ИССЛЕДОВАНИЕ ФЛАВОНОИДОВ КОЛЮРИИ ГРАВИЛАТОВИДНОЙ Coluria geoides (Pall.) Lebeb.

Целью настоящей работы является разработка схемы препаративного выделения и разделения флавоноидов Колюрии гравилатовидной. Защита диплома - 2009, оценка - 5. Хакасский государственный университет имени Н.Ф. Катанова ...

ВВЕДЕНИЕ…………………………………………………………...…………..5
Глава 1. Литературный обзор………………………………………………….9
1.1. Общая характеристика и классификация флавоноидов………………....9
1.2. Физико – химические свойства флавоноидов как основа методов их выделения………………………………………………………………….15
1.3. Основные этапы биосинтеза флавоноидов………………………..…….20
1.4. Биологическая роль флавоноидов……………………………………….21
1.5. Применение флавоноидов………………………………………………..27
1.6. Распространение флавоноидов………………………………………..…27
Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ………………..29
и т.д.

Систематическое изучение строения природных флавоноидов многие годы проводили польские химики. Большую работу по изучению антоцианов провел Вильштеттер. Исследованиями катехинов занимались А. Л. Курсанов, М.Н.Запраметов, К. Фрейденберг и др. Интерес к флавоноидным соединениям особенно возрос в 40-е годы нашего столетия: флавоноиды привлекают внимание ученых разносторонней биологической активностью и чрезвычайно низкой токсичностью. После 1970 г. выделено свыше 1400 соединений, относящихся к флавоноидам. Флавоноидные соединения на протяжении последних 20 лет интенсивно изучались в лабораториях многих стран. В итоге количество описанных в литературе выделенных из растений флавоноидов с установленной структурой в настоящее время достигает около 4000.

Антиоксиданты очень важны для нормального обмена живой клетки. Известно, что в составе клеточных мембран входят легко окисляющиеся липиды. При переокислении липидов клеточных мембран образуются токсические продукты, нарушается обмен в летке, работа ее угнетается вплоть до гибели клетки.[39]Нормализация содержания экзогенных антиоксидантов ведет к исчезновению таких процессов, как митоз, злокачественное перерождение, атеросклероз.Антиокислительные свойства флавоноидов разных химических классов являются основой их взаимодействия с аскорбиновой кислотой.Флавоноиды предохраняют аскорбиновую кислоту от окисления не только в растворах, но и при введении ее в организм. Более того, флавоноиды в животном организме увеличивают накопление аскорбиновой кислоты в надпочечниках, печени и одновременно замедляют выведение ее из организма.Флавоноиды ( витамин Р ) в биологических жидкостях не замедляют, а скорее усиливают ферментативное, в частности пероксидазное, окисление аскорбиновой кислоты до дегидроаскорбиновой кислоты и таким образом предохраняют ее от дальнейшего окисления и выведения из организма. Дегидроаскорбиновая кислота растворяется в жирах лучше аскорбиновой и, проникая через мембраны, интенсивнее накапливается в органах. Реагируя внутриклеточно с имеющейся там аскорбиновой кислотой, дегидроформа образует радикал с монодегидроаскорбиновой кислотой, который специальной ферментативной системой быстро переводится в восстановленную форму.Таким образом, дегидроаскорбиновая кислота является транспортной формой аскорбиновой кислоты и что она непосредственно оказывает действия на ряд ферментативных систем организма.Процесс образования перекисей липидов в биологических мембранах осуществляется по цепному свободнорадикальному механизму. Особенность цепных реакций состоит в том, что свободные радикалы, реагируя с другими молекулами, не исчезают, а превращаются в другие свободные радикалы.Свободнорадикальное окисление начинается с реакции инициирования цепи. Инициаторами могут быть химические реакции, связанные с изменением валентности иона металл (Cu2+,\Fe2+). При окислении ионов железа молекулярным кислородом в растворе образуются как О, так и гидродиоксид-радикал НО2Fe2+ + О2 → Fe3+ + О2 (1)Fe2+ + О2 + Н+ → Fe3+ + НО2 (2)При взаимодействии его с молекулой жирной кислоты RH также образуются R и Н2О2:НО2+ RH → Н2О2 + R' (3)при этом образуется перекись водорода, а радикалы R подвергаются аутоокислению с образованием алкилдиоксил – радикала:R- + О2 → RO2 (4)Алкилдиоксил – радикал может вступать во взаимодействие с новой молекулой ненасыщенной жирной кислоты, при этом образуется следующая молекула радикала R и алкилгидропероксид:RО2 + RH→ R + ROOH (5)Эта реакция начинает новый этап свободнорадикального цепного процесса, который называется продолжением цепи. Следует отметить, что энергия активации реакций инициирования и продолжения цепи практически равна нулю и поэтому весь процесс имеет самоускоряющийся характер. Чередование двух последних реакций приводит к цепному окислению.