Молекулярно импринтированные полимеры на молекулы белковой природы

Введение. Молекулярный импринтинг. Способы получения молекулярно импринтированных полимеров. Молекулярно импринтированные полимеры на белки. Некоторые примеры применения МИПов.

Оценка отлично.
...

Получение полимеров, содержащих отпечатки высокомолекулярных биомолекул, с последующим их использованием для аналитического применения в настоящее время является бурно развивающимся направлением научных исследований.
Основные преимущества молекулярно импринтированных полимеров:
 стабильность;
 невысокая стоимость;
 возможность получения специфического сорбента практически для любой молекулы.
____________________________
Синтез полимеров, способных к распознаванию молекул белковой природы, относится к импринтингу биологических объектов, который в свою очередь имеет большое значение, как для исследовательских целей, так и медицинской диагностики и терапии. Однако при попытке приготовить молекулярно импринтированный полимер на белок возникает ряд трудностей, а именно низкая растворимость истабильность белка в нефизиологических условиях, что требует проведения синтеза в водных средах или в средах, обеспечивающих сохранность молекулы-шаблона. А также дополнительные требования к структуре формируемого полимера накладывают размер и пространственная организация макромолекулярного шаблона. Поэтому перенос стандартных подходов как ковалентного, так и нековалентного импринтинга для маленьких молекул на биологические макромолекулы имеет некоторые ограничения. Например, наиболее распространенный способ синтеза МИПов на основе метакрилата, позволяющий, меняя функциональный реагент, получать МИПы на различные молекулы, совсем не подходит для импринтинга биологических объектов, так как условия полимеризации слишком жесткие, а структура формируемого полимера не обеспечивает доступности сайтов связывания МИПа для взаимодействия с макромолекулярным шаблоном.
________________________________________-
Одним из важных примеров использования МИПов является селективное обнаружение амилоидных пептидов в крови человека [95]. Накопление ненормально свёрнутых белков — бета-амилоида и тау-белка в тканях мозга приводит к развитию болезни Альцгеймера, поэтому необходимо иметь возможность вовремя детектировать наличие данных соединений. МИПы на некоторые амилоидные пептиды получали в формате обычной полимеризации в массе. В качестве молекул-шаблонов использовали ацетилированные гексапептиды, функциональным мономером выступал 2-аминоэтилметакрилат, а сшивающим реагентом - дивинилбензол. Шаблон удаляли с помощью промывки метанолом, затем измельчали и просеивали до конечного размера. Перед применением переосаждали в смеси метанол/вода (80/20) для удаления мелких частиц.

Создание систем для распознавания и связывания различных молекул – важная задача современной науки. Часто исследователи используют природные системы распознавания для создания инструментариев, однако природные рецепторы трудно получить в большом количестве, процесс получения трудоемкий и дорогостоящий, а сами рецепторы не устойчивы в нефизиологических условиях. Таким образом, возникает задача создания искусственных систем распознавания, которые будут лишены этих недостатков.
Одним из вариантов получения таких искусственных рецепторов является молекулярный импринтинг. Молекулярный импринтинг – технология получения полимеров с молекулярными отпечатками (или иначе, молекулярно импринтированных полимеров, МИПов), способных к специфическому связыванию молекул-шаблонов, в присутствии которых они получены.

