Влияние кверцетина на некоторые компоненты окислительного стресса после длительной физической нагрузки

Биохимические основы оксидативного стресса, влияние физической нагрузки и кверцетина на развитие стресса и на активность антиоксидантных ферментов.
Защищено 02.06.2013 на "отлично". ...

С химической точки зрения оксидативный стресс представляет собой значительное увеличение клеточного редокс¬¬–потенциала или существенное снижение восстановительной способности клеточных редокс–пар, таких как окисленный/восстановленный глутатион

Термин «oxidative stress» впервые был использован в работе N.V.Paniker (1970). За прошедшие годы интерес к данному вопросу значительно возрос. актуальность данной темы связана с изучением действия фармакологических средств, способных помочь организму противостоять окислительному стрессу.

Токсичная перекись водорода H2O2 расщепляется на молекулярный кислород и воду (H2O2=H2O+1/2 O2) (Северин, 2003). Глутатионпероксидаза - важнейший фермент, обеспечивающий инактивацию активных форм кислорода, так как он разрушает и пероксид водорода и гидропероксиды липидов (КФ 1.11.1.9). Он катализирует восстановление пероксидов с помощью трипептида глутатиона (γ-глутамилцистеинилглицин). Сульфгидрильная группа глутатиона (GSH) служит донором электронов и при окислении образует дисульфидную форму глутатиона, в которой 2 молекулы глутатиона связаны через дисульфидную группу. Н2О2 + 2 GSH → 2 Н2О + G-S-S-G. Окисленный глутатион восстанавливается глутатионредуктазой: GS-SG + NADPH + Н+ → 2 GSH + NADP+. Глутатионпероксидаза, восстанавливающая гидропероксиды липидов в составе мембран, использует микроэлемент селен в качестве кофермента. При нехватке этого микроэлемента в организме активность антиоксидантной защиты снижается (Северин, 2003). 1.5.2. Продукты перекисного окисления липидов (ПОЛ) и продукты окислительного стрессаВосстановленный глутатион (GSH) — низкомолекулярный тиол, преобладающий (90–95%) во многих растительных, микробных и во всех животных клетках, в которых его молярная концентрация (1–10 мМ) выше, чем концентрация большинства органических веществ (Meister, 1973). GSH является трипептидом (L-гамма-глутамил-L-цистеинилглицин). Функции глутатиона многообразны: восстановление и изомеризация дисульфидных связей, влияние на активность ферментов и других белков, поддержание мембранных функций, коферментные функции, участие в обмене эйкозаноидов, резервирование цистеина, влияние на биосинтез нуклеиновых кислот и белка, пролиферацию и др. (Кулинский, 1990).К первичным продуктам ПОЛ относятся циклические эндоперекиси и алифатические моно- и гидроперекиси, именуемые липопероксиды и диеновые конъюгаты (Курашвили, 2003). Диеновые конъюгаты (ДК) являются первичными продуктами ПОЛ. При свободнорадикальном окислении арахидоновой кислоты происходит отрыв водорода в б-положении по отношению к двойной связи, что приводит к перемещению этой двойной связи с образованием ДК (Курашвили, 2003). Первичные продукты ПОЛ, диеновые конъюгаты, относятся к токсическим метаболитам, оказывающие повреждающее действие на липопротеиды, белки, ферменты и нуклеиновые кислоты (Тарасов, 2002). ТБК-реактанты (МДА) - вторичные продукты ПОЛ. Как известно, малоновый диальдегид (МДА) образуется только из жирных кислот имеющих более трех двойных связей. МДА играет важную роль в синтезе прогестерона, простагландинов и других стероидов. Негативный эффект малонового диальдегида заключается в том, что он сшивает молекулы липидов и снижает текучесть мембраны. И как следствие, мембрана теряет свою прочность. Нарушаются процессы в которых участвует мембрана: фагоцитоз, пиноцитоз, клеточная миграция и др. (Тарасов, 2002). Накопление в организме продуктов ПОЛ (диеновых коньюгатов, ТБК-реактантов, шиффовых оснований) (Meister , 1973) и развитие эндотоксикоза приводит к стимуляции монооксигеназной системы, изменениям реакции липидного, гормонального, иммунного, микроэлементного, нейромедиаторного статусов, числа мест связывания и сродства рецепторов к лигандам, истощению антиоксидантной системы (Mori, 1999). Как правило, процессы перекисного окисления липидов (ПОЛ) оцениваются по скорости и количеству образования одного из конечных продуктов окисления - малонового диальдегида (МДА).