Магнитные наночастицы, как средство влияния на релаксационные свойства водородосодержащих биологических сред

1.Введение
На сегодняшний день невозможно представить современную медицину без лучевой диагностики, включающую в себя протонно-эмиссионную томографию, рентгеновскую и магнитно- резонансную томографию (МРТ). Внедрение в клиническую практику метода МРТ позволило вывести диагностические возможности медицины на качественно новый уровень. За свои работы по изучению магнитно-резонансной визуализации (МРВ) Пол С. Латербур и Питер Менсфилд получили Нобелевскую премию в 2003 году[44].
Оптимизация результатов диагностической картины достигается использованием магнитно-резонансных контрастных средств (МРКС). Визуализация с применением контрастного средства позволяет значительно увеличить объем диагностической информации, позволяя оценивать динамику патологических процессов с необходимыми в ...

Оглавление
1.Введение……………………………………………………………..............5
2.Обзор литературы…………………………………………………………...7
2.1.Наночастицы магнетита, их свойства и возможности использования в фармакологии и медицине……………………………………………………….7
2.1.1. Наночастицы магнетита, основные свойства……………………............7
2.1.2.Магнитные свойства НЧОЖ. Суперпарамагнетизм и ферримагнетизм..............................................................................................10
2.2. Протонная релаксометрия …………………………………………............11
2.3. Применение наночастиц магнетита в качестве основы для контрастного средства при МРТ диагностике…………………………………………………16
2.3.1. Метод МРТ-диагностики………………………. ………………………16
2.3.2.Клиническое применение МРТ…………………………………………...17
2.3.3.Показаниями для проведения МРТ с контрастным средством…………………………………………………………………….....19
2.3.4.Противопоказания к МРТ…………………………………………………20
2.4.Классификация магнитно-резонансных контрастных средств…………...25
2.5.Взаимодействие наночастиц оксида железа с клетками. Роль стабилизации…...............................................................................................27
3.Материалы и методы……………………………………………………….31
3.1. Методика экспериментального исследования…………………………….32
3.2.Исследуемые соединения и реактивы……………………………………...31
3.3. Методика получения суперпарамагнитных и ферримагнитных
наночастиц сложного оксида железа…………………………………………...33
3.4. Просвечивающая электронная микроскопия……………………………...34
3.5.Измерения протонно-релаксационных свойств НЧОЖ…………………...34
3.6.Клеточная культура фибробластов крысы………………………………....37
3.7.МТТ-тест……………………………………………………………………..38
3.8. Методы статистической обработки данных……………………………….40
4. Результаты и их обсуждение………………………………………………41
4.1.Синтез растворов на основе наночастиц…………………………………...41
4.2.Анализ кривых спада времен релаксации………………………………….44
4.3.Оценка влияния соединений железа на жизнеспособность фибробластов МТТ-тестом……………………………………………………………………....48
Выводы……………………………………………………………………….51
Список литературы…………………………………………………………..52

1.Введение
На сегодняшний день невозможно представить современную медицину без лучевой диагностики, включающую в себя протонно-эмиссионную томографию, рентгеновскую и магнитно- резонансную томографию (МРТ). Внедрение в клиническую практику метода МРТ позволило вывести диагностические возможности медицины на качественно новый уровень. За свои работы по изучению магнитно-резонансной визуализации (МРВ) Пол С. Латербур и Питер Менсфилд получили Нобелевскую премию в 2003 году[44].
Оптимизация результатов диагностической картины достигается использованием магнитно-резонансных контрастных средств (МРКС). Визуализация с применением контрастного средства позволяет значительно увеличить объем диагностической информации, позволяя оценивать динамику патологических процессов с необходимыми в ременными и пространственными разрешениями, повысить разрешение и контрастность при анализе малых объектов, достоверно отличить очаги патологий от здоровых тканей[57]. Основными областями применения контрастных средств являются диагностика и идентификация онкологических образований, в том числе метастазирования, а также заболеваний сердечно-сосудистой системы.
На настоящий момент используются парамагнитные контрастные средства, содержащие гадолиний, имеющие ряд недостатков: токсичность и визуализация объектов только по одному основному параметру Т1(время спин-решеточной релаксации)[26]. В связи с чем, актуальным является разработка нового контрастного средства для МРТ – диагностики, превосходящего по функциональным свойствам уже существующие препараты.