В качестве растворителя используют моноспирт (например, 2,2,2-трифторэтанол) общей формулы R-CHal2-CHX-OH, где Hal - атом галогена, a R и/или Х - атом водорода, атом галогена, гидроксильная группа, цианогруппа, линейные алкильные заместители, в том числе прерывающиеся гетероатомами, например кислородом, серой, азотом. Также в качестве растворителей капрона можно использовать муравьиную [72, 73] или уксусную кислоту [74], соляную кислоту [75]. Капрон является популярным материалом для создания полимеров с молекулярными отпечатками, поскольку является нетоксичным и легкодоступным материалом, его использованию посвящено большое число патентов [76, 77, 78, 79].Молекулярно импринтированные полимеры на белкиСинтез полимеров, способных к распознаванию молекул белковой природы, относится к импринтингу биологических объектов, который в свою очередь имеет большое значение, как для исследовательских целей, так и медицинской диагностики и терапии. Однако при попытке приготовить молекулярно импринтированный полимер на белок возникает ряд трудностей, а именно низкая растворимость и стабильность белка в нефизиологических условиях, что требует проведения синтеза в водных средах или в средах, обеспечивающих сохранность молекулы-шаблона. А также дополнительные требования к структуре формируемого полимера накладывают размер и пространственная организация макромолекулярного шаблона. Поэтому перенос стандартных подходов как ковалентного, так и нековалентного импринтинга для маленьких молекул на биологические макромолекулы имеет некоторые ограничения. Например, наиболее распространенный способ синтеза МИПов на основе метакрилата, позволяющий, меняя функциональный реагент, получать МИПы на различные молекулы, совсем не подходит для импринтинга биологических объектов, так как условия полимеризации слишком жесткие, а структура формируемого полимера не обеспечивает доступности сайтов связывания МИПа для взаимодействия с макромолекулярным шаблоном. Существует несколько подходов к синтезу МИПов на белки, которые удовлетворяют строгим требованиям импринтинга биологических объектов. Одним из таких подходов является трехмерный импринтинг белковых молекул. При проведении полимеризации в массе (в растворе) образуется объемный полимерный каркас, заключающий в своей структуре молекулы шаблона – такой процесс называют трехмерным молекулярным импринтингом. Ключевым моментом при разработке трехмерного импринтинга являются ограничения, накладываемые размером и формой крупного биологического шаблона на свободное перемещение его внутри полимерного матрикса. Возможность свободного удаления шаблона из полимера и связывание распознаваемой биомолекулы со специфическим сайтом является одним из главных условий успешной реализации молекулярного распознавания с помощью МИПов. Таким образом, аффинность МИПа во многом обусловлена доступностью сайтов связывания, а, следовательно, структурой полимера и размером пор. В качестве основы для белкового трехмерного импринтинга используют различные полимерные матрицы.Молекулярно импринтированные полимеры на основе гидрогелейНаиболее распространенным типом функциональных мономеров для молекулярного импринтинга является акриловая кислота и ее производные, импринтинг белков не стал исключением. В достаточно большом количестве патентов при синтезе полимера в качестве мономера использовали акриловую (метакриловую) кислоту (и аналоги) [например, 80, 81, 82]. Основным ограничением использования данных материалов является подбор растворителя, который подходит для всех компонентов полимеризационной смеси и обеспечивает сохранность пространственной структуры белка.Авторы [83] предложили получать отпечаток цитохрома С с использованием акриламида (AA) и этиленгликоль диметилакрилата (EDGMA) в качестве сшивающего реагента, причем в качестве молекулы шаблона использовали первичную последовательность C – конца полипептидной цепи (последовательность последних семи аминокислот цитохрома С из сердца лошади). Реакцию полимеризации проводили в ацетонитриле. Полученный полимер измельчили и промыли 10% уксусной кислотой в метаноле для удаления шаблона. Было показано, что полученный полимер селективно связывает цитохром С (полноразмерную цепь) из смеси различных белков, кроме того связывание в значительной степени зависит от структуры используемого шаблона.