Малоновый диальдегид (в-диальдегид): Н - С - СН2 - С - Н ¦ ¦ О О Активность малонового диальдегида поддерживается на определенном уровне при участии ферментов антиоксидантной защиты (АОЗ), что позволяет говорить о перекисном гомеостазе. Нормальная концентрация в крови - 2,5-6,0 мкМ/л. Рост концентрации свидетельствует об усилении ПОЛ и срыва антиоксидантной защиты (Банкова, 2011). Окисление α-атомов диеновых конъюгатов приводит к накоплению гидроперекисей, которые далее превращаются в малоновый и другие короткоцепочечные диальдегиды. В основе их определения лежит взаимодействие при высокой температуре и в кислой среде с тиобарбитуровой кислотой (ТБК). В результате реакции образуется окрашенный комплекс, содержащий одну молекулу МДА и две молекулы тиобарбитуровой кислоты. Максимум поглощения раствором, содержащим приходится на 532 нм (Гаврилов, 1987).1.6 Влияние нагрузки на активность антиоксидантных ферментов и продуктов окислительного стрессаИнтенсивные физические нагрузки, превышающие адаптационные возможности организма, нередко приводят к метаболическим нарушениям (Роженцов, 2006, Brancaccio et al., 2010).Механизмы развития их до конца не изучены, что лимитирует разработку новых методов диагностики и коррекции этого явления (Корнякова и др., 2009) В последнее время обращается большое внимание на процессы свободнорадикального окисления в организме, в первую очередь образованию активных форм кислорода и перекисному окислению липидов в норме и при патологии. Свободно-радикальное окисление происходит по принципу присоединения к молекуле кислорода от одного до четырех электронов. Эти химические реакции катализируются ферментами, относящимися к классу окисгеназ. В результате такой реакции образуются супероксидный анион-радикал (О2-), синглетный кислород, перекись водорода (Н2О2) и гидроксильный радикал (ОН-).Активные формы кислорода появляются практически сразу после начала химической реакции и дают старт для появления других радикалов – окисленных галогенов, окислов азота. При взаимодействии активных форм кислорода с ненасыщенными жирными кислотами продуктами реакции происходит инициация появления продуктов перекисного окисления липидов, что сопровождается появлением нестойких перекисных радикалов. Конечными продуктами являются кетоны, альдегиды и другие токсические соединения (Меньщикова и др., 2009). Существует большое количество факторов, способных вызвать изменение состояния свободно-радикального окисления. Основными факторами является появление внешних пусковых механизмов и снижение эффективности защитной системы, регулирующей уровень свободно-радикального окисления: антиоксидантная защита, изменение характеристик субстрата окисления, степень его связанности и возможности вступления в реакцию окисления.Оценить состояние свободно-радикального окисления можно по ряду признаков. Например, с помощью физических методов исследования: электронный парамагнитный резонанс, основанный на измерении магнитного момента образца. Определить содержание свободных радикалов в исследуемом материале можно по интенсивности свечения - хемилюминесценции, возникающей при взаимодействии радикалов. (Фархутдинов, 1995).Получить представление о свободно-радикальном окислении можно и по косвенным признакам: измеряя концентрацию начальных, промежуточных и конечных продуктов, участвующих в реакциях окисления, путем определения состояния механизмов, регулирующих скорость свободно-радикального окисления. Следует особо подчеркнуть, что нестабильность свободных радикалов, быстрый распад и включение в метаболизм продуктов свободно-радикального окисления затрудняют их обнаружение в биологическом материале. Поэтому довольно часто возникает вопрос о соответствии содержания радикалов в пробе, подготовленной к исследованию, тому количеству, которое имелось в естественных условиях (Фархутдинов, 1995).В последние годы проблемой изменения процессов свободно-радикального окисления при физических нагрузках занимаются многие ученые. С.