Альтернативным контрастным средством может служить препарат, синтезированный с применением современных нанотехнологий, на основе суперпарамагнитных частиц сложного оксида железа – магнетита. Наночастицы магнитных материалов, с размером частиц соизмеримым с размером магнитного домена, при внесении их во внешнее магнитное поле, выстраиваются в нем без энергетических потерь на междоменное взаимодействие, что позволяет значительно повлиять на характерные времена протонной релаксации исследуемых сред и ключевые параметры для магнитно-резонансной визуализации. Требованием, предъявляемым к новому контрастному средству, кроме достижения необходимых релаксационных свойств, является биологическая совместимость используемых наночастиц с основными тканями организма, а также длительная стабильность водного раствора на их основе[43]. Анализ литературных данных показал, что основные свойства наночастиц, а также растворов на их основе, определяются их размером, который контролируется выбором метода и режимов их синтеза[3]. Необходимо учитывать, что практическое применение принципиально нового контрастного средства может потребовать корректировку существующих МРТ - методик анализа очагов патологий[31].
В связи с выше изложенным, целью данной работы является получение коллоидных растворов, содержащих наночастицы оксида железа различных размеров, и исследование их протонно-релаксационных свойств.
.
Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:
1) Определить режимы метода химического синтеза наночастиц сложного оксида железа с учётом требований к их функциональным свойствам.
2) Определить релаксирующую способность полученных растворов наночастиц оксида железа.
3) Определение цитотоксичности раствора наночастиц сложного оксида железа с помощью МТТ- теста.

Эти методы более сложны в проведении и проводятся только по особым показаниям. На сегодняшний день существует несколько основных способов проведения магнитно-резонансной томографии с контрастом:В первом случае препарат вводится однократно внутривенно непосредственно перед началом сканирования из расчета, в зависимости от контраста, в среднем 0.2 мг на 1 кг массы тела пациента.Второй способ заключается в введении препарата внутривенно капельно. При этом специальный дозатор синхронизирует дозу вводимого препарата с ходом выполнения сканирования. Такой метод называется болюсное контрастирование и применяется при проведении динамической МРТ с контрастом.2.3.4. Противопоказания к МРТ  Противопоказания к МРТ связаны с воздействием магнитного поля и радиочастотного (неионизирующего) излучения. К абсолютным противопоказаниям относятся:- наличие у пациента искусственного водителя ритма (может перейти в асинхронный режим работы под воздействием градиентного магнитного поля)- наличие внутричерепных ферромагнитных гемостатических клипс (при смещении может произойти повреждение сосуда и кровотечение)- наличие периорбитальных ферромагнитных инородных тел (при смещении может произойти повреждение глазного яблока)- выраженная клаустрофобия. У этих пациентов обследование методом МРТ запрещено. К относительным противопоказаниям относятся первый триместр беременности, застойная сердечная недостаточность. Большинство медицинских устройств является условно совместимыми с МРТ. Это значит, что обследование пациентов с установленными стентами, внутрисосудистыми катушками, фильтрами, протезами сердечных клапанов может проводиться при наличии клинических показаний по согласованию со специалистом по лучевой диагностике на основе информации компании-производителя о характеристиках металла, из которого изготовлено установленное устройство. Имеющийся клинический опыт позволяет утверждать, что в подавляющем большинстве таких случаев МРТ абсолютно безопасна для пациентов. 