Ферменты

Оригинальность работы 100 % ...

Введение

Актуальность темы: Актуальность изучения данной темы заключается в том, что все процессы в живом организме - дыхание, пищеварение, мышечное сокращение, фотосинтез и другие – осуществляются с помощью ферментов. Ферменты находятся во всех живых клетках и составляют большую часть всех их белков. Они во много миллионов раз ускоряют самые разнообразные химические превращения, из которых складывается обмен веществ. Под действием различных ферментов составные компоненты пищи: белки, жиры и углеводы – расщепляются до более простых соединений, из которых затем в организме синтезируются новые макромолекулы, свойственные данному типу.
Ферменты обнаруживаются у всех живых существ, начиная от самых примитивных организмов. Получено около 600 ферментов. Они способствуют управлению сложнейшими процессами разрушения и сотворения новых веществ в организме.
В настоящее время, знание о работе ферментов, человек поставил себе на службу в медицине, промышленности и др. сферах жизни.
В основе многих болезней лежат нарушения нормального функционирования ферментативных процессов, изменения которых следует расценивать, как причину или следствие различных патологических процессов.
Большинство ферментов находятся в клеточной среде, но, тем не менее, на основании результатов анализов преимущественно плазмы или сыворотки крови можно сделать заключение об изменениях, происходящих в клетках и тканях:
Аспартатаминотрансфераза(АСТ)катализирует обратимый перенос аминогрупп с I- аспаргиновой кислоты на а- кетоглутаровую.
Аланинаминотрансфераза(АЛТ)катализирует обратимый перенос аминогрупп с I- аланина на а- кетоглутаровую.
АСТ и АЛТ, являясь внутриклеточными ферментами, участвуют в обмене аминокислот и углеводов, в высоких концентрациях содержатся в мышцах, печени, мозге.
Несмотря на отсутствие органной специфичности, определения АЛТ и АСТ при заболеваниях печени и сердца имеет большую диагностическую ценность. Увеличение этих показателей свидетельствует о некрозе, прежде всего мышечной ткани, клеток печени и мозга. Снижение показателей имеет место при недостаточности пи-родоксина, при почечной недостаточности, беременности.
А-амилаза (диастаза) катализирует эндогидролиз а 1,4- глю-козоидных связей крахмала, гликогена и родственных им полисахаридов до мальтозы. Повышение значения амилазы сыворотки крови наблюдается при остром панкреатите, холецистите, перитоните. Снижение уровня амилазы характерно для острого и хронического гепатита, недостаточности поджелудочной железы, при токсикозе у беременных женщин.
Креатинфосфокиназа(КФК) расщепляет креатинфосфат с образованием креатина и АТФ.
В сыворотки крови повышенная активность КФК может быть следствием повреждения миокарда или скелетной мускулатуры. Повышение КФК бывает вызвано также употреблением алкоголя, отравлением снотворными средствами, гипотиреозом, инсультом.
Лактатдегидрогеназа(ЛДГ) – гликолитический фермент, катализирующий обратимую реакцию восстановления пировиноградной кислоты в молочную обнаруживается во всех клетках.
Активность ЛДГ повышается при повреждениях миокарда, лейкозах, почечных заболеваниях.
Фосфатазы - ферменты гидролизирующие эфиры фосфорной кислоты. В зависимости от значения рН, при котором действует фермент, различают щелочную, и кислую фосфатазу.
Щелочная фосфатаза (ЩФ) содержится практически во всех животных тканях. Увеличение активности ЩФ наблюдается при костных заболеваниях, при новообразованиях.
Кислая фосфатаза (КФ) содержится практически во всех тканях человека.
Определяют обычно активность КФ для диагностики карциномы предстательной железы. Повышена активность КФ обычно при болезнях почек, тромбоэмболии.

Цель работы: изучить методы лабораторной диагностики ферментов, и описать их значение.

Задачи:
1. объяснить свойства ферментов и особенности ферментативного катализа их белковой природы.
2. определить принадлежность ферментов к определенному классу и подклассу в соответствии с их номенклатурой.
3. провести лабораторный опыт по исследованию свойств ферментов.
4. сделать выводы подтверждающие гипотезу исследований.

