Микробиологическое производство лекарственных средств

Содержание
Введение
Требования, предъявляемые к микроорганизмам, используемым для производства
Сырье для микробиологического производства
Приготовление сред
Ферментаторы
Основы роста и культивирования микроорганизмов
Основные стадии технологического процесса
Хранение культуры и размножение посевного материала в лаборатории 11
Получение посевного материала в цехе чистой культуры
Основная ферментация
Биотехнологические процессы
Выделение продукта из культуральной жидкости
Асептика, антиконтаминационная защита в биотехнологии
Литература

Микробиологическое производство лекарственных средств

Они представляют собой герметические цилиндры, объем которых колеблется от 20 л до 500 м3 , а высота в 3 раза превышает диаметр. В ферментаторах установлены мешалки турбинного, пропеллерно­го или другого типа. Диаметр турбины составляет 1/3 диаметра аппара­та. В производстве антибиотиков широко распространены ферментато­ры с мешалками, под которыми находится кольцевидный или воздушный радиальный барботер. Для поддержания температуры имеется двой­ной кожух и теплообменник типа змеевика. Аппарат оборудован арма­турой и трубопроводами для подачи питательной среды, воды, раствора, регулирующего рН, пеногасителей, воздуха и других материалов, укомплектован измерительными приборами и измерительными устройствами, а также устройствами для пеногашения и смотровыми люками. Главное требование к ферментаторам - сохранение стерильности.
К ферментаторам предъявляются самые высокие требования (важ­но иметь полную информацию о ходе процесса), поэтому в аппараты вмонтированы приборы - измерители и регуляторы рН давления кисло­рода, углекислого газа, датчики по содержанию глюкозы и других пара­метров. Современный процесс ферментации управляется автоматически по заданной программе с центрального пульта ЭВМ. Тип ферментатора для каждого биотехнологического процесса выбирают с учетом специ­фики продуцента, свойств среды и экономических соображений.
Для обеспечения культур микроорганизмов кислородом в услови­ях аэробной ферментации через единицу объема питательной среды в минуту подают 0,2-2 единицы объема воздуха, который очищают от механических частиц, микроорганизмов и химических веществ перед вве­дением в ферментатор. Для этого в микробиологическом производстве используют фильтрацию. Воздух подают под давлением 0,2 МПа в компрессор, предварительно очистив его от грубых частиц на масляных фильтрах. В ферментатор воздух проходит сначала через общий, а затем через инди­видуальный фильтр Петрянова. В последнее время широко применяют бактерицидные фильтры. Фильтрующий материал в индивидуальных фильтрах меняют один раз в 2 месяца, а в общих - через 6-8 месяцев.
В связи с интенсивной аэрацией и перемешиванием во время фер­ментации образуется пена. Это может нарушить стерильность процесса и вызвать потери культуральной жидкости. Для ограничения пенообра­зования используют химические средства (масло, олеиновую кислоту, силиконы и другие пеногасители) и механические (вращающиеся лопа­сти в верхней части аппарата, циклоны, струи жидкости и т.п.).
Конструкции ферментаторов различны. Рабочий объем аппарата не превышает 7/10 общего объема. Свободное пространство над поверх­ностью раствора используется как буферное, где накапливается пена и, таким образом, предотвращается потеря культуральной жидкости. В пе­нящейся жидкости условия аэрации лучше, чем в плотных растворах (при условии непрерывного перемешивания и циркуляции слоя пены).
Основы роста и культивирования микроорганизмов
Рост - координированная репликация клеточных структур и био­генез органелл, необходимых организму для выживания. Развитие - ка­чественное изменение компонентов организма. Процесс развития связан с ростом. Основой микробиологического производства является культиви­рование, предусматривающее получение максимального количества продуктов жизнедеятельности микроорганизмов, а также микробной биомассы. При производстве микробной биомассы основным показателем культивирования является интенсивность роста и размножения мик­роорганизмов.
Технология микробиологических производств строится на свойст­вах микроорганизмов, используемых в качестве продуцента.
В зависимости от задач и возможностей производства продуценты культивируют двумя способами - поверхностным и глубинным. Метод выращивания поверхностным способом довольно прост и заключается в том, что микроорганизмы культивируют на поверхности твердых или жидких питательных сред. После засева питательной среды культурой продуцента выращивание ведут при оптимальных условиях в течение определенного промежутка времени, поэтому этот способ является пе­риодическим.
Способ периодической культуры чаще всего используют при по­лучении посевного материала. Суть его в том, что за время культивиро­вания не поступают компоненты питательной среды и не удаляются ме­таболические продукты. Такая система считается закрытой. В этих усло­виях микроорганизмы растут и размножаются, проходя через опреде­ленный цикл развития, который выражается в смене фаз: лаг-фазы, экс­поненциальной (логарифмической), стационарной и фазы отмирания.