И. Тевторадзе (1995) обнаружил увеличение оттока от работающей мышцы АФК, перекисей липидов, а также инициаторов свободно-радикального окисления. В печени, в сердце и мозге крыс при нагрузке повышался уровень продуктов окисления. Степень нарушения свободно-радикального окисления зависела от длительности нагрузки, возраста. При физической нагрузке антиоксидантная активность значительно понижается, особенно у нетренированного организма. Длительные тренировки вызывали оксидативный стресс, а регулярные, умеренные физические нагрузки вели к повышению антиоксидантной активности (Фархутдинов и др., 2006).Механизмы нарушения свободно-радикального окисления при физических нагрузках многогранны и находятся в стадии изучения. Одной из причин является возрастание потребления кислорода. Электрон-транспортная цепь митохондрий становится источником АФК. Избыточное образование АФК может быть связано и с выбросом нейтрофилов в кровь, их активацией на фоне снижения АОА (Leeuwenburgh, Heinecke,2001).При физической нагрузке происходит увеличение инициаторов СРО. Существенную роль в оксидативном стрессе играет изменение гормонального статуса и мобилизации липидов, особенно ненасыщенных жирных кислот, являющихся основным субстратом ПОЛ. Интенсивные и длительные физические нагрузки можно рассматривать как стресс реакцию (Барабой, 1992). Причиной активации СРО при стрессе считается выделения гормонов стресса — катехоламинов, а также глюкокортикоидов, вазопрессина и др. Глюкокортикоиды в физиологических условиях обладают АОА, но при стрессе в условиях активации СРО могут выступать в качестве прооксидантов (Фархутдинов, 2001).Особое внимание начинает уделяться антиоксидантам природного происхождения, источником которых служит растительное сырьё, морская флора и фауна, продукты пчеловодства и т.д.. Натуральные антиоксиданты отличаются по свойствам и механизму действия, обладают оптимальным соотношением основных компонентов, участвующих в физиологической системе регуляции СРО, легко утилизируются, включаются в обмен веществ, не подавляют собственные механизмы защиты, не вызывают привыкания. Поэтому в отличие от искусственно синтезированных препаратов, они могут использоваться постоянно в целях профилактики нарушения СРО. Использование натуральных антиоксидантов в оздоровительных и профилактических целях открывает новые подходы к решению важнейших социальных задач - сохранения здоровья и трудоспособности населения. Однако вопрос о целесообразности и четких показаний к их применению нельзя считать окончательно решенным.Хотя нарушение СРО при физических нагрузках не вызывает сомнений, тем не менее, эффективность использования антиоксидантов различными авторами расценивается неоднозначно. Введение в диету антиоксидантов при ФН, в частности селена, ретинола, аскорбиновой кислоты и витамина Е, повышало антиоксидантную активность плазмы при умеренных нагрузках, но не защищало от оксидативного поражения при высоких нагрузках (Фархутдинов, 2000). Витамины-антиоксиданты предотвращали агрегацию и деформацию эритроцитов при физических нагрузках. Назначение карнитина имело положительное значение для восстановления после нагрузок: снижались концентрации гипоксантина, ксантиноксидазы, креатининкиназы (Hille, 2005). Изофлавоноиды восстанавливали защитную систему антиоксидантов при умеренных нагрузках. Богатые флавоноидами соединения устраняли последствия оксидативного стресса. Карбогидраты влияли на содержание кортизола и катехоламинов, окисление которых ведет к образованию АФК. Использование витамина Е по данным одних авторов нормализовало уровень глутатиона в органах крыс (William J. Evans, 2000). Оксидативный стресс является основным фактором при физических нагрузках. Физическая активность увеличивает потребление кислорода и усиливает многочисленные метаболические процессы. В результате происходит образование и циркуляция высвободившихся в результате окисления продуктов распада - свободных радикалов. Свободные радикалы играют важную роль в процессах, ведущих к воспалению и повреждению мышц. Митохондрии переходят в режим напряженной работы для выработки достаточного количества энергии. Вместе с энергией увеличивается производство побочных продуктов, что приводит к перекисному окислению липидов свободными радикалами и активными формами кислорода (Pesic, et.all.,2009).