Методы выделения белков. Высаливание.

Биохимия ...

Введение……………………………………………………………………...……3
1. Методы выделения белков…………………………………………….………4
2. Высаливание белков…………………………………………………..………..9
Заключение………………………………………………………………….……12
Список использованной литературы………………………………………..….13

Важное место в биохимических исследованиях занимает выделение индивидуальных белков из органов и тканей. ...............................

разделение смеси белков на индивидуальные белки.
Для разрушения биологического материала используют такие методы, как: гомогенизации ткани, метод попеременного замораживания и оттаивания, а также обработку клеток ультразвуком.
Для гомогенизация биологического материала ткань, находящуюся в буферном растворе с определённым значением рН и концентрацией солей, помещают в стеклянный сосуд (гомогенизатор) с пестиком. Вращающийся пестик измельчает и растирает ткань о притёртые стенки сосуда.
В процессе попеременного замораживания и оттаивания биоматериала образующиеся кристаллы льда разрушают оболочки клеток.
После разрушения ткани нерастворимые части осаждают центрифугированием. Последующее центрифугирование гомогената с разной скоростью позволяет получить отдельные фракции, содержащие клеточные ядра, митохондрии и другие органеллы, а также надосадочную жидкость (супернатант), в которой находятся растворимые белки цитозоля клетки. Искомый белок будет содержаться в одной из этих фракций.
Если искомый белок прочно связан с какими-либо структурами клетки, его необходимо экстрагировать (перевести в раствор). Так, для разрушения гидрофобных взаимодействий между белками и липидами мембран в раствор добавляют детергенты; чаще всего используют тритон Х-100 или додецилсульфат натрия (SDS).
При действии детергентов обычно разрушаются и гидрофобные взаимодействия между протомерами в олигомерных белках.
Из раствора также необходимо удалить небелковые компоненты. Нуклеиновые кислоты, липиды и другие небелковые вещества можно удалить из раствора, используя их физико-химические свойства. Например, липиды легко удаляются из раствора добавлением органических растворителей, например ацетона. Однако воздействие должно быть кратковременным, так как ацетон вызывает денатурацию некоторых белков. Нуклеиновые кислоты осаждают добавлением в раствор стрептомицина.
Наиболее трудоемким этапом получения индивидуальных белков является их очистка от других белков, находящихся в растворе. Часто изучаемый белок присутствует в биоматериале в малых количествах, составляющих всего долю процента от всех белков раствора.
Так как белки обладают конформационной лабильностью, при работе с белками избегают денатурирующих воздействий, поэтому выделение и очистка белков производятся при низких температурах.
На первых стадиях выделения индивидуальных белков целесообразно использовать те методы, которые учитывают какую-либо характерную особенность выделяемого белка, например термостабильность или устойчивость в кислых растворах.
На первых этапах очистки необходимо удалить из раствора основную массу балластных белков, которые сильно отличаются от выделяемого белка по физико-химическим показателям. После этого проводят несколько этапов с применением более тонких методов очистки белка.
Первым этапом выделения белков может служить очистка избирательной денатурацией.
Большинство белков денатурирует и выпадает в осадок уже при кратковременном нагревании раствора до 50-70°С или подкислении раствора до рН 5,0. Если выделяемый белок выдерживает эти условия, то с помощью избирательной денатурации можно удалить большую часть посторонних белков, отфильтровав выпавшие в осадок белки, или осадить их центрифугированием.
Один их наиболее распространенных методов выделения белков является метод высаливания, который подробно изложен в п. 2.
Также применяются различные виды жидкостной хроматографии, такие как аффинная, ионообменная и гель-хроматографи (гель-фильтрация).
Аффинная хроматография – это метод очистки и разделения белков, основанный на их избирательном взаимодействии с лигандом, ковалентно связанным с инертным носителем.
В качестве лигандов используют соединения, взаимодействие которых с разделяемыми веществами основано на биологической функции последних. Так, при разделении ферментов (для чего преимущественно и применяется аффинная хроматография) лигандами служат их субстраты, ингибиторы или коферменты.
Главная особенность, которая обусловливает высокую эффективность аффинной хроматографии, состоит в том, что разделение основано на различии не физико-химических признаков молекулы (заряда, формы и размера), а специфических функциональных свойств, отличающих данный фермент от множества других биомолекул.
Ионообменная хроматография – это вариант хроматографии, который позволяет разделять  ионы  и полярные молекулы на основании зарядов разделяемых молекул.
Ионообменная хроматография позволяет разделить молекулы, основываясь на  ионных взаимодействиях. Неподвижная фаза имеет заряженные функциональные группы, которые взаимодействуют с анализируемыми ионизированными молекулами противоположного заряда.
Этот вариант хроматографии классифицируется на два типа  – катионную и анионную ионообменную хроматографию:
Катионная ионообменная хроматография задерживает положительно заряженные катионы, так как неподвижная фаза имеет отрицательно заряженные функциональные группы, например, фосфат (PO43−).
Анионная ионообменная хроматография задерживает отрицательно заряженные анионы, так как неподвижная фаза имеет положительно заряженные функциональные группы, например, +N(R)4.