В [84] также описано получение молекулярно импринтированного полимера на цитохром С с использованием акриламида в качестве функционального мономера, но в качестве сшивающего реагента использовался N, N'-метилен-бис-акриламид. Реакцию полимеризации проводили в водном растворе персульфата аммония. Полученный гель и гель-контроль (полученный в отсутствие цитохрома С) упаковывали в пипетки Пастера (колонки) для проведения дальнейшего анализа. Для удаления шаблона гель промывали 10% уксусной кислотой, содержащей 10% (масса / объем) додецилсульфата натрия. На колонки наносили смесь белков (цитохром С, миоглобин лошади и рибонуклеаза). Для элюирования использовали 0,01 М раствором фосфата натрия (рН 6,2). Хроматографический анализ неадсорбированных белков показал, что в случае контрольного геля ни один из белков не адсорбируется на колонке, а в случае геля, приготовленного с добавлением цитохрома С, на колонке избирательно адсорбируется цитохром С.Авторы этого же патента показали, что молекулярно импринтированные полимеры, полученные с использованием одного молекулярного шаблона, способны связывать близкий к нему по структуре другой молекулярный шаблон. Так гель, полученный в смеси, описанной выше, с использованием гемоглобина в качестве шаблона вместо цитохрома С проявляет способность связывать миоглобин. Таким образом, в нескольких патентах описано получение МИПов на белки на основе акриламидных гелей. Однако эффективность МИПов на основе гидрогелей в значительной степени зависит от степени сшивки полимера (обеспечение подвижности белка в полимерной сетке), эффективности удаления шаблона из полимера, устойчивости полимеров и др. Такие гель-полимеры имеют ряд недостатков, например, потеря стерического соответствия молекуле-шаблону и неустойчивость по отношению к изменениям среды, а также существенные ограничения при выборе функциональных мономеров, приводящие к необходимости изучения других материалов.Импринтинг с использованием композитных материаловДля улучшения свойств МИПов на основе гидрогелей можно использовать композитные материалы. Наиболее подходящими по химическим и физико-механическим свойствам являются композитные материалы на основе твердотельных микрочастиц. Модифицируя поверхность частиц, удается добиться повышения стабильности получаемого полимера и управления процессами формирования полимерного каркаса. К преимуществам золь-гель импринтинга можно отнести полимеризацию в мягких условиях в водных растворах (как для гидрогелей) и бóльшую, относительно гидрогелей, прочность полимера, обусловленную наличием микрочастиц.С использованием композитного материала на основе золя (этилортосиликат, аминопропилтриэтоксисилан) и акрилового гелевого полимера в патенте [85] был предложен способ селективного распознавания белковых молекул на примере урокиназы человека и бычьего сывороточного альбумина (БСА). Удаление белкового шаблона осуществляли методом ферментативного расщепления белка. Полученные полимеры были протестированы на способность к распознаванию соответствующего белка. Было показано, что эффективность связывания белка с соответствующим МИПом составила примерно 30%, а с контрольным полимером (НИПом) – около 2%.Хотя импринтинг белковых молекул с использованием композитных материалов применяется, однако его использование ограничено из-за плотной структуры образуемого полимера. Несмотря на то, что он имеет ряд преимуществ перед стандартными методами импринтинга, получаемые на основе данного способа молекулярно импринтированные полимеры далеко не всегда обладают необходимой эффективностью и специфичностью по отношению к молекуле-шаблону. Необходимо введение дополнительных факторов, обеспечивающих повышение селективности связывания молекулы-шаблона при распознавании МИПом.Использование координирующих катионов металлов в процессе импринтингаИспользование ионов металлов в процессе синтеза МИПа применяется для того, чтобы повысить его эффективность. За счет координирующих свойств металлов можно улучшить распознающие свойства МИПа, поскольку это обеспечивает максимальное взаимодействие с шаблоном. Кеннет Дж. (Kenneth J. Shea) и Брэдли Р. (Bradley R. Hart) предложили способ получения полимеров с молекулярными отпечатками пептидов или аминокислотных последовательностей, содержащих N-концевой остаток гистидина, с использованием координирующих свойств Ni(II) в стандартном варианте трехмерного импринтинга. Предполимеризационный комплекс (комплекс между молекулой-шаблоном, функциональным мономером и катионом металла) в данном случае имел вид:2559054381500 где Ni в виде комплекса с замещенной нитрилотриуксусной кислотой ([Ni (НТК)]), P - молекула-шаблон (пептид или аминокислотная последовательность), X = NH, O или S, A = H или алкил.