Глава 2. Материалы и методы исследованияИсследование проводилось на базе лаборатории сравнительной биохимии ферментов Института эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова РАН (г. Санкт-Петербург). Объектом исследования были белые беспородные крысы. Все животные в ходе всего эксперимента содержались в помещении вивария при нормальных условиях. Экспериментальные животные разделялись на 3 группы (рис. 3). Первую группу составляли интактные животные, с которыми не проводилось никаких манипуляций. Животные двух других групп ежедневно в течение 7-ми дней подвергались физической нагрузке в виде часового бега на тредбане. Часть животных, подвергавшихся физической нагрузке, ежедневно принимала молоко, а другим также ежедневно перорально вводили препарат кверцетин в расчете 20 мг на килограмм живого веса. После окончания семидневной физической нагрузки животных декапитировали и забирали кровь для анализа. Эритроциты из цельной крови отмывали и путем центрифугирования получали плазму. 329565-558165Белые крысы00Белые крысы4777740-18669000481965-186690002691765-18669000-34671070485Экспериментальная группа(интактна)00Экспериментальная группа(интактна)181546560960Контрольная группа(молоко ежедневно в течение 7 дней)00Контрольная группа(молоко ежедневно в течение 7 дней)399669060960Контрольная группа(кверцетин ежедневно в дозе 20 мг/кг в течение 7 дней)00Контрольная группа(кверцетин ежедневно в дозе 20 мг/кг в течение 7 дней)489204024574500269176524574500567690245745002110740300990Ежедневный часовой бег на тредбане в течение 7 дней00Ежедневный часовой бег на тредбане в течение 7 дней375856520193000-299085142875Забор крови00Забор крови260096017907000-299085120015Отмывание эритроцитов и выделение плазмы00Отмывание эритроцитов и выделение плазмы260096011811000-299085154305Исследование активности антиоксидантных ферментов: каталазы, супероксиддисмутазы, глутатионредуктазы, глутатионпероксидазы и концентрации продуктов окисления: малонового диальдегида и востановленного глутатиона00Исследование активности антиоксидантных ферментов: каталазы, супероксиддисмутазы, глутатионредуктазы, глутатионпероксидазы и концентрации продуктов окисления: малонового диальдегида и востановленного глутатионаРис.3. Блок-схема исследованияСостояние окислительно-восстановительной системы крови оценивали путем измерения следующих показателей (рис. 3):а) продуктов окислительного стресса: концентрацию восстановленного глутатиона в эритроцитах и концентрацию малонового диальдегида в плазме крови; б) активность антиоксидантных ферментов в эритроцитах: супероксиддисмутазы, каталазы, глутатионпероксидазы и глутатионредуктазы.Для измерения этих показателей использовали следующие методики:Определение концентрации восстановленного глутатиона в эритроцитах. Принцип метода: Концентрацию восстановленного глутатиона в гемолизатах определяем с использованием 5, 5'-дитио-бис (2-нитробензойной) кислоты (ДТНБ). В модификации метода осаждение белка в гомогенатах производили раствором сульфосалициловой кислоты. Принцип метода основан на образовании при взаимодействии ДТНБ с кислоторастворимыми тиоловыми группами окрашенного продукта – 5-тио, 2-нитробензойной кислоты (ТНБ), имеющего максимум поглощения при длине волны 412 нм.Ход определения: Готовим гемолизат из эритроцитов (1:9) в трис-НСl буфере (5 ммоль, рН=7.6). К 0.6 мл гемолизата добавляли 0.2 мл 20 %-ного раствора сульфосалициловой кислоты. Затем центрифугировали в течение 10 минут при 3000 об/мин при +2ºС. 0.2 мл супернатанта переносили в пробирки, содержащие 2.55 мл 0.1 М трис-НСl буфера с 0.01 % ЭДТА (рН=8.5). К полученной смеси добавляли 25 мкл раствора 10 мМ раствор ДТНБ (6.13 мг ДТНБ растворенной в 1 мл абсолютного метанола). После развития окраски фотометрировали на СФ-26 против H2O при 412 нм в кювете с длиной оптического пути 10 мм. Расчет проводили на калибровочной кривой. Для чего из коммерческого препарата восстановленного глутатиона готовили растворы восстановленного глутатиона с концентрациями от 0.02 до 2.00 ммоль/л, из них отбирали пробы для определения содержания восстановленного глутатиона по описанной методике. Рассчитывали концентрацию восстановленного глутатиона и выражали в мкмоль/г гемоглобина (Ellman, 1959).