Методы контроля биомассы и количество клеток при культивировании

Новгу 2014 ...

Основная ферментация
Под ферментацией понимают всю совокупность последовательных операций от внесения в заранее приготовленную и нагретую до требуемой температуры среду посевного материала и до завершения процесса роста клеток или биосинтеза целевого продукта. По окончании ферментации образуется сложная смесь, состоящая из клеток продуцента, раствора непотребленных питательных компонентов и накопившихся в среде продуктов биосинтеза. Такую смесь называют культуральной жидкостью.

Под определением биомасса подразумевается общая концентрация микроорганизмов или клеток на твёрдой или жидкой питательной среде при культивировании. Наиболее чувствительный метод контроля биомассы – подсчёт клеток с определением линейных размеров или числа жизнеспособных клеток (метод окрашивания) при помощи микроскопа.

Исходный смысл слова «апоптоз» весьма поэтичен, по-гречески он означает опадание листьев.
Круг обстоятельств, когда в клетке включается программа апоптоза, весьма широк, их можно представить двумя группами:
- «неудовлетворительное» состояние самой клетки, что вызывает апоптоз изнутри;
- «негативная» сигнализация снаружи, передающаяся через специальные рецепторы клетки («апоптоз по команде»).
О «неудовлетворительном» состоянии самой клетки может свидетельствовать серьезное повреждение хромосом и внутриклеточных мембран. В этом смысле апоптоз выполняет функцию уничтожения дефектных клеток. Важнейший инструмент апоптоза – цитоплазматические протеазы, ядерные эндонуклеазы, последние разрушают ДНК не до нуклеатитов, а лишь до более или менее крупных фрагментов. К прочим «орудиям» апоптоза относится совокупность сильных окислителей – избыточное накопление не только оксида азота, но и других реакционноактивных веществ – супероксидного и гидроксидного радикалов, пероксинитрита, нитритов, нитратов и т.д. Известно, что в нормальной клетке существуют механизмы защиты от радикалов и окислителей. Это ферменты антиоксидантной системы: супероксиддисмутаза (превращает супероксид в перекись водорода), каталаза и пероксидаза, элиминирующие из среды пероксид водорода.
Повреждения клеток могут быть вызваны изменением температуры, нарушением питания. Если же повреждения клетки чрезмерны, процесс ее гибели становится неуправляемым – это уже некроз.
Таким образом, в зависимости от интенсивности и характера повреждающих воздействий гибель клетки может пойти либо по апоптическому, либо по некротическому пути.
Основная ферментация
Под ферментацией понимают всю совокупность последовательных операций от внесения в заранее приготовленную и нагретую до требуемой температуры среду посевного материала и до завершения процесса роста клеток или биосинтеза целевого продукта. По окончании ферментации образуется сложная смесь, состоящая из клеток продуцента, раствора непотребленных питательных компонентов и накопившихся  в среде продуктов биосинтеза. Такую смесь называют культуральной жидкостью.
Технологические особенности процессов  ферментации
По технологическому оформлению различают следующие микробиологические процессы: аэробное  и анаэробное культивирование; твердофазное, поверхностное и глубинное культивирование; периодическое и непрерывное культивирование.
Аэробное культивирование — аэрация среды — непременное условие в тех микробиологических процессах, в которых используются аэробные микроорганизмы-продуценты.
Потребность аэробных микроорганизмов в молекулярном кислороде зависит от окисляемого источника углерода и от физиологических свойств и активности роста микроорганизмов. Для биосинтеза 1 кг дрожжевой биомассы необходимо, например, 0,74–2,6 кг молекулярного кислорода. При интенсивном потреблении субстрата независимо от источника углерода продуцент ассимилирует 0,83–4,0 мг кислорода/1 л среды/мин.
Растворимость кислорода в среде сравнительно низка и зависит от температуры, давления и от концентрации растворенных, эмульгированных и диспергированных компонентов. При давлении 0,1 МПа и температуре 30 °С в 1 л дистиллированной воды максимальное количество растворенного кислорода составляет 7,5 мг. В реальной питательной среде максимальная растворимость кислорода колеблется  в интервале 2–5 мг/л. Запасы кислорода в среде обеспечивают жизнедеятельность аэробного продуцента  в течение 0,5–2 мин.
При глубинном культивировании запасы кислорода в питательной среде возобновляются при подаче аэрирующего воздуха. Скорость абсорбции кислорода увеличивается с ростом интенсивности перемешивания среды.
Во время роста биомассы микроорганизмы обычно потребляют больше кислорода, чем во время сверхсинтеза целевого метаболита. Принято говорить о критической концентрации кислорода, при которой наблюдается лимитация дыхания клеток. Для большинства аэробных микроорганизмов, растущих в сахаросодержащих субстратах, критическая концентрация кислорода 0,05–0,10 мг/л, что соответствует 3–8 % от полного насыщения среды кислородом. Лимитация роста  и физиологической деятельности клеток наблюдается при более высоких концентрациях кислорода: на средах с глюкозой рост дрожжей лимитируется при рО2 на уровне 20–25 % от полного насыщения.
Оптимальной для роста биомассы считается концентрация кислорода 50–60 % от полного насыщения, для биосинтеза целевых метаболитов — 10–20 %.