Активность кальцийзависимых протеиназ в мозге крыс с экспериментальной нейропатологией

Работа защищена на отлично в мае 2015 года. Шрифт Times New Roman, 12. ...

ВВЕДЕНИЕ
ГЛАВА 1.ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1 Кальпаин/кальпастатиновая протеoлитическая система
1.2 Биохимические механизмы развития нейродегенеративных заболеваний
ГЛАВА 2.МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1 Реагенты и приборы
2.2 Моделирование нейродегенерации у лабораторных животных
2.3 Анализ биохимических показателей
2.3.1 Экстракция белков из тканей
2.3.2 Определение активности кальпаинов
2.3.3 Зимография с казеином
2.3.4 Электрофорез белков полиакриламидном геле
2.3.5 Вестерн-блот анализ
2.3.6 Другие методы
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
3.1 Кальпаин/кальпастатиновая система у крыс, подвергнутых индуцированной бета-амилоидом нейродегенирации на фоне эстрогенной терапии
3.2 Кальпаин/кальпастатиновая система у крыс, подвергнутых глутамат-индуцированной нейродегенирации на фоне терапии потенциальными нейропротекторами
ВЫВОДЫ
ЗАКЛЮЧЕНИЯ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Нейродегенеративные заболевания ‒ болезни Альцгеймера, Паркинсона и другие – представляют в странах с высокой продолжительностью жизни населения огромную медицинскую, социальную, финансовую и научную проблему. Распространенность этих заболеваний растёт по мере старения населения, и большинство развитых стран уже сейчас оказывают специальную поддержку исследованиям в области изучения нейродегенеративных заболеваний.
К настоящему времени участие внутриклеточных протеиназ в нейродегенеративных процессах не вызывает сомнений. С одной стороны, недостаточная интенсивность протеиназозависимых процессов при нейродегенеративных заболеваниях способствует накоплению большого количества патологических белков, например, бета-амилоида и тау-протеина при болезни Альцгеймера, альфа-синуклеина при болез ни Паркинсона и других. С другой стороны, протеиназы регулируют основные пути гибели клеток при нейродегенерации – апоптоз, некроз и аутофагию. Таким образом, для нервной ткани жизненно важно поддержание тонкого баланса активности протеиназ, при этом может быть необходимым как повышение их активности для разрушения патогенных белков, так и снижение – для предотвращения массовой гибели нейронов. Са2+-зависимые протеиназы, или кальпаины, относящиеся к семейству С2 цистеинового типа, представлены в тканях ЦНС пятью ферментами – основными μ- и m-кальпаинами (КФ 3.4.22.52 и 3.4.22.53, соответственно) и минорными кальпаинами 3, 5 и 10. Участие Са2+-зависимых протеаз в нейродегенеративных процессах – общебиологическое явление, обнаруживаемое у широкого круга организмов – от нематоды С. elegans до приматов.
В силу особенностей биологии (неспособность к митозу) нейроны особенно чувствительны к накоплению недеградированных продуктов белкового обмена, в норме эффективно разрушаемых внутриклеточными протеиназами. Известно, что в нормальных условиях более 25% синтезированных de novo клеточных белков содержат ошибки и подвергаются быстрому разрушению. Ослабление протеиназоассоциированной функции контроля качества клеточных белков (в силу нарушения синтеза и/или регуляции протеиназ из-за сенильных изменений или при действии неблагоприятных экзогенных или эндогенных факторов) приводит к накоплению клеточных белков с ошибками биосинтеза и с нарушенной конформацией. Дефектные белки нефункциональны, участвуют в аберрантных взаимодействиях, образуют нерастворимые белковые агрегаты и приобретают свойства цитотоксичности. В связи с этим, проект направлен на изучение роли внутриклеточных протеиназ в механизмах возрастной и патологической нейродегенерации.