Определение ТБК-зависимых продуктов в плазме.Принцип метода: окисление α-атомов диеновых конъюгатов приводит к накоплению гидроперекисей, которые далее превращаются в малоновый и другие короткоцепочечные диальдегиды. В основе их определения лежит взаимодействие при высокой температуре и в кислой среде с тиобарбитуровой кислотой (ТБК). В результате реакции образуется окрашенный комплекс. Максимум поглощения раствором, содержащим комплекс, приходится на 532 нм.Ход определения: к 0.5 мл плазмы добавить 1 мл 8 % раствора ТХУ. После 5 минут выдержки центрифугировать в течение 25 минут со скоростью 3000 об/мин. Отобрать 1 мл супернатанта в высокую пробирку. Добавить 0.5 мл раствора ТБК (80 мг ТБК растворить при нагревании в смеси 5 мл Н2О и 5 мл ледяной уксусной кислоты в день определения). Кипятить 20 минут на водяной бане. После охлаждения фотометрировать против контроля (физиологический раствор вместо исследуемого субстрата). Экстинкцию раствора смотрят в кювете с длиной оптического пути 5 мм при длине волны 532 нм. Результаты выражают в мкмоль/л (Гаврилов и др., 1987).Определение активности суперокиддисмутазы в эритроцитах.Сущность метода заключается в следующем: СОД способна тормозить реакцию окисления кверцетина, протекающую в аэробных условиях при рН=10 в присутствии N,N,N1,N1-тетраметилэтилендиамина (ТМЕД). В результате этой реакции происходит образование супероксидных анион-радикалов, которые в присутствии СОД подвергаются дисмутации.Ход определения: Гемолизат эритроцитов готовят добавлением к отмытым эритроцитам трис-HCl буфера (5 мМ, рН=7.4) в соотношении 1:10, инкубация в холодильнике при +4ºС в течение 15-20 минут. Проводят обработку для осаждения белков, обладающих СОД-подобной активностью. Для этого к 1 мл неразведенной плазмы добавляют 0.3 мл спирта, 0.15 мл хлороформа, 300 мг сухого KH2PO4. Перемешивают стеклянной палочкой на льду 15 минут. Центрифугируют при 6000 об/мин в течение 20 минут. Для анализа используют надосадочную жидкость (исследуется в тот же день). Измерение ведут спектрофотометрически в кюветах с длиной оптического пути 10 мм. В первую кювету (контрольная проба) вносят 0.5 мл фосфатного буфера (0.1 М, рН=7.8; на основе натрия фосфорнокислого двузамещенного Na2HPO4 и 0.1 М НCl), 1.9 мл дистиллированной воды, 0.5 мл реагента 1 и 0.1 реагента 2. Перемешивают, включают секундомер и измеряют начальную экстинкцию при длине волны 406 нм. Через 20 минут измеряют падение оптической плотности раствора. Вторая кювета (исследуемая проба) содержит те же компоненты, только вместо 0.1 дистиллированной воды берут 0.1 мл супернатанта биологической пробы. Измерение экстинкции проводят так же, как для контрольной пробы. Реагент 1 – готовится ex temporo (0.28 мл ТМЕД добавляют к 40 мл 0.5 мМ раствора ЭДТА).Реагент 2 – готовится ex temporo (1.5 мг кверцетина растворяют в 10 мл диметилсульфоксида) (Костюк и др., 1990).Определение активности каталазы в эритроцитах.Принцип метода основан на способности каталазы расщеплять перекись водорода. Об активности фермента судят по убыли перекиси водорода в инкубационной среде. Ход определения: Отмытые эритроциты гемолизируют 0.05 М буфером трис-HCl (рН=7.4) в соотношении 1:10. 0.02 мл гемолизированных эритроцитов смешивают с 4 мл дистиллированной воды, добавляют одну каплю 96 % этилового спирта и оставляют на 4-12 ч. Инкубационная смесь содержит 0.1 мл 0.05 М буфера трис-HCl, 0.1 мл гемолизированных эритроцитов (разведение 1:2000) и 1.8 мл 10 мМ раствора Н2О2 (опыт). Снижение оптической плотности в результате расщепления перекиси водорода в опытной пробе измеряют против контроля каждые 30 секунд в течение 3 минут при комнатной температуре при длине волны 230 нм. Скорость реакции линейна первые 3-4 минуты. Об активности каталазы судят по убыли перекиси водорода за 1 минуту, выражают в международных единицах – моль Н2О2 × 10-4 и относят к 1 мл эритроцитарной взвеси или 1 г гемоглобина. Измеряем падение оптической плотности при длине волны света 230 нм.