1-я фаза начинается с момента внесения инокулята в питательную среду и длится до начала размножения микроорганизмов. Суть фазы - в адаптации к новой среде обитания. Продолжительность лаг-фазы опре­деляется физиологическими особенностями микроорганизмов, состава­ми посевной и производственных сред, условиями культивирования, возрастом культуры и посевной дозой. Чем моложе микроорганизм, тем короче лаг-фаза.
2- фаза называется экспоненциальной или логарифмической и ха­рактеризуется сбалансированным ростом, который не ограничивается ни недостатком питательных веществ, ни избытком продуктов обмена. Ус­танавливается максимальная скорость роста.
В результате интенсивного роста и размножения микроорганизмов в среде с той же интенсивностью расходуются питательные вещества и накапливаются продукты жизнедеятельности. Возникает пространственная ограниченность, ухудшается поступление питательных веществ в клетку и выделение метаболитов. Скорость роста снижается, число клеток сокращается и наступает следующая фаза.
3-я фаза стационарная - следствие равновесия между числом жиз­неспособных и мертвых клеток, прирост биомассы культуры по сущест­ву прекращается. В культурах, достигших стационарной фазы, накапли­вается максимальное количество биомассы или максимальное количест­во клеток. Эти максимальные величины принято называть урожаем или выходом.
Для стационарной фазы характерна все более нарастающая гетеро­генность клеточной популяции, которая состоит из отдельно размно­жающихся клеток, из живых, но уже потерявших способность к росту, и мертвых, лизирующих клеток.
4-я фаза - фаза отмирания или гибели. Она начинается с момента, когда число отмерших клеток становится больше числа вновь образо­вавшихся. Условия для клеток микроорганизмов в этой фазе неблаго­приятны.
Биологически ценные продукты синтезируются как в экспотенци­альной фазе (нуклеотиды, многие ферменты, витамины - первичные метаболиты), так и в стационарной фазе роста (антибиотики, вита­мины и т.п. - вторичные метаболиты).
Основные стадии технологического процесса
Хотя для получения продуктов микробиологического синтеза применяют различные культуры микроорганизмов и используют питательные различные среды и режимы культивирования, тем не менее, процессы биосинтеза имеют единую биотехнологическую схему. Эта схема включает следующие технологические стадии:
l. Хранение культуры и размножение в лаборатории
2. Получение посевного материала в цехе чистой культуры
3. Ферментация
4. Выделение продукта из культуральной жидкости1
Все выпускаемые в настоящее время биопрепараты микробиологическо­го синтеза можно разделить на три основные группы:
Первая группа объединяет биопрепараты, которые содержат в ка­честве основного компонента жизнеспособные микроорганизмы. Это средства защиты растений, бактериальные удобрения, закваски для си­лосования кормов, препараты нормофлоры организма.
В состав второй группы входят инактивированная биомасса кле­ток и продукты ее переработки: дрожжи кормовые, грибной мицелий.
Третья группа включает биопрепараты, которые представляют собой очищенные продукты метаболизма микроорганизмов: витамины, антибиотики, аминокислоты, ферменты, стероидные препараты, полиса­хариды, биолипиды, продукты комплексной переработки микробных биомасс и метаболитов. Это наиболее обширная и разнообразная группа препаратов.
Хранение культуры и размножение посевного материала в ла­боратории
Культуры микроорганизмов - продуцентов веществ - получают из академий, университетов и институтов (коллекции культур) в пробир­ках на косом агаре или в ампулах. Каждая культура имеет паспорт с подробным описанием морфологии, физиологии штамма, характеристи­ки среды для культивирования и хранения.
Чтобы сохранить свойства культуры без изменений, ее надо хра­нить в соответствующих условиях: основными из них являются охлаж­дение, замораживание или обезвоживание. Во всех этих случаях огра­ничивается или даже прекращается клеточный обмен веществ. Иногда (при замораживании или обезвоживании) клетки переходят в состояние анабиоза.
На практике культуры хранят разными способами:
- на косом агаре при низкой температуре (1-5С) мож­но хранить культуру 1-2 месяца, а иногда и дольше.
- путем замораживания и хранения при температуре ни­же – 20С позволяет сохранить ее в течение нескольких месяцев (нежелательно многократное оттаивание и замораживание).
- на твердых средах под слоем стерильного парафина или минерального масла можно хранить дрожжи, плесневые гри­бы. Менее пригоден этот метод для хранения актиномицетов. Слой масла над поверхностью косого агара должен быть не менее 1 см, он предохраняет культуру от высыхания.
- на агаре без добавления питательных веществ (допускаются лишь незначительные добавки) хранят актиномицеты.