2.4. Классификация магнитно-резонансных контрастных средств. МРКС- неотъемлемая часть клинической МРТ, позволяющая значительно увеличить объем диагностической информации-оценивать динамику патологических процессов с необходимыми временными и пространственными разрешениями. Наиболее доступным, безопасным и широко используемым способом изменения контрастности тканей и органов при МРТ остается изменение времен спин-спиновой Т2(1/Т2) и спин-решеточной релаксации Т1(1/Т1) протонов с помощью парамагнитных веществ. Парамагнитные хелатные комплексы, составляющие основу большинства современных МРКС, повышают скорость релаксации как 1/Т1, так и 1/Т2. По преимущественному влиянию на время релаксации парамагнитные вещества разделяют на преимущественно влияющие на Т2 или Т1. Так, например, магневист целый класс наиболее широко используемых гадолинийсодержащих[19] МРКС влияют на Т1, увеличивая интенсивность магнитно-резонансного сигнала тканей-мишеней, «осветляя» область интереса на Т1-взвешенных изображениях, благодаря укорочению Т1. А супермагнитные и ферромагнитные частицы, обладая большим магнитным моментом, индуцируют локальные неоднородности поля, уменьшая тем самым преимущественно Т2. При этом получают негативное усиление, то есть они делают область накопления препарата более темной, что наиболее ярко проявляется на Т2-взвешенных изображениях[53]. МРКС можно классифицировать в зависимости от особенностей их распределения в тканях и органах. Данные о фармакокинетике МРКС свидетельствуют о целесообразности деления их на внеклеточные (тканенеспецифические) и внутриклеточные, или органотропные (тканеспецифические). Внеклеточные МРКС уже достаточно давно (с 1988 года) широко применяют при проведении МРТ. Тканеспецифические внутриклеточные (резовист, примовист) начали применять лишь в последние 10 лет.Внеклеточные препараты (внутрисосудистое или полостное введение). Имеют небольшую молекулярную массу, распределяются во внеклеточном пространстве[53].-Т1 (позитивные) вещества –Gd-DTPA и другие хелатные комплексы парамагнитных веществ -Т2 (негативные) вещества-Dys-DTPA (диэтилтриаминпентаацетат диспрозия), Dys-DTPA-BMA (диэтиламинтрипентаацетат бисметиламид диспрозия) . 1.1. Длительно циркулирующие в крови вещества вследствие обратимого связывания с сывороточными альбуминами. -Т1 (позитивные) вещества – гадоверсетамид(вазовист) 1.2. Ангиографические макромолекулярные вещества для количественного определения объема и скорости тока крови, маркеры дисфункции капиллярной системы. -Т1 (позитивные) вещества – комплексы Gd-DTPA( других парамагнитных Т1-позитивных веществ) с декстраном, альбумином или полилизином, инкапсулированные в липосомы. -Т2 (негативыне) вещества – хелатные комплексы диспрозия, ковалентно связанные с альбумином.2) Тканенеспецифические препараты, распределение которых связано с взаимодействием с клетками.2.1. Гепатотропные вещества(внутривенное введение), поглощающиеся преимущественно гепатоцитами. -Т1 (позитивные) вещества – Gd-EOB-DTPA(диэтиламинотрипентаацетат этоксибензил гадолиния, примовист), Gd-BOBTA(гадобенат димеглюмина, мультиханс). -Т2 (негативные) вещества- суперпарамагнитные частицы оксиды железа.2.2. Вещества, специфически накапливаемые ретикуло-эндотелиальной системой – в печени, селезенке, лимфатических узлах, костном мозге. -Т1 (позитивне) вещества-липосомы, содержащие парамагнитные Т1-вещества( в клинику не внедрены). -Т2 (негативные) вещества- суперпарамагнитные частицы оксида железа, например резовист.2.3. Вещества, накапливаемые поджелудочной железой. -Т1 (позитивные) вещества- мангафодипир 2.4. Опухолеспецифические вещества. -Т1(позитивные) вещества- моноклональные антитела, пептиды(гормоны, медиаторы), соматотропин и другие вещества, связанные с небоьшими комплексами парамагнитных Т1-веществ. - Т2 (негативные) вещества- те же бионосители, связанные с небольшими комплексами парамагнитных веществ, влияющих на Т2 2.5. Вещества, накапливающиеся в калицификатах. -Т1(позитивные) вещества- дифосфонат Gd-DTPA. Ниже представлена классификация основных МРКС, имеющихся в настоящее время (рис. 3).Рис.3. Классификация контрастных средствТаблица 1.МР-контрастные средства, зарегистрированные и разрешенные к клиническому применению в РоссииКоммерческое названиеХимическое названиеПроизводительМагневист (Magnevist)Gd-DTPA-димеглюмин (гадопентат-димеглюмин)Bayer Schering Pharma AG (Германия)Гадовист (Gadovist)гадобутролBayer Schering Pharma AG (Германия)Дотарем (Dotarem)Gd-DOTA-меглюминGuerbet ФранцияПримовист (PRIMOVIST)Gd-EOB-DTPA (динатрия гадоксетат)Bayer Schering Pharma AG (Германия)Омнискан (Omniscan)Gd-диамидNykomed НорвегияОптимарк(OptiMARK)ГадоверсетамидMALLINCKRODT CHEMICAL, Ltd2.5. Взаимодействие наночастиц оксида железа с клетками. Роль стабилизации. Низкая токсичность – одно из определяющих свойств лекарственного средства. Способов вызвать токсический эффект у наночастиц, например железа, больше, чем у растворимых веществ. Кроме токсичности, присущей веществам, входящим в состав наночастицы, токсичность может быть связана с размером, формой, свойствами поверхности наночастицы. Наночастицы обладают высокоразвитой активной поверхностью и, как следствие, высокой сорбционной емкостью. Благодаря своим размерам (менее 100 нм), сопоставимым с размерами клеток (10—100 мкм), вирусов (20—450 нм), белков (5—50 нм), ДНК (2 нм шириной, 10—100 нм длиной), наночастицы могут приближаться к биообъекту, взаимодействовать и связываться с ним[29].