрафиолетовой и видимой областях спектра; они характерны для соединений, в молекулах которых имеются такие хромофорные группы, как С = О, C = S, N = N. Так, насыщенные альдегиды и кетоны имеют максимумы поглощения при длине волны около 285 нм. Переходы типа n : p* часто оказываются запрещенными, и соответствующие полосы поглощения обладают очень малой интенсивностью.
Переходы типа p : p* могут сопровождаться переходом электрона с орбитали, локализованной главным образом на одной группе (например, С=С), на орбиталь, локализованную на другой группе (например, С=О). Такие переходы сопровождаются переносом электрона с одного атома на другой и соответствующие спектры называются спектрами с переносом заряда. Последние характерны для различных комплексов (например, ароматических соединений с галогенами), интенсивно поглощающих в видимой и УФ областях.
Для ионов переходных металлов и их комплексных соединений характерны переходы с участием d-электронов, а для актиноидов ‑ переходы с участием f-электронов. Соответствующие соединения в растворе бывают интенсивно окрашенными, причем окраска (спектр поглощения) зависит от степени окисления катиона и устойчивости комплексного соединения. Поэтому спектрофотометрию широко используют при исследовании и анализе комплексных соединений металлов.
Изолированные хромофоры в молекуле поглощают независимо. В случае какого‑либо взаимодействия между ними аддитивность спектров нарушается. По отклонениям от аддитивности можно судить о характере и величине взаимодействия. Поскольку положение полос в спектре определяется как разность энергий основного и возбужденного состояний молекул, можно определять структуру энергетических уровней молекул или по известной схеме энергетических уровней определять положение полос поглощения. Любому электронному состоянию молекул соответствует набор различных колебательных уровней энергии. Колебательная структура полосы, соответствующей переходу между электронными уровнями, может отчетливо проявляться не только в спектрах газов, но и в спектрах некоторых растворов, что дает возможность получать дополнительную информацию о взаимодействии молекул. Спектрофотометрическое исследование спектров молекул в видимой и ультрафиолетовой областях позволяет установить вид электронных переходов и структуру молекул. При этом часто исследуют влияние различных типов замещения в молекулах, изменения растворителей, температуры и других физико‑химических факторов.
Интенсивность полосы поглощения молекулы определяется вероятностью соответствующего колебательного (или электронного) перехода. Для характеристики интенсивности полосы служит молярный коэффициент поглощения Е, определяемый, согласно закону Бугера – Ламберта ‑ Бера, как Е = A/Cl, где А = ‑ lgT = ‑ lg(I/I0), T ‑ пропускание, I0 и I ‑ интенсивности, соответственно, падающего и прошедшего через вещество излучения, С ‑ молярная концентрация вещества, поглощающего излучение, l ‑ толщина поглощающего слоя (кюветы). Закон Бугера – Ламберта ‑ Бера лежит в основе количеств. анализа по спектрам поглощения.
Для измерения спектров используют спектральные приборы-спектрофотометры, основные части которого: источник излучения, диспергирующий элемент, кювета с исследуемым веществом, регистрирующее устройство. В качестве источников излучения применяют дейтериевую (или водородную) лампу (в ультрафиолетовой области) и вольфрамовую лампу накаливания или галогенную лампу (в видимой и ближней инфракрасной областях). Приемниками излучения служат фотоэлектронные умножители (ФЭУ) и фотоэлементы (фоторезисторы на основе свинца сульфида). Диспергирующими элементами прибора являются призменный монохроматор или монохроматор с дифракционными решетками. Спектр получают в графической форме, а в приборах со встроенной мини‑ЭВМ ‑ в графической и цифровой формах. Графически спектр регистрируют в координатах: длина волны (нм) и (или) волновое число (см‑1) ‑ пропускание (%) и (или) оптическая плотность. Основные характеристики спектрофотометров: точность определения длины волны излучения и величины пропускания, разрешающая способность и светосила, время сканирования спектра. Мини‑ЭВМ (или микропроцессоры) осуществляют автоматизирированное управление прибором и различную математическую обработку получаемых экспериментальных данных: статистическую обработку результатов измерений, логарифмирование величины пропускания, многократное дифференцирование спектра, интегрирование спектра по различным программам, разделение перекрывающихся полос, расчет концентраций отдельных компонентов и т. п. Спектрофотометры обычно снабжаются набором приставок для получения спектров отражения, работы с образцами при низких и высоких температурах, для измерения характеристик источников и приемников излучения и т.п.
Наиболее приемлемая методика определения примеси салициловой кислоты ацетилсалициловой кислоте методом спектрофотометрии в видимой области по окрашенному комплексу, полученному в результате реакции салициловой кислоты с железоаммонийными квасцами.
Основная методика выглядит следующим образом: исследуемый образец субстанции кислоты ацетилсалициловой помещают в мерную колбу, прибавляют раствор железоаммониевых квасцов, доводят растворителем до метки и определяют оптическую плотность. Содержание примеси кислоты салициловой не должно превышать 0,05 % [1].
Этап 1. Расчет навески
Для расчета навески исходим из того, что чувствительность спектрофотометрического метода составляет около 0,0001 г. Такое количество салициловой кислоты может содержаться в 0,02 г кислоты ацетилсалициловой. В стандартную кювету для спектрофотометрического исследования с толщиной поглощающего слоя 10 мм помещается порядка 4 мл раствора, который должен содержать 0,02 г исследуемого вещества кислоты ацетилсалициловой (или 0,0001 г кислоты салициловой). Точную навеску массой 0,02 г на аналитических весах взять проблематично, целесообразно использовать навеску не менее 0,5 г. Ввиду такого различия в массах следует использовать мерную посуду. 0,02 г препарата должно быть растворено в 4 мл, тогда 0,5 г препарата будет растворено в 100 мл (где будет содержаться около 0,0025 г кислоты салициловой). Следовательно, на аналитических весах отвешиваем 0,5 г препарата и помещаем в мерную колбу на 100 мл.
Этап 2. Приготовление раствора
В качестве растворителя целесообразно использовать этанол, так как салициловая и ацетилсалициловая кислоты лучше растворимы в этаноле и в спиртовых растворах.