Число радикалов (R* + RO2) определяет активность процесса в целом, при этом число гидроперекисей липидов может возрастать.Далее следуют реакции разветвления, когда гидроперекиси разлагаются, инициируя новые цени. Разветвление происходит в присутствии ионов Fe2 + , под действием ультрафиолетового, ионизирующего излучений, или значительно реже — спонтанно. ROOH + Fe2+→ RO" + Fe3+ + ОН'Не все радикалы RO2, и R продолжают цепь, часть их рекомбинируют друг с другом, дают неактивные продукты и приводят к обрыву цепи. Рекомбинация радикалов:R + R → RRRO2 + R → ROORRО2 + RО2 + Н+→ ROH + R=О + О2 + hv (хемилюминесценция).Помимо спонтанного обрыва цепей, прерывание цепей возможно при взаимодействии с Fe2+:RO2+ Fe2+ + Н+ → ROOH + Fe,3+R + Fe2+ + H+ → RH + Fe3+при взаимодействии с антиоксидантами (А):АН + R → А + RHАН +RО2 → А + ROOHА + RО2 → неактивные продуктыА + А → неактивные продуктыВ биологических системах антиоксидантами называются вещества, способные ингибировать процессы свободнорадикального окисления. Для живых клеток наибольшую опасность представляет цепное окисления ненасыщенных жирных кислот, или перекисное окисление липидов ( ПОЛ). В реакциях ПОЛ образуется большое количество липидных гидроперекисей, которые обладают высокой реакционной способностью и оказывают мощное повреждающее действие на клетку. Защита организма от этих и многих других заболеваний – основная задача антиоксидантной системы. Антиоксиданты предотвращают перекисное окисление липидов и не дают свободным радикалам накапливаться в организме.[5]Специалистами лаборатории компании Biersdorf удалось выделить из растений мощный антиоксидант - альфа-флавон, который эффективнее обычных витаминов Е и С. Альфа-флавон принадлежит к группе флавоноидов, известных своей способностью эффективно нейтрализовать свободные радикалы и защитить кожу от окислительного процесса. Альфа-флавон не только успешно нейтрализует свободные радикалы, но и стимулирует выработку антиоксидантов самим организмом, а также помогает коже защититься от вредного воздействия окружающей среды.[35]Применение флавоноидовДиапазон терапевтического применения растительного сырья, богатого флавоноидами, очень широк. Флавоноиды не токсичны для человека при любом способе введения. Многие флавоноиды обладают Р - витаминной активностью, уменьшают хрупкость кровеносных капилляров (рутин), усиливают действие аскорбиновой кислоты, оказывают седативное действие (боярышник, пустырник). Используются как противовоспалительное, противоязвенное (корень солодки) средство. Некоторые обладают кровоостанавливающими свойствами (водяной перец, почечуйная трава); применяются при геморрое (стальник пашенный, конский каштан); служат хорошими желчегонными средствами (бессмертник, пижма). В последние годы появились сообщения о противоопухолевом действии флавоноидов. Однако препаратов, содержащих чистые флавоноиды, пока имеется немного. Чаще эти соединения находятся в растениях в комплексе с другими БАВ и используются суммарно.[20]Распространение флавоноидовФлавоноиды широко распространены в растительном мире. Особенно богаты флавоноидами высшие растения, относящиеся к семействам розоцветных (различные виды боярышников, черноплодная рябина), бобовых (софора японская, стальник полевой, солодка), гречишных (различные виды горцев - перечный, почечуйный, птичий: гречиха), астровых (бессмертник песчаный, сушеница топяная, пижма), яснотковых (пустырник сердечный) и др. Более часто Флавоноиды встречаются в тропических и альпийских растениях. Обнаружены и у низших растений: зеленые водоросли (ряски), споровые (мхи, папоротники), хвощи (хвощ полевой), а также у некоторых насекомых (мраморно-белая бабочка).