Для биомедицинского применения наночастиц необходимо выполнить ряд требований: образовать устойчивую коллоидную систему в водных растворах и других биосовместимых растворителях, иметь возможность вариации параметров раствора (концентрации солей, рН и температуры) в интервалах, которые определяются целью исследования в каждом конкретном случае. Однако ввиду высокой реакционной активности для наночастиц практически не существует инертной среды. Одной из особенностей поведения наночастиц в растворе является их склонность к агрегации, поэтому практическое использование растворов наночастиц сопряжено с их стабилизацией (нанесение покрытия на поверхность магнитного «ядра», добавление стабилизаторов, подбор растворителей и т.д.)[27].Применяемые покрытия можно разделить на органические (сурфактанты и полимеры) [1,20] и неорганические (кремнезем, углерод, благородные металлы)[8,]. Наиболее распространенными органическими покрытиями наночастиц являются декстран, полиэтиленгликоль (ПЭГ), крахмал, поливинилэтанол, гепарин, высшие карбоновые кислоты, в том числе лимонная кислота[10,11,14,25,26].Помимо защиты от агрегации, окисления, кислотной и щелочной коррозии покрытие может играть роль спейсера для присоединения фармацевтических агентов или биомолекул к магнитному носителю. Благодаря покрытию можно модифицировать поверхность наночастиц различными функциональными группами — азидо-, амино-, карбоксильными, сульфгидрильными, гидроксильными, имидными и другими, что позволяет ковалентно связывать наночастицы с биомолекулами или лекарственными средствами[2]. Образование ионной связи наночастиц с противоопухолевыми препаратами может быть достигнуто в результате нанесения на наночастицы (уже покрытые полимером с целью стабилизации коллоидного раствора) второго слоя полимеров, поли-DL-лактид-ко-гликолида (PLGA), полилактида (PLL) или дендримеров[9]. Дополнительной важной функцией покрытия наночастиц является повышение их биосовместимости.Так, показано, что покрытие декстраном препятствует опсонизации магнитных наночастиц клетками ретикулоэндотелиальной системы при введении их в кровоток[23,13]. Поверхностная модификация ПЭГ снижает поглощение наночастиц макрофагами и благодаря наличию полярных и неполярных группировок способствует эффективному проникновению через мембрану клетки. Такой стабилизатор как лимонная кислота не обладает сильными поверхностно- активными свойствами, так как мала СН цепочка, но приемлема с биологической точки зрения, так как данная кислота-участник цикла Кребса, что способствует ускорению биохимического метаболизма. Также показано, что лимонная кослота обладает низкими токсическими свойствами.Важно отметить, что иммобилизация на поверхности наночастицы приводит к стабилизации биомолекул и служит защитой от деградации их под воздействием различных факторов. Показано, что ДНК, иммобилизованная на поверхности наночастицы[28], сохраняет свою стереометрию и устойчива к действию нуклеаз[5,7]. При иммобилизации белков и ферментов на магнитных частицах их стабилизация достигается главным образом за счет стабилизации конформационной структуры и за счет предотвращения ферментативной деградации[8,15]. Благодаря малым размерам соединение с наночаcтицей не приводит к денатурации белковых молекул, что очень важно для сохранения функциональной активности и аффинитета к мишени, например при нацеливании посредством антител[12]. При поиске МРКС исследователи обратили внимание на наночастицы оксида железа, обладающие достаточной контрастирующей способностью. Среди железосодержащих МРКС выделяют: SPIO – суперпарамагнитный оксид железа; USPIO - суперпарамагнитный оксид железа в виде ультрамалых частиц и MIOH – монокристаллический оксид железа.