Данный комплекс получали путем смешения эквимолярных количеств водных растворов НТК (как лиганда), NiSO4.6H2O или Ni (NO3) 2.6H2O и целевой молекулы-шаблона (дипептида His-Ala). Полимеризацию проводили в водном растворе с добавлением акриламида и этиленбисакриламида в качестве сшивающего реагента. Полученные полимеры, измельчали и промывали водой (рН 3-4), чтобы удалить шаблон. Причем строение, эластичность и хрупкость полимеров изменялась в зависимости от степени сшивки. При низкой (30%) степени сшивки, полимеры были очень эластичными при намокании. После высыхания полимер становился чрезвычайно жестким, и его было трудно измельчить. При более высоких степенях сшивки, полимеры становились менее эластичными и были более хрупкими в сухом состоянии. Затем полимер промывали раствором 0,02 М раствором Ni(II), поскольку он теряется при кислой промывке. Эффективность связывания шаблона с МИПом выражали как отношение моль связавшегося пептида (определяли с помощью ВЭЖХ) на моль никеля (определяли на основе элементного анализа), что позволило сравнивать полимеры с различным содержанием никеля. Для оценки селективности полученных МИПов использовали молекулу сравнения (пептид His-Phe), а количественную характеристику выражали как отношение эффективностей связывания полимера с His-Ala и His-Phe. При уменьшении степени сшивки от 80 до 30% коээфициент селективности S менялся от 3,3 до 1,0 [86].Объединить два вышеизложенных метода получения молекулярно импринтированных полимеров удалось авторам патента [87]. Полимер, содержащий отпечаток бычьего сывороточного альбумина (БСА), получали с использованием хитозановых частиц и ионов Cu(II). Предполимеризационный комплекс получали путем добавления сульфата меди и БСА к раствору хитозана в 2% уксусной кислоте. Сферические частицы осаждали добавлением 2М раствора щелочи. Далее проводили полимеризацию полученных частиц в присутствии эпихлоргидрина в качестве сшивающего реагента. Для удаления шаблона частицы промывали раствором додецилсульфата натрия. Содержание БСА при распознавании определяли методом Вестерн-Блот.Подход антигенной детерминантыДругим подходом к успешному импринтингу белковых макромолекул, позволяющим также избежать стерических и конформационных проблем, является «подход антигенной детерминанты» (эпитоп). По определению эпитоп или антигенная детерминанта – это группа аминокислотных остатков белкового антигена или фрагмент полисахаридной цепи, например, в составе гликопротеина, образующий на его поверхности участок, способный вступать в селективное взаимодействие с определенным участком соответствующего антитела. В случае молекулярного импринтинга этот подход пригоден для синтеза МИПа, когда в качестве шаблона используется короткий аминокислотный фрагмент большой белковой молекулы. В дальнейшем процесс распознавания происходит между синтезированным полимером и коротким фрагментом, использованным для создания отпечатка, в составе цельной белковой молекулы. Таким образом, молекула белка адсорбируется на синтезированный полимер через связывание отпечатанного эпитопа.Такой подход был применен [88] для получения отпечатка меллитина (26 а.к. пептид) в качестве модельного антигена для искусственного антитела. МИП наночастицы были синтезированы стандартным методом трехмерного импринтинга, где в качестве функциональных мономеров использовали различные комбинации акриламидных производных, а в качестве сшивающего реагента - N, N'-метилен-бис- акриламид. Удаление шаблона и непрореагировавших мономеров осуществляли диализом. Было показано, что эффективность связывания меллитина полученным МИПом гораздо выше, чем для белков плазмы крови (альбумин, фибриноген и γ-глобулин). Для оценки антитело-подобной функции полученных полимеров анализировали цитотоксичность меллитина в присутствии/в отсутствии МИП наночастиц как in vitro,так и in vivo. В результате in vitro антиген-антитело сродство достаточно высоко для МИП наночастиц, чтобы нейтрализовать токсичность меллитина. In vivo наблюдали выживаемость мышей в течение 24 ч после внутривенного введения дозы меллитина. Введение меллитина приводит к 100% смертности мышей в течение 1 ч. При введении вместе с меллитином МИП наночастиц наблюдалось уменьшение смертности до 50%.