Список сокращений………………………………………………….…… ..3
Введение…………………………….………………………………………4
Глава I –Теоретическая часть
1.1. История открытия ферментов…………………………………………7
1.2. Состав ферментов………………………………………………………9
1.3. Классификация……………………………………………………...…11
1.4. Активность ферментов……………………………..…………………14
1.5.Механизм действия……………………………………………………19
1.6.Значение ферментов в области медицины .......................................23
Глава II – Практическая часть
2.1.Методы клинических лабораторных исследований ферментов…….26
2.2.Определение активности отдельных ферментов в организме
человека………………………………………………………………...29
2.2.1.Аспортатаминотрасфераза… …………………………………….…29
2.2.2.Аланинаминотрансфераза………………...........................................33
2.2.3.Щелочная фосфатаза.………………………………………………..39
2.2.4.Лактатдегидрогеназа……………………………………………….41
2.2.5Альфа - амилаза………………………………………………….……44
2.3.История болезни………………………………………..…… ………...46
2.4.Статистика заболеваний связанных с нарушением активности
ферментов………………………………………………………………49
Заключение…………………………………………………………………50
Глоссарий.................................................................................................54
Список использованной литературы……………………………………56
Приложения………………………………………………………………..57

Нужно иметь также в виду, что молекула субстрата, хотя она, как правило, и значительно меньше молекулы фермента, тоже обладает некоторой подвижностью и при взаимодействии с ферментом эта подвижность может способствовать более полному соответствию. Особенность ферментов состоит в том, что об их наличии мы можем судить только по их действию. Мы умеем измерять скорость ферментативных реакций, то есть количество субстрата, подвергшегося превращению в единицу времени, например в одну минуту или в один час. Разным ферментам свойственна далеко не одинаковая молекулярная активность. Некоторое представление о реальных величинах этой активности даёт таблица. Из таблицы видно, насколько различна молекулярная активность различных ферментов и каких огромных величин она может достигать в отдельных случаях. «Карбоангидраза, занимающая первое место в таблице и обладающая чудовищной молекулярной активностью (36 миллионов), является самым активным из всех известных ферментов. 1.6. Значение ферментов в области медициныФерменты нашли широкое применение в медицине. Это, прежде всего, изучение таких болезней причина, которых лежит в недостаточности тех или иных ферментов. Далее это использование определения активности ферментов в биологических жидкостях и тканях для диагностики различных заболеваний. И, наконец, это применение ферментов в качестве лекарственных средств (приложение №2). Генетически обусловленные нарушения. Время от времени в бесконечно длинных цепях ДНК, где записаны все инструкции по синтезу белков, вдруг появляются случайные замены: вместо одного нуклеотида становится другой. Такие замены называются мутациями. Чаще всего конкретные причины мутации неизвестны. А последствия их нередко бывают роковыми. Приведем такой пример. Люди отличаются друг от друга цветом кожи, волос и глаз. Причина этого – разные пигменты, меланины, синтезируемые из некоторых аминокислот под влиянием определённых ферментов. Если образование этих пигментов не происходит из - за отсутствия одного из участвующих в реакции ферментов, возникает альбинизм – отсутствие окраски. Люди альбиносы (см. приложение №3) имеют очень белые волосы и светлые глаза. Альбиносы по здоровью не уступают людям с нормальной окраской. Гораздо более тяжёлым заболеванием, нередко приводящим к гибели новорождённых, является непереносимость простых углеводов – моносахаридов (галактозы и фруктозы). Здесь речь идёт о невозможности нормального обмена веществ в клетках из - за отсутствия необходимых ферментов. Достаточно подробно изучены врождённые болезни, связанные с недостатком ферментов, катализирующих разложение гликогена. В результате нарушения этого процесса гликоген начинает накапливаться в тканях в избыточном количестве и препятствует нормальному течению обмена веществ. Такие болезни получили название гликогенозов. Болезни, связанные с отсутствием витаминов, называют авитаминозом. Но по существу они являются ферментозами. Давно