Флавоноиды широко представлены в овощах, фруктах, цветах, семенах, стеблях и корнях растений, которые служат источником поступления данных соединений для животных и человека. Находятся флавоноиды в различных органах, но чаще в надземных: цветках, листьях, плодах; значительно меньше их в стеблях и подземных органах (солодка, шлемник байкальский, стальник полевой). Наиболее богаты ими молодые цветки, незрелые плоды. Локализуются в клеточном соке в растворенном виде. Содержание флавоноидов в растениях различно: в среднем 0,5-5%, иногда достигает 20% (в цветках софоры японской). В растениях флавоноиды встречаются в виде гликозидов и в свободном виде. Под влиянием ферментов они расщепляются на сахара и агликоны. В качестве сахаров встречаются D-глюкоза, D-галактоза, D-ксилоза, LT-рамноза и LT-арабиноза, D-глюкуровая кислота.[2].Основными являются возраст и фаза развития растений. Наибольшее количество их накапливается у многих растений в фазе цветения, а в фазе плодоношения уменьшается. Факторы окружающей среды (свет, почва, влага, высота над уровнем моря и др.) оказывают также значительное влияние на накопление флавоноидов. В южных и высокогорных районах, под влиянием света и на почвах, богатых микроэлементами, увеличивается содержание флавоноидов.[8]Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ2.1. Материал исследованияМатериалом для исследования явилась наземная часть растения Колюрия гравилатовидная.Рисунок 2 – колюриягравилатовиднаяКолюрия гравилатовидная многолетнее растение с одревесневающим корневищем. Стебли одиночные или в числе нескольких, опушенные короткими волосками, слабо облиственные. Прикорневые листья короткочерешковые, прерывисто - перистые, самые верхние их доли трёхлопастные, туповато - зубчатые, крупные; книзу постепенно мельчающие, почти цельнокрайние. Цветки в числе 1 - 3 на верхушке стебля, ярко - жёлтые. Лепестки вдвое длиннее чашелистиков. Орешки ок. 2 мм дл., продолговато - яйцевидные, покрытые стекловидными сосочками Встречаются на открытых степях, нередко каменистых склонах.[9]2.2. Методы выделения и идентификации флавоноидовСреди используемых методов исследования можно выделить методы разделения и методы обнаружения флавоноидов, в рамках которых были выбраны специальные методики по разделению и обнаружению, количественного определения, (качественные реакции, хроматографический анализ, фотоколориметрия).В анализе веществ растительного происхождения наибольшее распространение получили хроматографические методы. Такие достоинства как универсальность, экспрессность и чувствительность делают хроматографию важнейшим аналитическим методом.Хроматография – это физико - химический метод разделения веществ, основанный на распределении компонентов между двумя фазами – неподвижной и подвижной.По технике выполнения выделяют колоночную хроматографию, когда разделение производят в специальных колонках, и плоскостную хроматографию, когда разделение производится на специальной бумаге (бумажная хроматография) или в тонком слое сорбента (тонкослойная хроматография).[28]2.2.1. Методика качественного определения флавоноидов в растительном сырьеОбщая реакция, специфическая для всех групп флавоноидов, отсутствует. Для каждой группы флавоноидов, существует своя реакция. Для качественного определения флавоноидов нами была выбрана реакция с хлоридом железа (III) и цианидиновая проба. Для осуществления реакции с хлоридом железа, к 0,5 мл водного извлечения добавляют 1-2 капли 3% раствора хлорида железа (II). При наличии флавоноидов раствор приобретает зеленую окраску.Цианидиновая проба (проба Chinoda). Для постановки реакции 1 г порошка сырья заливают 10 мл 95% этанола, нагревают на водяной бане до кипения и настаивают 3-4 ч. спиртовое извлечение фильтруют, упаривают до объема 2 мл, делят пополам и разливают в 2 пробирки; в каждую пробирку прибавляют по 3 капли концентрированной хлористоводородной кислоты. В 1-ю пробирку добавляют 0,03-0,05 г цинковой пыли и нагревают на водяной бане до кипения. Жидкость приобретает красно – оранжевое окрашивание, во 2-й пробирке окрашивание отсутствует.Для лучшего наблюдения за окрашиванием густые и непрозрачные экстракты необходимо разбавлять в 10–50 раз.