Поскольку такие «искусственные антитела» не являются биоразрушаемыми и химически более стабильны, чем белковые антитела, они должны оставаться дольше в ферментативной среде, например, кишечника, желудка или слизистой оболочки, а также жидкостей организма без расщепления протеазами. Таким образом, перспективно их применение в фармакологической промышленности. Двумерный импринтинг Ранее упомянутый метод двумерного импринтинга (импринтинга на поверхности) имеет существенные преимущества по сравнению с традиционной полимеризацией в массе (трехмерным импринтингом) при получении молекулярных отпечатков на белки, поскольку трехмерная полимерная решетка, окружающая участок связывания, затрудняет диссоциацию и вторичное связывание макромолекул. Молекулярно отпечатанные поверхности можно получать с помощью литографии [89, 90], а также на поверхности электродов МИПы могут быть синтезированы электрополимеризацией [91, 92], абсорбированы химически или физически при участии инициаторов полимеризации, а также иммобилизованы химически на непроводящих поверхностях[93]. При электрополимеризации (анодной, окислительной) используется проводящий полимер, электропроводность, уровень легирования и смачиваемость которого можно варьировать, однако непроводящие полимеры также могут использоваться при катодной или восстановительной электрополимеризации. Авторами патента [94] было предложено получение молекулярно импринтированных к ряду пептидов 2D пленок на поверхности золотых пластин путем электроосаждения из раствора, содержащего предполимеризационный комплекс. Удаление шаблона обеспечивалось обычной промывкой дистиллированной водой или подходящим растворителем. Некоторые примеры применения МИПовДиагностика Одним из важных примеров использования МИПов является селективное обнаружение амилоидных пептидов в крови человека [95]. Накопление ненормально свёрнутых белков — бета-амилоида и тау-белка в тканях мозга приводит к развитию болезни Альцгеймера, поэтому необходимо иметь возможность вовремя детектировать наличие данных соединений. МИПы на некоторые амилоидные пептиды получали в формате обычной полимеризации в массе. В качестве молекул-шаблонов использовали ацетилированные гексапептиды, функциональным мономером выступал 2-аминоэтилметакрилат, а сшивающим реагентом - дивинилбензол. Шаблон удаляли с помощью промывки метанолом, затем измельчали и просеивали до конечного размера. Перед применением переосаждали в смеси метанол/вода (80/20) для удаления мелких частиц.Промышленность В [96] описан способ получения молекулярно импринтированных полимеров, способных облегчать гидролиз субстратов, содержащих гидролитически лабильные связи (амидные или сложноэфирные), таких как пептиды и белки. В частности, такие полимеры способны имитировать ферментативный катализ гидролиза амидных связей. Например, процесс получения МИПа, имитирующего каталитическую активность трипсина включает несколько стадий:- подготовка молекулярного шаблона, включающего тетраэдрический химический фрагмент (например, PO(OR)3, AsO(OR)3 или SbO(OR)3), который ковалентно связан с участком, образующим карман, и гистидин-подобную часть (ГПЧ), которая ковалентно связана с серин-подобной частью (СПЧ). Участком, образующим карман, может быть любой подходящий молекулярный каркас, который по структуре похож на целевой амид, или сложный эфир, или часть субстрата, содержащего амидную связь;- полимеризация мономера, содержащего свободную кислотную группу, со сшивающим реагентом и молекулярным шаблоном в присутствии порообразователя, так что свободная кислотная группа способна образовывать водородную связь с ГПЧ;- удаление шаблона из полученного полимера.Полученные таким способом полимеры, обладающие молекулярной памятью, могут быть в частности использованы для обработки белков/пептидов, содержащихся в промышленных стоках отходов, для удаления загрубевшей и задубевшей кожи и т.д.В свою очередь немаловажное применение МИПы нашли в пищевой промышленности для обнаружения патогенных микроорганизмов в продуктах питания. Разработанный авторами патента [97] датчик представляет из себя тест-полоски на основе молекулярно импринтированных флуоресцентно меченых полимерных мембран. Принцип работы данного сенсора основан на флуоресцентной детекции - при связывании с патогенами флуоресценция МИПа тушится.ЗаключениеНа сегодняшний день технология молекулярного импринтинга является прогрессирующей, число публикаций и патентов растет с каждым годом. Интерес обусловлен простотой и дешевизной их получения. Кроме того молекулярно импринтированные полимеры находят применение не только в научных целях, а также в химической и фармацевтической промышленности, диагностике. МИПы являются отличными альтернативными сорбентами для изготовления лекарственных препаратов, поскольку позволяют не только выделять нужное соединение из смеси с другими соединениями, а также из рацемической смеси изомеров. Хорошей заменой природным ферментам могут стать МИПы, обладающие каталитическими свойствами. Однако, несмотря на то, что исследователи уже достигли несомненных успехов в разработке МИП-технологий, многие проблемы остаются до сих пор нерешенными. В связи с трудностями получения молекулярных отпечатков на крупные биомолекулы, в частности белки, разработка универсальных способов для их импринтинга оставляет широкое поле для исследований.