известна и когда – то была широко распространена болезнь ''бери – бери '' (сейчас её называют полиневритом – множественное воспаление нервов, в некоторых слаборазвитых странах она и теперь встречается нередко). Причина её отсутствие в пище витамина В1. Этот витамин – тиамин – в соединении с фосфорной кислотой представляет собой небелковую часть фермента декарбоксилазы. Декарбоксилаза разрушает карбоксильную группу (- СООН) некоторых органических кислот, отщепляя от неё углекислоту (СО2). В отсутствии витамина В1декарбоксилаза образоваться не может, реакция прекращается, и в нервной ткани наступают нарушения, типичные для полиневрита: параличи конечностей, боли в мышцах, слабость, контрактуры. Тяжёлое заболевание – пеллагра – связано с отсутствием в пище витамина РР – никотиновой кислоты. Упомянем ещё об одном витамине. Он называется витамином В2, а по химической природе представляет собой довольно сложную циклическую структуру – рибофлавин. Авитаминоз В2 связан с тяжёлым поражением кожи лица и глаз. Причина недостаток фермента.Ферменты также используются в диагностике. Определение активности ферментов в биологических жидкостях и тканях стало неотъемлемым средством лабораторной диагностики различных заболеваний. Для диагностических целей ферментативную активность определяют почти исключительно в крови, значительно реже в моче и лишь в отдельных случаях в тканях. Не все ткани в одинаковой мере синтезируют разные ферменты. Для печени, например, типична высокая активность одних ферментов, для почек или скелетных мышц – других. Это явление называют органоспецифичностью ферментов. Иногда органоспецифичность выражена очень чётко: фермент содержится только в каком-нибудь одном органе и отсутствует у других. Таким образом, врач получает возможность по повышению активности некоторых ферментов в плазме выявить заболевание, связанные с нарушением функций совершенно определенных органов. В последнее время предпринимаются всё более успешные попытки использовать ферменты и для лечения некоторых болезней. Уже давно некоторые ферменты применяют для так называемой заместительной терапии – для возмещения дефицита ферментов, возникающего при некоторых заболеваниях. Особенно успешна такая терапия при нарушениях функций желудочно-кишечного тракта, связанных с недостаточной выработкой пищеварительных ферментов. С успехом применяют ферменты в тех случаях, когда лечение требует разрушить накопившиеся в большом количестве белковые образования, мешающие нормальному функционированию тканей. Это бывает при ожогах, гнойных ранах, гнойно-воспалительных заболеваниях лёгких, когда в бронхах скапливается густая масса, препятствующая прохождению воздуха. Наметился очень перспективный путь применения ферментов для рассасывания сгустков крови, образовавшихся внутри кровеносных сосудов. Такие сгустки называются тромбами, они закупоривают сосуд и нарушают кровообращение. Глава II. Практическая часть. 2.1. Методы клинических лабораторных исследований ферментов. Используемые в клинико-диагностических лабораториях методы определения активности ферментов могут быть разделены на две основные группы. Состоящие в определении конечного продукта, образовавшегося после известного периода инкубации ферментного препарата с субстратом в соответствующем буфере. Для этого используется специальная химическая реакция, а учет оптической плотности может был произведен на обычном фотометре.Методы, с помощью которых в ходе ферментативной реакции непрерывно или периодически определяют потребление субстрата, кофермента либо образование метаболита. Методы этой группы называются кинетическими, или методами непрерывной регистрации.В зависимости от особенностей принципа исследования, положенного в основу определения активности энзимов, способы их осуществления подразделяются на несколько групп.1. Без использования НАД и НАД • Н2 (пиридинкоферментов).Среди них различают колориметрические, титриметрические, газометрические, электрохимические, флюориметрические, изотопные, с использованием инфракрасной спектроскопии, электронного парамагнитного резонанса (табл. 26).