Целью экспериментальной и теоретической работы было изучение роли внутриклеточных кальцийзависимых протеиназ (кальпаинов) в развитии индуцированных нейродегенеративных нарушений и механизмов торможения кальпаинозависимых этапов нейродегенерации путём введения нейропротекторов. Объект исследования - лабораторные крысы- биомодели нейродегенеративных патологий человека. Для достижения поставленной цели было необходимо решить следующие задачи:
1) анализ литературных источников по проблеме разнообразия молекулярных форм кальпаинов в тканях млекопитающих, их эндогенных регуляторов и роли кальпаиновой системы в развитии нейродегенеративных процессов;
2) освоение методических приёмов выделения кальцийзависимых протеиназ из тканей животных, разделения их молекулярных форм, определения протеолитической активности, количественной оценки уровня ингибитора кальпастатина;
3) проведение экспериментов с лабораторными животными: индуцирование нейродегенерации путём введения экзогенных веществ, её коррекция потенциальными нейропротекторами, проведение поведенческих тестов, взятие биологического материала (органов крыс) для биохимического анализа;
4) биохимический анализ протеолитической активности разных молекулярных форм кальпаинов и количественная оценка их ингибитора - кальпастатина в нервной ткани крыс разных экспериментальных групп;
5) анализ результатов об участии кальпаинов и их регуляторов в развитии индуцированной нейропатологии и возможности купирования кальпаинозависимых нарушений потенциальными нейропротекторами.

3.4 Электрофорез белков в полиакриламидном гелеЭлектрофорез белков в полиакриламидном геле – метод разделения смесей белков в полиакриламидном геле в соответствии с их электрофоретической подвижностью, детерминированной длиной полипептидной цепочки, молекулярной массой, укладкой белковой молекулы, посттрансляционными модификациями и другими факторами. Данный способ фракционирования белков и пептидов широко применяют в современной молекулярной биологии, биохимии, генетике.Разработано большое количество модификаций электрофореза белков в полиакриламидном геле для решения разных задач и для различных белков и пептидов. Наиболее распространённой разновидностью является электрофорез белков в полиакриламидном геле (ПААГ) в присутствии додецилсульфата натрия (SDS) по Лэммли (Laemmli, 1970).1. 30% раствор акриламида (акриламид : бис- акриламид =74,1 : 1) (объем 100 мл)29,6 г акриламида; 0,4 г бис-акриламида; растворить в 100 мл б/д воды; профильтровать; хранить в тёмном месте.2. Буфер А: 1,5 М трис-HCl-буфер, рH =8,8 (объем 200 мл)36,312 г трис на 200 мл б/д воды3. Буфер В: 0,5 М Трис-НCl-буфер, pH= 6,8 (объем 200 мл)12,114 г трис на 200 мл б/д водырН довести концентрированной HCl до нужного рН4. 50% SLB-буфер:20% глицерин, берём для приготовления 25 мл глицерина 25 мл 0,1 М Трис-HCl, рН=6,810 мМ ЭДТА, навеска 0,47 г10 мМ 2-меркаптоэтанола, берём для приготовления 100 мкл0,02 % бромфенолового синего, навеска 0,03 г5. Буфер для электрофореза (5-кратный), рН = 8. Не требует подведения рН (объем 1 л):125 мМ Трис, навеска 15,14 г626 мМ глицерина, навеска 46,92 г5 мМ ЭДТА, навеска 1,86 г.Непосредственно перед использованием разбавить до однократного, добавить 10 мМ 2-МЭ (или 1 мМ ДТТ), для этого к 200 мл 5х-буфера прилить 800 мл б/д воды и добавить 0,8 мл 2-МЭ6. Фиксаж:45% этанол45% вода 10% уксусная кислота7. Окраска:0,5% кумасси10% уксусная кислота40% этанол50% вода8. Отмывка:10% уксусная кислота9. Лизирующий буфер (для гомогенизации) (объём 200 мл)50 мМ HEPES, навеска 2,384 г, pH 7,6 (довести конц. щёлочью)150 мМ хлорид натрия, навеска 1,77 г10% глицерин, объём 20 мл0,1% Тритон Х-100, объём 0,2 мл5 мМ ЭДТА, навеска 0,3724 г.10 мМ ДТТ, навеска 0,308 г.2.3.5 Вестерн-блот анализ Вестерн-блот анализ по тестированию количества кальпастатина включал разделение тканевых белков (30 мкг на дорожку) методом электрофореза в 12% ПААГ в присутствии SDS (Laemmli, 1970) с последующим полусухим переносом полипептидов на нитроцеллюлозную мембрану (буфер: 48 мМ Трис-HCl, 39 мМ глицин, 0.0375% SDS, 20% метанол, pH 9.2). После инкубации (2 ч, 20°C) мембраны в буфере TBS (50 мМ Трис-HCl-буфер, 150 мМ NaCl, pH 7.5) проводили блокировку сайтов неспецифического связывания 5% раствором обезжиренного молока