- при лиофилизации культуру замораживают при тем­пературе до - 30 - 40С и подвергают сублимации (обезвоживанию) в вакууме ( остаточное давление 6-130 кПа). Для предохра­нения клеток от инактивации используют защитные среды (сыво­ротка крови, бульоны, сахароза, смесь песка и глин). Лиофилизи­рованную чистую культуру в ампулах хранят нескольких лет.
Перед началом технологического процесса культуру размно­жают в лаборатории в асептических условиях при оптимальном со­ставе среды в режиме выращивания (рН, температура, длительность). С поверхности косого агара ее стерильно переносят в колбе объемом 100-200 мл и инкубируют в термостате или в качалке в зависимости от потребности культуры в кислороде. Длительность этой стадии вы­ращивания - 24 ч.
Получение посевного материала в цехе чистой культуры
Дальнейшее размножение посевного материала обычно идет в две стадии: в цехе чистой культуры и в отделе инокуляции. Аппараты первой стадии называют инокуляторами, второй - посевными фер­ментаторами.
Для приготовления посевного материала используют полно­ценную питательную среду, тщательно проверенную различными химическими и микробиологическими методами. Ее в аппарате не должно превышать 60% от общего объема. Если культуру в инокуля­тор переносят из колб, то количество посевного материала должно составлять примерно около 0,1% объема среды. Небольшое количе­ство посевного материала требует дополнительного периода иноку­ляции (2-4 суток).
Для посевных ферментаторов используют 10-12% инокулята, поэтому продолжительность приготовления посевного материала на этой стадии уменьшается и обычно не превышает 1 сутки. В это вре­мя надо следить, чтобы в аппаратах был оптимальный режим культивирования. Для этого три раза в сутки отбирают образцы для микро­биологических и биохимических анализов.
Основная ферментация
Для стерильной ферментации широко используют аппараты объемом до 100 куб.м. Перед заполнением аппарата средой его моют, проверяют герметичность, стерилизуют горячим паром под давлени­ем как ферментатор, так и систему трубопроводов. Для обеспечения стерильности часто применяют предварительную его обработку хи­мическими дезинфицирующими веществами, (этот процесс проводят непосредственно перед обработкой горячим паром под давлением), после чего заполняют стерильной охлажденной питательной средой. Затем в ферментатор вводят посевной материал. Перед его подачей температура и рН питательной среды должны быть доведены до оп­тимальных данных значений для данной культуры. Соответственно регулируют и интенсивность аэрации с перемешиванием среды. В пространстве над жидкостью скапливается пена. Если ее слой сильно увеличивается, то в аппарат вводятся химические пеногасители. Во время ферментации автоматически регулируются температура и рН среды, в случае необходимости добавляются растворы кислоты или щелочи. Ферментацию прекращают, когда в среде накапливается мак­симальное количество полезного продукта. По окончании процесса культуральную жидкость охлаждают до 10-15С и перекачивают в резервуары, из которых она подается на дальнейшую переработку.
Биотехнологические процессы
Биотехнологические процессы могут быть 2 типов: периодиче­ские и непрерывные.
Периодический способ выращивания микроорганизмов использу­ется на стадии получения посевного материала для многих производств, непрерывных и периодических. Несмотря на преимущества непрерыв­ного культивирования, многие промышленные процессы продолжают носить периодический характер, так как такие системы отличаются гиб­костью и позволяют получать разнообразные вещества от пива до антибиотиков. Однако этот способ культивирования не позволяет в полной мере реализовать способности микроорганизмов к безграничному размноже­нию. Период самой активной жизнедеятельности - логарифмическая фаза занимает лишь небольшую часть производственного цикла, а значитель­ная часть уходит на лаг-фазу и период замедленного роста.
Периодическое культивирование предполагает существование клеток микроорганизмов в постоянно меняющихся условиях. Концен­трация источников питания и продуктов жизнедеятельности - регулято­ры скорости роста микроорганизмов. Постепенным введением питатель­ных веществ в течение всего процесса можно избежать ингибирования роста микроорганизмов. Такой метод получил название культивирова­ния микроорганизмов с дробным дозированием субстрата.
При добавлении питательной среды в процессе культивирования происходит изменение ее объема. С целью сохранения его постоянства и снижения концентрации микробных метаболитов часть культуральной жидкости можно через определенные промежутки времени удалять из аппарата и добавлять равное количество питательной среды. Такой пе­риодический метод получил название объемно-доливного. При этом ос­новные параметры процесса - объем, скорость разбавления, удельная скорость роста - не являются постоянными.
Модификацией периодического культивирования является куль­тивирование с диализом, при котором питательный субстрат постоянно поступает в реактор через специальную мембрану. Диализ ведет к снижению концентрации продуктов жизнедеятельности клеток, неблагоприятно влияющих на их жизнедеятельность. Помимо этого, диализ удаляет из культуры часть жидкости, что позволяет получать в конце процесса концентрированную биомассу.