Они используются для определения активности альфа-амилазы - по количеству освобождающегося в процессе расщепления нитрофенил- производного мальтогептазида 2-хлор-4-нитрофенола, дающего окрашивание в щелочной среде; панкреатической липазы - по интенсивности отщепления фенолфталеина (сообщающего раствору красное окрашивание в слабощелочной среде) в ходе расщепления ферментом фенолфталеиндибутирина; холинэстеразы - по высвобождению при энзиматическом разрушении ацетилтиохолина, взаимодействующего с дисульфиднитробензоатом с образованием окрашенного соединения; гамма-глутамилтранспептидазы — по объему расщепления гамма-глутамилнафтиламида; определения фибриногена и др. Наиболее распространены колориметрические каталитические методы (определение активности щелочной и кислой фосфатаз, липазы, холинэстеразы, лейцинаминопептидазы, гамма-глутамилтранспептидазы). В последнее время широко применяются методы исследования с использованием хромогенных субстратов (определение фибриногена и др.). Флюориметрические методы обычно в 100—1000 раз чувствительнее колориметрических и поэтому прежде всего годятся для ультрамикроанализа ферментов в микроскопических биоптатах (кусках) ткани. Из титриметрических методов известны способы определения активности липазы и холинэстеразы (с помощью рН-электрода). Среди электрохимических методов чрезвычайно распространены те, при которых продукт ферментативной активности непосредственно onpeделяется стеклянным селективным электродом. Таким способом можно устанавливать активность холинэстеразы (с использованием селективного на ацетилхолин электрода), гуаназы (селективным на аммиак электродом), оксидазы (селективным на кислород электродом 2. Каталитические методы, базирующиеся на применении пиридинкоферментов. Из этой группы чаше всего используют методы, основывающиеся на оптическом тесте Варбурга (рис. 26). Сопряжение реакции образования коферментов с превращением фармазона позволяет учитывать ход реакции в видимой области спектра. По такой технологии анализируется активность свыше 100 ферментов.3. Некаталитические методы, позволяющие непосредственно определять концентрацию фермента, независимо от его каталитической активности. С помощью их выявляется содержание многих апоферментов. Концентрацию энзимов устанавливают чаще всего иммунологическими методами (например, определение МВ-изофермента креатинкиназы). Весьма перспективен способ аффинной хроматографии и некоторые другие.Активность ферментов выражается количеством разрушенного субстрата или образованного в ходе реакции продукта (в моль, ммоль, мкмоль и т.д.) в пересчете на один литр сыворотки (плазмы) крови при температуре 37, 30, 25eC (SI) либо в международных единицах (Е/л, U/1), а также в каталах (долях катала) на литр, например мккат/л (1 мккат = 60 U;1 U = 16,67 • 103мккат). Одна единица (U) какого- либо энзима – есть то его количество которое катализирует трансформацию 1 мкмоль субстрата за 1 мин. При определенных условиях.Абсорбция----- НАД-Н (НАДФ Н)НАД (НАДФ)- 0,311260300340380 400Длина волны, нмРис. 26.Спектр поглощения никотинамидаденинлинуклеотида. 2.2. Определение активности отдельных ферментов в организме человека.Аспортатаминотрансфераза.Колориметрический активности аминотрансфераз в сыворотке крови динитрофенилгидразиновый метод исследования (по Райтману, Френкелю).Принцип метода. В результате переаминирования, происходящего под действием АсТ и АлТ, образуются щавелевоуксусная и пировиноградная кислоты (первая в реакционной смеси также превращается в пировиноградную кислоту).При добавлении раствора 2,4-динитрофенилгидразина энзиматический процесс останавливается, и возникают гидразины пировиноградной и отчасти щавелево-уксусной кислот. В щелочной среде они дают окрашивание, интенсивность которого пропорциональна количеству образовавшейся пировиноградной кислоты (гидразон пировиноградной кислоты, возникающий при самопроизвольном декарбоксилированиищавелевоуксусной, обладает более высокой абсорбцией, чем гидразонщавелевоуксусной кислоты).Реактивы. О, I моль/л фосфатного буфера, рН 7,4. Для его приготовления смешивают 840 мл 0,1 моль/л раствора двузамещенного фосфата натрияNa2HP04 2Н20 (17,4 г кристаллической соли растворяют в 1 л дистиллированной воды; двузамещенный фосфорнокислый натрий, содержащий две молекулы воды, получают путем выветривания на воздухе в течение двух суток кристаллической соли, содержащей обычно 12 молекул воды; соль предварительно растирают в ступке в порошок) и 160 мл 0,1 моль/л раствора безводного однозамещенного фосфата калия КН2Р04 (13,6 г КН2Р04 растворяют в 1 л дистиллированной воды).