в буфере TBST (TBS с добавлением 0.1% Tween 20, pH 7.5) в течение 1 ч. Далее мембрану подвергали последовательному экспонированию с поликлональными антителами к кальпастатину (разведение 1 : 2500 в буфере TBST; 1 ч) и с антителами к IgG кролика, конъюгированными с пероксидазой (разведение1 : 2000 в буфере TBST; 1 ч); каждый из указанных этапов завершался многократной отмывкой буфером TBST. Мембрану подвергали стандартной обработке системой Immune-Star (Bio-Rad, США).2.3.6 Другие методыКонцентрацию белка во фракциях определяли методом Брэдфорд (Bradford, 1976) с использованием бычьего сывороточного альбумина (BSA) в качестве стандарта.Денситометрия полос на зимограммах и рентгеновской пленке проводилась с помощью стандартной программы “Image J”.Статистическую обработку данных проводили с применением общепринятых методов вариационной статистики с использованием пакетов программ MS Excel и StatGraphics. Достоверность различий оценивали с помощью непараметрического критерия U (критерий Вилкоксона-Манна-Уитни), а также с использованием однофакторного дисперсионного анализа (Коросов, Горбач, 2007).ГЛАВА 3.РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ3.1. Кальпаин/кальпастатиновая система у крыс, подвергнутых индуцированной бета-амилоидом нейродегенерации на фоне эстрогенной терапииНейродегенерация индуцировалась у крыс линии Вистар старших возрастных групп – 12 и 24 месяцев. Экспериментальное воздействие заключалось в интрацеребральном введении 42-членного фрагмента амилоидного белка-предшественника – Абета(1-42) (экспериментальная модель болезни Альцгеймера), а также сочетанном интрацеребральном введениие бета-амилоидного пептида и интраназальном введении нейропротектора (эстрадиола). Среди животных были выделены: группа контроля – ложно-оперированные (2 μл физраствора в область правого гиппокампа); первая опытная группа – 2 μл раствора пептида Абета(1-42) (соответствуют 5μг пептида) в область правого гиппокампа; вторая опытная группа – после аналогичной инъекции пептида Абета(1-42) ежедневное интраназальное введение 0,1 мг 17-бета-эстрадиола. Было обнаружено, что в присутствии амилоидогенного пептида в нервной ткани происходит активация кальпаиновой системы, причем степень активации положительно коррелирует с интенсивностью гибели клеток нервной ткани (плотностью нейронов). Регуляция кальпаинов может осуществляться как на уровне синтеза ферментного белка (или отдельных его форм – продуктов разных генов), так и на посттрансляционном уровне за счет процессов аутолиза, связывания с эндогенным ингибитором кальпастатином или с аллостерическим регулятором – кальцием.Обнаруженное методом казеиновой зимографии увеличение пула аутолизированных кальпаинов (118 кДа) в группе животных №2 отражает активацию кальпаинов in vivo. Наблюдаемая активация m-кальпаина (120 кДа), по-видимому, как и во многих других ситуациях, сопряжена с избытком кальция в цитоплазме. Еще одним подтверждением этого пути регуляции активности кальпаинов служит стабильный уровень их ингибитора – кальпастатина, обнаруженный в нашем исследовании.Как оказалось, терапия эстрадиолом обращает эффект гиперактивации кальпаинов, при этом снижается как общая активность кальпаинов в нервной ткани, так и активность индивидуальных фракций. В присутствии эстрадиола меньшая доля предшественника кальпаина подвергается аутолизу, а следовательно, активации. Необходимы дальнейшие исследования механизма регуляции активности кальпаинов у экспериментальных животных, в частности, необходимы эксперименты, направленные на установление источника избыточного кальция и поиск средств, предотвращающих эти патологические токи. Уровень синтеза протеасом в мозговой ткани невысок в сравнении с другими органами и имеет тенденцию к снижению с возрастом (при сравнении показателей у 18, 24 и 30-месячных животных), о чем судили по количеству альфа-1,2,3,5,6,7 субъединиц протеасом, формирующих альфа-кольца коровой 20S частицы, универсальной для 20S и 26S протеасом. Было подтверждено изменение уровня экспрессии и активности катепсинов в разных зонах мозга у экспериментальных животных. Интрацеребральное введение бета-амилоидного пептида привело в нашем эксперименте к значительному повышению (p<0,05) экспрессии гена катепсина D в коре (правом