Препараты SPIO (Fe23+O3) имеют кристаллическую структуру и сильно ускоряют протонную релаксацию тканей. Диаметр частиц SPIO меньше эритроцита, что позволяет им проникать через капиллярную сеть. Разработанные препараты SPIO имеют необходимые величины заряда и размера для избирательного поглощения клетками ретикуло-эндотелиальной системы (РЭС). После деградации SPIO и РЭС атомы железа включаются в состав гемоглобина эритроцитов. Количество железа, поступающего в организм в составе SPIO при диагностике, значительно ниже общей величины депо железа. Препараты SPIO относятся к тканеспецифическим МРКС, имея тропность к РЭС и позволяя контрастировать важные органы человеческого организма( печень, селезенка, костный мозг).3.Материалы и методы.3.1. Методика экспериментального исследования Цель работы: является получение и исследование протонно-релаксационных свойств коллоидных растворов наночастиц оксида железа различных размеров.434340090170002171700901700009017000Задача работы №1Определить режимы метода химического синтеза наночастиц сложного оксида железа с учётом требований к их функциональным свойствам57150035560000Задача работы №2Исследование влияния полученных растворов наночастиц сложного оксида железа на протонно-релаксационные параметры различных биологических средах.50609535687000Задача работы №3Определение цитотоксичности раствора наночастиц сложного оксида железа 43434004318000Методы, используемые для решения данной задачиРеакция Элмора(получение раствора НЧОЖ), центрифугирование (отделение крупных частиц от мелких), просвечивающая электронная микроскопияМетоды, используемые для решения данной задачиПротонная релаксометрияМетоды, используемые для решения данной задачиМТТ- тест.3.2.Исследуемые соединения и реактивы.МТТ – тиазолий синий тетразолий бромид («ДиаэМ», Германия)Раствор ВЕРСЕНА («ПанЭко», Россия)Раствор трипсина 0,25% («ПанЭко», Россия)Среда DMEM/ cNa2CO3 («ПанЭко», Россия)Сыворотка крови эмбриональная телячья («ПанЭко», Россия)НЧОЖ (Образец в состав которого входят частицы железа размеров 50-60нм). Частицы получены на кафедре молекулярной фармакологии и радиобиологии им. Академика П.В.Сергеева МБФРезовист(RV)-железосодержащее контрастное средство, предназначенное для диагностики печени со средним размером частиц 30-50 нм.Лимонная кислота- C6H8O7Цитрат натрия- Na3C6H5O7Н2О-дистиллированная водараствор хлорида железа IIраствор хлорида железа IIIраствор солей Fe (II) и Fe (III)аммиак- NH33.3. Методика получения суперпарамагнитных и ферримагнитныхнаночастиц сложного оксида железа. Анализируя последние литературные данные, а также прослеживая прогресс, достигнутый за последние десять-пятнадцать лет, можно сказать, что проведение химических реакций в растворах представляет собой один из наиболее удобных путей для получения магнитных наночастиц. Формирование наночастиц достигается путем подбора определенных условий протекания реакции (тип реакции, растворитель, температура) и использованием лигандов и поверхностно-активных веществ, специфически ведущих себя на возникающей границе раздела фаз и полностью или частично ограничивающих дальнейший рост твердой фазы[33]. Предлагаемый нами в качестве действующего вещества сложный оксид железа – магнетит (Fe3O4) был получен химическим методом при осаждении магнетита щелочью из водного раствора солей двухвалентного железа в строго выбранных условиях таким образом, чтобы размер частиц в коллоидном растворе не превышал 5 – 9 нм. В качестве основной химической реакции, для получения наполнителя магнитной жидкости выбрана реакция Элмора[6], при этом исходные реактивы представляют собой соли трех и двух валентного железа:2 Fe Cl 3 + FeCl 2.+ 8 NH 4 OH Fe 3 O 4 + 8 NH 4 Cl + 4 H 2 OFeSO4*4 H2O в количестве 3 г растворяли в 12,5 мл воды и 6 г FeCl3*6H2O в 12,5 мл воды, каждую по отдельности в течении 15 мин. интенсивно перемешивая. Затем оба раствора перемешивали в течение 1 часа с рекомендуемой скоростью 800 об/мин. Аммиак добавляли со средней интенсивностью в количестве 25 мл, в течение 15 мин интенсивно перемешивая. Затем добавляли стабилизатор- цитрат натрия в концентрации 2,4мг/мл. 3.4. Просвечивающая электронная микроскопия Размер и дисперсный состав наночастиц определялся на микроскопе высокого разрешения JEOL JEM-1011, являющегося наиболее оптимальным для исследования наночастиц такого размера (5-20 нм) с последующей обработкой данных.3.5.