Буферный раствор с индикатором бромтимоловым синим (реактив 2) должен давать голубую окраску. В качестве консерванта можно использовать 5-10 мл хлороформа, добавляемых ко всему объему буферного раствора.Раствор бромтимолового синего, 0,4 г/л. 100 мг индикатора растворяют в ступке с 3,2 мл 0,05 н раствора едкого натра. Затем смесь смывают водой в мерную колбу емкостью 250 мл и доводят водой до метки.Субстратный раствор для определения активности аспартатаминотрансферазы. 29,2 мг альфа-кетоглутаровой и 2,66 г DL-аспарагиновой кислот (при использовании вместо DL-аспарагиновой кислотыL-аспарагиновой меру субстрата следует уменьшить вдвое), поместить в бюкс или легкий химический стакан и произвести взвешивание на аналитических весах, к полученной навеске добавить 1 н раствор NaOH (реактив 6), приливая его осторожно, небольшими порциями до полного исчезновения осадка и приобретения раствором рН 7,4 (на что уходит обычно около 20 мл раствора щелочи). Для определения рН раствора используют универсальную индикаторную бумагу или применяют рН-метр. Раствор переливают в мерную колбу емкостью 100 мл, ополаскивая посуду 0,1 моль/л фосфатным буфером (рН 7,4) и доводя им объем содержимого колбы Д° метки. Буферный раствор тщательно перемешивают, прибавляют к нему одну каплю хлороформа, разливают во флакончики из-под пенициллин и хранят в холодильнике в замороженном состоянии. Перед употреблением замороженный раствор следует полностью оттаять. Субстратный раствор для определения активности аланинаминотрансферазы. 29,2 мг альфа-кетоглутаровой кислоты и 1,78 DL-аланина отвешивают на аналитических весах. Дальнейшее процедура приготовления раствора аналогична таковой, описанной для реактива 3. Раствор 2,4 динитрофенилгидразина. 19,8 мг 2,4-динитрофенилгидразина растворяют в небольшом объеме 1 н (или лучше 2 н) раствора соляной кислоты при нагревании смеси на водяной бане. После того как раствор остынет, доводят его объем раствором соляной кислоты до 100 мл. На следующий день реактив фильтруют. Раствор хранят в посуде из темного стекла в холодильнике (около года). На дне раствора не должны образовываться кристаллы, поскольку при этом возникают низкие значения абсорбции. 1 н раствор NaOH. 0,4 н раствор NaOH, свободный от карбонатов. Реактив можно приготовить из концентрированного (500 г/л) раствора NaOH, разбавляя его свежекипяченой водой, свободной от карбонатов, до получения смеси с плотностью 1,016 кг/л при 20°С или 1,018 кг/л при 15°С. Однако предпочтительнее готовить реактив из фиксанала по общеизвестным принципам.Сосуды с реактивом (и дистиллированной водой) закрывают пробками с поглотительными трубками, наполненными натронной известью или гидроокисью бария.8. Стандартный раствор пировинограднокислого натрия - CH3COCOONa. 11 мг точно взвешенного кристаллического пирувата натрия (белого цвета) растворяют в небольшом количестве дистиллированной воды, переносят в мерную колбу емкостью 100 мл и доводят объем дистиллированной водой до метки; 1,0 мл раствора содержит 110 мкг пирувата натрия, что соответствует 88 мкг пировиноградной кислоты. Раствор используют для построения калибровочного графика.Ход определения. Опытную пробу готовят следующим образом: в пробирку вносят 0,5 мл субстратного раствора и прогревают его при 37°С в течение 5 мин (в практике лабораторной работы предварительный этап прогревания пробы нередко не выполняют). Затем добавляют 0,1 мл испытуемой сыворотки и пробирку помещают в термостат для выдерживания при 37°С в течение 60 мин. После извлечения ее с термостата в содержимое пробирки добавляют 0,5 мл раствора динитрофенилгидрозина и, после перемешивания, пробу выдерживают в течение 20 мин при комнатной температуре (для развития реакции). Затем приливают 5 мл 0,4н раствора NaOH и после повторного тщательного перемешивания раствора оставляют при комнатной температуре на 10 мин для развития окраски.