полушарии) головного мозга крыс по сравнению с животными контрольной группы. В неокортексе крыс, которые после введения бета-амилоидного пептида получали эстрадиол, относительный уровень экспрессии данного гена не отличался от контрольных значений, то есть восстанавливался до нормального уровня. В области правого гиппокампа введение бета-амилоидного пептида привело к увеличению экспрессии гена катепсина D приблизительно в 7 раз (p<0,001). Последующее введение эстрадиола привело к еще большему возрастанию (в 30 раз) относительной экспрессии указанного гена (p<0,001). Наши данные продемонстрировали значительное влияние бета-амилоида и эстрадиола на когнитивные функции крыс, оцененные с помощью водного лабиринта Морриса. У заранее обученных самок и самцов крыс после введения бета-амилоидного пептида в гиппокамп значительно (p<0,05) увеличилось время поиска скрытой подводной платформы. Последующее введение эстрадиола сокращало время поиска подводной платформы у животных обоих полов по сравнению с таковыми, получившими только бета-амилоид. При этом у самок время поиска уменьшилось более значимо (p<0,01), чем у самцов (p<0,05). Результаты конфокальной микроскопии срезов мозга показали, что введение бета-амилоидного пептида привело к значительному увеличению уровня его иммунореактивности в тканях как правого, так и левого (в меньшей степени) полушария головного мозга. Эти результаты, наряду с поведенческими данными, свидетельствуют об эффективности введенного препарата амилоидного пептида и служат доказательством репрезентативности выбранной модели болезни Альцгеймера. Последующее введение эстрадиола привело к снижению количества бета-амилоида в мозге крыс почти до контрольного уровня. Сокращение амилоидных депозитов у крыс, получавших эстрадиол, свидетельствует о запуске в нервной ткани неких адаптационных процессов, направленных на их утилизацию. Механизм нейропротекторной роли эстрадиола пока полностью не понят, хотя отмечен этот феномен давно. Использование эстрадиола в качестве нейропротектора продиктовано несколькими причинами. Во-первых, нейропротективный эффект эстрадиола довольно хорошо известен и описан в литературе (McEwen et al., 2001; Asimiadou et al., 2005; Lebesgue et al., 2009). Во-вторых, показано, что эстрадиол в полном смысле слова является нейростероидом, так как в мозге имеются все ферменты, необходимые для его синтеза (Stoffel-Wagner, 2001; Reddy, 2010). В-третьих, известно, что нейропротективное действие эстрадиола связано с его антиоксидантным (Behl et al., 1997) и антиапоптотическим (Asimiadou et al., 2005) действием, то есть с эффектами, противоположными эффектам пептида Aбета.Полученные результаты могут свидетельствовать об адаптивной реакции нервной ткани на введение токсичного пептида. В некоторых публикациях указывается на то, что система лизосомальной аутофагии может принимать участие в деградации бета-амилоидного пептида (Nixon, 2007). Вероятно, эстрадиол стимулирует аутофагию белкового материала; об этом свидетельствуют как данные о содержании пептида Aбета в мозговой ткани, так и оценка активности и уровня экспрессии протеиназ лизосом. Методом флюоресцентной иммуногистохимии было установлено снижение количества бета-пептида у крыс, получавших нейропротективную терапию эстрадиолом.На основании данных, полученных в эксперименте можно сделать следующие выводы. 1. Уровень экспрессии генов лизосомальных протеиназ CtsD, CtsB, CtsL и альфа-субъединиц протеасом и активность кодируемых ими ферментов в коре головного мозга крыс при старении снижается. Напротив, активность кальпаинов у животных старших возрастных групп повышается. 2. Уровень экспрессии и активности катепсина D, а также интенсивность кальций-зависимого протеолиза значительно возрастают в гиппокампе и коре головного мозга крыс после интрацеребрального введения бета-амилоидного пептида, при этом страдает когнитивная функция животных. 3. Введение эстрадиола на фоне бета-амилоидной интоксикации приводит к уменьшению содержания этого пептида в гиппокампе крыс и улучшению биохимических и поведенческих показателей у экспериментальных животных. 4. Фармакологическая активация лизосомальной функции эстрогенами может способствовать удалению Aбета при болезни Альцгеймера; нормализация кальциевого гомеостаза в этой ситуации предотвращает патологическую активацию кальпаиновой системы, а, вместе с тем, и потерю нейронов по кальпаин-зависимым путям клеточной гибели. 