[28]2.2.2. Общая методика определения количественного содержания суммы флавоноидов в жидких экстрактахВ мерную колбу вместимостью 25 мл, предварительно взвешенную, переносят с помощью пипетки аликвоту анализируемого экстракта, равную 1 мл, и вновь взвешивают. В колбу с помощью пипетки добавляют 4 мл 5% раствора хлорида алюминия. Для приготовления раствора сравнения во вторую колбу вместимостью 25 мл с помощью пипетки переносят аликвоту (1 мл) анализируемого экстракта, после чего объем обеих колб доводят до метки 60% спиртом и оставляют на 30 мин. В случае помутнения растворов их фильтруют через бумажные фильтры в чистые стаканы. Оптическую плотность измеряют в интервале 408–616 нм на длине волны максимума поглощения в кюветах с толщиной поглощающего слоя 1 см, в рабочую кювету помещают раствор с добавленным хлоридом алюминия, в кювету сравнения – раствор сравнения. Если максимум поглощения расположен в области 408–420 нм, в качестве стандарта используют ГСО рутина. Для построения калибровочного графика зависимости оптической плотности от количества рутина в растворе точную навеску ГСО рутина около 0,05 г количественно переносят в мерную колбу вместимостью 50 см3, прибавляют отмеренные 40 мл 60% водного спирта, нагревают до 50–60 °С до растворения рутина, затем охлаждают до комнатной температуры и доводят до метки 60% спиртом. Для приготовления комплекса с хлоридом алюминия в мерные колбы А и Б вместимостью 25 мл переносят по аликвоте раствора рутина и обрабатывают аналогично указанному выше, получая при этом раствор с комплексом и раствор сравнения. Используют аликвоты раствора рутина, см3: 0,2; 0,4; 0,6; 0,8; 1,0; 1,2. При этом количество рутина в 25 см3 спектрофотометрируемого раствора равно соответственно г × 103: 0,2; 0,4; 0,6; 0,8; 1,0; 1,2. Измеряют оптическую плотность при длине волны 415 нм в кювете с толщиной поглощающего слоя 1 см; в рабочую кювету помещают раствор А, в кювету сравнения — раствор Б. Калибровочный график зависимости оптической плотности (D) от количества рутина в спектрофотометрируемом растворе (с) имеет вид прямой линии, проходящей через начало координат. Массовую долю суммы Р – активных флавоноидов в исследуемых экстрактах в пересчете на рутин в мг/100 г (Х) вычисляют по формуле: (1)где с – количество рутина в анализируемой аликвоте экстракта, соответствующее измеренной оптической плотности по калибровочному графику, г/25 см3; Fp – фактор разбавления (если такое проводилось); 105 –коэффициент пересчета в мг/100 г; М – масса экстракта, г. Аналогично проводят определение при расположении максимума поглощения в области 421–435 нм. В качестве стандартного образца используют ГСО кверцетина.[6]2.2.3. Методика количественного определения суммы флавоноидовФотоколориметрический метод позволяет установить количественное содержание флавоноидов. Этот метод основан на цветных реакциях флавоноидов с солями металлов.Около 1,0 г (точная навеска) измельченного сырья помещают в колбу со шлифом вместимостью 150 мл, прибавляют 30 мл 70% спирта. Колбу присоединяют к обратному холодильнику и нагревают на кипящей водяной бане в течение 30 мин с момента закипания спирта в колбе. Извлечение фильтруют через бумажный фильтр в мерную колбу вместимостью 100 мл. К фильтрату прибавляют 30 мл 70% спирта, повторяют экстракцию. После охлаждения отфильтрованный экстракт доводят 70% спиртом до метки колбы и перемешивают. К 1 мл полученного извлечения добавляли 1 мл 2% спиртового раствора алюминия хлорида и 4 мл этанола. Через 20 минут измеряли оптическую плотность на фотоэлектроколориметре КФК-2 при длине волны 440 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм. Количество флавоноидов в 1 мл в мг находили по калибровочному графику и содержание суммы флавоноидов в пересчете на рутин и абсолютно сухое сырье (х) в процентах рассчитывали по формуле: (2)С— количество в флавоноидов пересчете на рутин в 1 мл исследуемого раствора, найденное по калибровочному графику, мг;m — масса сырья в граммах;W — потеря в массе при высушивании сырья, %.Построение калибровочного графика. Около 0,1 г (точная навеска) ГСО рутина помещают в мерную колбу вместимостью 25 мл, растворяют в 70% спирте и доводят объем раствора 70% спиртом до метки. Из исходного раствора готовят ряд разведений с концентрацией рутина от 0,2 до 0,8 мг в 1 мл. Далее поступают согласно методике, приведенной выше. По результатам измерения оптической плотности растворов строят калибровочный график, откладывая на оси абсцисс концентрацию, рутина в миллиграммах в 1мл, на оси ординат — оптическую плотность раствора.[18]2.2.4.Методика разделения суммы флавоноидов с помощью колоночной хроматографииЖидкостная колоночная хроматография (ЖКХ) - это метод разделения и анализа сложных смесей веществ, в котором подвижной фазой служит жидкость. В ЖК разделение чаще всего происходит при комнатной температуре.