Измерения протонно-релаксационных свойств НЧОЖ. Мы изучали времена спин-спиновой релаксации (Т2) протонов в образцах на ЯМР-релаксометре РС-120 фирмы «Брукер». Рис. 4. Ямр-релаксометр серии minispec mq фирмы «Брукер».ЯМР-релаксометр для измерения времён релаксации Т1 и Т2 в биологических жидкостях в составе:1. Управляющий электронный блок с высокочастотным передатчиком.Качественные характеристики:- закрытая, не требующая обслуживания система с воздушным охлаждением, с экранированием от электромагнитных помех, со светодиодной индикацией для диагностики подключения и напряжения на блоке питания- встроенный центральный процессор с возможностью управления в режиме реального времени, динамическое ОЗУ и флэш-ПЗУ для встроенного ПО- 10 Мб Ethernet адаптер для соединения с локальным ПК и загрузки встроенного ПО. Полностью удаленный контроль с помощью ПО.- прямой цифровой радиочастотный генератор и импульсный программатор, частотный диапазон 2-65 MHz, с шагом 1 Hz. Восемь свободных программируемых вспомогательных импульсных каналов. Генерация 0°, 90°, 180° и 270° импульсов, с фазовым разрешением лучше, чем 0.2°- возможность внешнего включения/выключения2. Магнитная закрытая система на базе магнита частотой 20 МГц, 470 мТл, с внутренней воздушной циркуляцией и автоматизированной системой поддержки температуры 35-45 Сº, точность поддержания температуры лучше чем 0.01 Сº- быстрая смена измерительных датчиков- автоматическое распознавание измерительных датчиков- автоматическое распознавание ампулы с образцом- расстояние между полюсами магнита 33 мм- возможность работы с измерительными датчиками 1H и 19F3.Измерительный датчик:- Измерительный датчик на 1H, для магнитной системы 20 МГц, для относительных измерений, позволяющий работать с пробирками диаметром 10 мм.-датчик поставляется со специальными проверочными образцами для тестирования их работоспособности и настроек прибора.4. Лицензионное программное обеспечение.ПО должно позволять управлять магнитными системами, осуществлять их тестирование, программировать импульсные последовательности, сохранять их, с возможностью использовать в дальнейшем, строить калибровки и зависимости, выводить на экран результаты, создавать и печатать протоколы результатов анализа, контролировать и управлять периферийными устройствами.Методика измерений – импульсная последовательность КПМГ(90°-(τ-180°-τ)n). Кривые спада измерялись в 10 точках (временной диапазон 0,3-30млсек). Накопление сигнала 4 – кратное. Времена спин-решеточной релаксации измерялись с помощью импульсной последовательности –( 180°-τ-90°), количество точек – 10. 3.6.Клеточная культура фибробластов крысы.Для оценки цитотоксичности исследуемых соединений были выбраны фибробласты теменной кости крысы. Фибробласты легко поддаются культивации in vitro и являются стандартным объектом при доклинических испытаниях[21]. Для получения культуры извлекали в асептических условиях ламинарбокса теменную кость новорожденной крысы, измельчали стерильными ножницами на фрагменты 1- 2мм3 . Затем среду с фрагментами ткани наносили на дно плоскодонных культуральных пластиковых флаконов «Costar» Использовали стандартную среду DMEM с добавлением 20% ермоинактивированной эмбриональной телячьей сыворотки, L-глутамина в концентрации 100 мкг/мл и антибиотика – гентамицина сульфата – в концентрации 40 мкг/мл. Через неделю наблюдали образование на поверхности флакона участков клеточного монослоя, растущего из прикрепленных фрагментов. Клетки для равномерного распределения подвергали обработке трипсином и еще через 1 неделю получали монослойную культуру (рис.9)Рис.5. Монослойная культура клеток нормальных фибробластовКультивирование клеток осуществлялось в пластиковых флаконах в стерильных условиях, клетки инкубировались при 37ºС в условиях 5% СО2. При культивировании клеток использовали стандартную среду DMEM с добавлением 20% термоинактивированной эмбриональной телячьей сыворотки, L-глутамина в концентрации 100 мкг/мл и антибиотиков – гентамицина сульфата и стрептомицина сульфата – в концентрации 40 мкг/мл.Работа с клетками производилась в асептических условиях с использованием ламинарного бокса ЛС (Россия).