3.2 Кальпаин/кальпастатиновая система у крыс, подвергнутых глутамат-индуцированной нейродегенерации на фоне терапии потенциальными нейропротекторамиДля индуцирования патологической нейродегенерации нами была использована модель глутаматной токсичности, сопровождающей многие нейродегенеративные заболевания и нормальное старение. Глутамат – самый распространенный в центральной нервной системе возбуждающий нейромедиатор; около 40% всех синапсов головного мозга – глутаматергические (Fairman, Amara, 1999). Хотя глутамат является жизненно важным нейромедиатором, он также является и мощным нейротоксином, который может вызывать гибель нервных клеток (Kim et al., 2011). Глутамат освобождается из глутаматергических нервных окончаний в синаптические щели и в норме должен быть удален из них (Kanai, Hediger, 2003). Накопление избытка внеклеточного глутамата и последующая гиперстимуляция глутаматергических рецепторов приводит к увеличению продукции активных форм кислорода и азота, которые индуцируют оксидативный стресс и гибель нейронов (Ganel, Rothstein, 1999; Kim et al., 2011). Предполагается, что основной вклад в эксайтотоксичность вносит активация NMDA-рецепторов (Tanovic, Alfaro, 2006), которые являются Ca2+-каналами. В соответствии с ранее поставленными задачами, были получены следующие результаты:1. Проявления нейродегенерации, индуцированной острым воздействием экзогенного глутамата, о которых судили по результатам гистоморфологии нервной ткани различных зон головного мозга (правого и левого полушарий, гиппокампа) и поведенческих тестов, менее выражены в сравнении с нейродегенерацией, индуцированной амилоидным бета-пептидом (. Нами не выявлено существенного повреждения тканей центральной нервной системы при использованной дозе эксайтотоксического агента, что подтверждается как микроскопическими, так и молекулярно-биологическими данными, вместе с тем, страдает когнитивная функция животных. Проведенное тестирование поведенческих реакций (водный лабиринт Морриса) позволило оценить степень нарушения когнитивной функции у экспериментальных животных. Так, в группе 3 (острое воздействие глутамата) нарушения были оценены как умеренные, а между группами животных 1, 2, 4 различия отсутствовали (нарушений не наблюдалось). Таким образом, в сравнении с проявлениями амилоидной токсичности нейротоксичность глутамата имеет менее выраженный характер. 2. Установлено, что глутаматная токсичность оказывает специфическое действие на характер ответной реакции различных протеолитических систем клетки и, как следствие, регулируемых ими процессов клеточной гибели и выживания. На изученной нами модели нейродегенерации показано, что уровень экспрессии генов лизосомальных протеиназ (катепсинов В, D и L), конститутивных субъединиц протеасомы, а также активность кодируемых ими ферментов достоверно не изменяются в гиппокампе и коре головного мозга крыс после острого воздействия глутамата, тогда как снижается интенсивность кальций-зависимого протеолиза.Интрацеребральное введение глутамата привело к значительному (до 50%) снижению протеолитической активности кальпаинов, при этом тормозился и процесс их аутокаталитической активации, и активность полноразмерной и аутолизированной форм. Уровень ферментов и их внутриклеточного ингибитора, кальпастатина, при этом не изменялся, что свидетельствует о регуляторных воздействиях, по всей видимости, о снижении уровня внутриклеточного кальция. Наши результаты, в первом приближении, противоречат установленному учеными из мединститута Г.