Оптическую плотность проб измеряют на биохимическом фотометре с зеленым фильтром (530; 500-560 нм) в кювете с шириной слоя 10 мм. Результаты сравнивают с аналогичными данными контрольных проб.Контрольная проба содержит все ингредиенты опытной пробы, за исключением сыворотки крови. Вместо нее берут 0,1 мл дистиллированной воды. Контрольную пробу инкубируют в тех же условиях, что и опытную.Райтманом и Френкелем (1957) предложено выполнять контрольные пробы, как опытные, но с внесением раствора 2,4-динитрофенилгидразина сразу же после инкубации фермент-субстратной смеси (для ингибирования энзиматической активности). 2.2.2.Аланинаминотрансфераза.Ход определения. В пробирку вносят 0,5 мл субстратного раствора для исследования активности АЛТ, затем добавляют 0,1 мл испытуемой сыворотки и помещают смесь на 1 ч в термостат для инкубации при 37°С. Дальнейший ход анализа такой же, как и при определении активности АСТ.Аминотрансферазную активность сыворотки рассчитывают по калибровочному графику, показывающему зависимость абсорбции от содержания ппировиноградной кислоты в пробе.Чтобы получить данные для построения калибровочной кривой, в пробирки помещают раствор стандарта и дистиллированную воду в количестве указанном в таблице 31, перемешивают их содержимое, добавляют по 0,5мл раствора 2,4-динитрофенилгидразина и через 20 мин приливают по 5 мл 0,4н раствора NaOH. После повторного перемешивания пробы выдерживают при комнатной температуре. Затем измеряют оптическую плотность проб на фотометре (спектрофотометре, полуавтоанализаторе) с зеленым светофильтром (530 нм) в кюветах с шириной слоя 10 мм. Показатели абсорбции сравнивают с аналогичными данными контрольной пробы, в которую вместо раствора пировиноградной кислоты добавляют дистиллированную воду, и производят расчет по калибровочному графику.На осях ординат и абсцисс графика откладывают соответствующие величины абсорбции и активности фермента. Начиная с величины абсорбции 0,30 градуировочная линия отклоняется от прямой. Поэтому при показателях абсорбции выше 0,30 анализируемые пробы (с большой ферментативной активностью) разводят какой-либо инактивированной сывороткой. Полученные показатели активности умножают на величину разведения.В сыворотке крови практически здоровых взрослых людей активность АСТ составляет 0,1—0,45 ммоль пировиноградной кислоты на 1 л сыворотки за 1н инкубации при 37°С (0,1-0,45 ммоль/(ч • л); активность АЛТ – 0,1- 0,68 ммоль(ч • л).41 t»- iЧтобы перевести ранее принятые единицы ферментативной активности в рекомендуемые Международной системой единиц «ммоль пировиноградной кислоты на 1 л сыворотки за 1 ч инкубации при 370С», необходимо показатели активности АСТ и АЛТ, выраженные в старой размерности (единицах ферментативной активности), разделить на 88 — коэффициент пересчета, численно равный молекулярной массе пировиноградной кислоты.Показатели нормы, выраженные в ранее принятой размерности, составляют 8-40 ед. для АСТ, 5-30 ед. для АЛТ.Таблица 31Данные к построению калибровочного графика для определения активности аминотрансферазНомер пробиркиСтандартный раствор пирувата натрия, млДистиллированная водаВыражающие активность АСТ и АЛТ количество ммоль пировиноградной кислоты в пересчете на 1 л сыворотки за время инкубации 1ч10,050,550,520,100,501,030,150,451,540,200,402,050,250,252,560,300,303,0ПримечанияСыворотку следует по возможности быстро отделять от сгустка.Бактериальное загрязнение субстрата приводит к искажению получаемых результатов вследствие снижения показателей абсорбции. Субстрат с помутнением использовать для анализа нельзя. Раствор щелочи следует готовить только на прокипяченной дистиллированной воде и хранить в плотно закупоренной стеклянной посуде: большие количества карбоната натрия занижают результаты анализа. Раствор едкого натра необходимо добавлять в пробирку равномерно: не слишком быстро и не слишком медленно. Неравномерное доливание раствора щелочи может стать причиной появления различной интенсивности окраски раствора (!) при одинаковом содержании кетокислоты в образце.Лабораторная посуда должна быть тщательно вымыта. Так, остатки мыльного порошка на стенках пробирки, используемой для взятия крови или хранения сыворотки, могут явиться причиной получения ложноположительных результатов.