Жидкая подвижная фаза - активный элюент, молекулы которой могут сорбироваться на поверхности. При прохождении через колонку находящиеся в элюенте молекулы интересующего нас компонента должны вытеснить молекулы элюента с поверхностью слоя сорбента, что приводит к уменьшению энергии взаимодействия молекул вещества с поверхностью сорбента. Неподвижная фаза должна удерживать разделяемые вещества. Подвижная фаза, т.е. растворитель, должна обеспечить различную емкость колонки и эффективное разделение за приемлемое время.В зависимости от силы взаимодействия с поверхностью сорбента (за счет адсорбции или по какому-либо еще механизму) компоненты перемещаются вдоль колонки с разной скоростью. Одни компоненты остаются в верхнем слое сорбента, другие, с меньшей степенью взаимодействия с сорбентом, оказываются в нижней части колонки, некоторые покидают колонку вместе с подвижной фазой. Таким образом компоненты разделяются.В классическом варианте ЖХ в стеклянную колонку длинной 1-2 м, заполненную сорбентом (размер частиц ≥ 100 мкм), вводят анализируемую пробу и пропускают элюент. Скорость прохождения элюента под действием сил тяжести мала, а продолжительность анализа значительна. Разделения достигают, меняя элюирующую силу подвижной фазы- растворителя Реактивы и оборудование: кремневая кислота водная «ЧДА», стеклянная хроматографическая колонка (d = 1,5 см, L= 80см) воронка капельная, колбы на 50 мл, цилиндры мерные, бумага фильтровальная.Элюенты: гексан, хлороформ, этилацетат.На дно хроматографической колонки плотно вставляют ватный тампон толщиной 1 см, который препятствует прохождению адсорбента в приемник. Затем в колонку небольшими порциями вносят адсорбент, (кремневая кислота водная «ЧДА»), слегка уплотняя каждую порцию стеклянной палочкой. Длина столбика адсорбента в колонке составляет 40 см. Исследуемую сумму экстрактивных веществ смешивали с адсорбентом (кремневая кислота). Полученную смесь высушивали на стеклянной пластине и в последнюю очередь вносили в колонки. Затем через колонки пропускали ряд растворителей (по мере возрастания полярности), начиная с гексана. Разделение контролировали методом тонкослойной хроматографии в системе бутанол: уксусная кислота : вода в количественном соотношении (4:1:5). Фракции собирали по 25 мл. Сконцентрированные фракции исследовали методом тонкослойной хроматографии.[26]2.2.5. Качественный анализ флавоноидов методом тонкослойной и бумажной хроматографииПрименение хроматографических систем с целью качественной и количественной характеристики. Для флавоноидов характерно двумерное хроматографирование, это обусловлено различной растворимостью агликонов их гликозидов в органических растворителях. Вторые – мало растворимы в них, но хорошо растворимы в воде и смесях воды со спиртами, поэтому для хроматографии на бумаге для разделения флавоноидных соединений, применяются системы растворителей двух групп: водные растворы уксусной кислоты, смеси спиртов с водой (иногда с добавлением кислот).Методика разделения флавоноидов с помощью бумажной хроматографии:Извлечения флавоноидов проводили по общепринятой методике. Для разделения флавоноидов использовали восходящую одномерную бумажную хроматографию. Точную навеску (0,5) измельченного сырья, просеянного через сито 0,1 мм, заливают 30 мл 96% этанола на сутки. Затем настаивают в колбе с обратным воздушным холодильником на водяной бане 30 минут, фильтруют через бумажный фильтр в выпарительную чашку. Фильтр опускают обратно в колбу, приливают 20 мл 80 % этанола и настаивают на водяной бане еще 15 минут.Затем фильтруют в ту же выпарительную чашку, фильтрат упаривают досуха, затем смывают 3 мл 80 % этанола (точный объем). Точный объем экстракта (0,04 мл) наносят на хроматографическую бумагу. Проводят одномерное хроматографирование в системе: 15 % раствор уксусной кислоты; бутанол – уксусная кислота-вода (10:3:7:); бутанол – уксусная кислота-вода (4:1:5).На расстоянии 1,5-2 см от нижнего края пластинки, бумаги проводят линию старта. Сконцентрированную пробу исследуемого извлечения, полученного в результате экстракции, наносят при помощи капиллярной пипетки на линию старта таким образом, чтобы диаметр пятна не превышал 0,5 см.