Хьюза в 2000 году механизму участия кальпаинов в нейродегенерации (Lee et al., 2000), который со временем находит все больше экспериментальных подтверждений и, по-видимому, в общих чертах универсален для большинства нейродегенеративных заболеваний. Согласно классическим представлениям, цитотоксический эффект агентов разной природы (глутамата, амилоидного бета-пептида и других белковых агрегатов), сопряжен с нарушением кальциевого гомеостаза (LaFerla, 2002), а избыток Са2+ в цитоплазме вызывает персистентную «патологическую» активацию кальпаинов (Goll et al., 2003; Araújo et al., 2007). Нерегулируемый гидролиз субстратов кальпаинов – структурных и регуляторных белков нервной ткани, в том числе проапоптотических – негативно сказывается на морфологии и функциях нейронов и приводит к подавлению базовых механизмов их выживания (Bezprozvanny, 2009; Vaisid et al., 2008; Vosler et al., 2008). Таким образом, роль кальпаинов в нейродегенерации реализуется на многих этапах – от образования токсичных конформеров клеточных белков в ходе их «патологического» процессинга кальпаинами до реализации программ клеточной гибели по путям апоптоза и(или) некроза. Однако, в последнее десятилетие все больше доказательств находит гипотеза о том, что вышеописанная последовательность событий в развитии кальпаин-зависимой нейродегенерации – лишь вторичное явление, а на ранних этапах нейропатологии имеет место дефицит кальция и кальций-регулируемых процессов, включая функциональную активность кальпаинов (Chen et al., 2001). По-видимому, этот этап кратковременен и протекает в отсутствие видимых признаков заболевания, но, вполне вероятно, на модели острой глутаматной токсичности мы смогли уловить именно эту фазу биохимических изменений в клетках; отдаленные последствия мы смогли бы проследить только в том случае, если бы перешли к модели хронической глутаматной токсичности, например, путем интрацеребрального микродиализа.Полученные нами результаты свидетельствуют о том, что экспрессия гена лизосомальной протеиназы катепсина D CtsD у крыс, которым вводили глутамат в правый гиппокамп, практически не изменилась в изученных отделах мозга у самок крыс, но оказалась снижена у самцов. Так был получен неожиданный для нас результат, свидетельствующий о вероятном блокирующем эффекте глутамата на индукцию экспрессии катепсина D. Наши данные указывают на то, что у самок крыс введение глутамата не оказывало столь значительного повреждения в правом полушарии головного мозга, как у самцов. Полученные нами данные о половой специфике ответной реакции хорошо согласуются с данными литературы: исследования на крысах и мышах показывают существование половых различий в количестве погибших нейронов после фокального ишемического повреждения (окклюзия средней мозговой артерии).3. Показано, что эстрадиол (потенциальный нейропротектор) оказывает влияние на уровень синтеза и протеолитической активности лизосомальных протеиназ (но не кальпаинов), а его введение животным, подвергнутым острому воздействию глутамата, приводит к активации протеиназ, отвечающих за аутофагию (лизосомальных катепсинов), и к восстановлению физиологического уровня активности кальпаиновой системы в мозге крыс, а также к улучшению других биохимических и поведенческих показателей у экспериментальных животных. Воздействие эстрадиола оказалось положительным при разных типах нейродегенерации (амилоидной и глутаматной).Индивидуальное введение эстрадиола (группа 2, ложно-оперированные + эстрадиол) отразилось на уровне экспрессии гена CtsD (но не генов кальпаинов Capn1, Capn2) у животных, причем по-разному у самок и самцов. Так, у самцов экспрессия гена CtsD в левом гиппокампе увеличилась по сравнению с контролем более чем в 1,5 раза. Такое изменение в левом гиппокампе мы можем объяснить адаптивными механизмами, которые были индуцированы введением эстрогена после повреждения контралатерального гиппокампа введением физиологического раствора. По всей видимости, левый, неповрежденный гиппокамп был вынужден частично взять на себя выполнение функций поврежденной доли гиппокампа, что привело к адаптивному увеличению экспрессии гена катепсина D, о связи которого с когнитивными функциями известно из литературы (Payton et al., 2003; Payton, 2006). Аналогичное изменение у самцов крыс, получавших эстрадиол, было нами обнаружено в экспрессии гена CtsD в коре правого полушария, где экспрессия данного гена в 2,25 раза превышала контрольный уровень (р<0,01). Повышение экспрессии CtsD под влиянием эстрадиола может свидетельствовать об усилении аутофагических процессов в нейронах головного мозга крыс, необходимых, в частности, для получения пула свободных аминокислот и компенсации травматического повреждения. Отсутствие аналогичного эффекта у самок крыс можно объяснить изначально более высоким уровнем нейропротективного гормона эстрадиола в кровеносной системе и мозге.