Вход

методы флюоресцентной детекции экспрессии генов в культуре клеток

Рекомендуемая категория для самостоятельной подготовки:
Курсовая работа*
Код 236104
Дата создания 23 мая 2016
Страниц 25
Мы сможем обработать ваш заказ 12 декабря в 12:00 [мск]
Файлы будут доступны для скачивания только после обработки заказа.
820руб.
КУПИТЬ

Описание

Оригинальность по системе антиплагиат 55% Если возникнут доработки выполню бесплатно и в кротчайшие сроки ...

Содержание

Введение 2
1. Теоретические основы флюоресцентной микроскопии 3
1.1. Явление флюоресценции 3
1.2. Устройство флюоресцентного микроскопа 12
2. Методы создания флюоресцентных РНК-зондов 15
3. Протоколы окрашивания живых клеток при помощи флюоресцентных РНК-зондов 19
Заключение 20
Список литературы 21

Введение


Цель нашего исследования является изучить методы флюоресцентной детекции экспрессии генов в культуре клеток.
Задачи исследования:
1. Изучить литературу по теме исследования.
2. Изучить особенности явления флюоресценции.
3. Изучить особенности флуоресцентного микроскопа.
4. Изучить методы создания флюоресцентных РНК-зондов.
Курсовая работа состоит из введения, трех глав, заключения и списка литературы.

Фрагмент работы для ознакомления

В качестве детекторов обычно используются фотоумножители.Фотопоток флуоресценции, испускаемый во всех направлениях (при малых концентрациях, когда наблюдается равномерное свечение образца), описывается выражением:ФФ = Ф0(1 – Т)nи/nп = Ф0(1 – 10–eСL)nи/nп,где nи и nп – число излученных и число поглощенных квантов. При малых значениях концентрации данное выражение может быть преобразовано к виду [1]ФФ = Ф0ln(10)eСLnи/nп = KC,где К = Ф0ln(10)eLnи/nп – постоянный коэффициент.Таким образом, при малых концентрациях определяемого компонента в анализируемой пробе (наиболее часто встречающиеся случаи использования флуоресцентного анализа) поток флуоресценции пропорционален концентрации определяемого компонента в анализируемой пробе.Одним из преимуществ флуориметрии является более высокая чувствительность, которая может на четыре порядка превышать чувствительность фотометрических методов. Это происходит потому, что в фотометрических методах для определения неизвестной концентрации анализируемого вещества в образце измеряется разность в поглощении между раствором, содержащим нулевую концентрацию анализируемого вещества, и анализируемым образцом. В случае сильно разбавленных образцов небольшие отклонения в процессе измерения могут привести к большим относительным ошибкам в результатах. В случае флуориметрии осуществляется прямое измерение флуоресценции образца [6].Особым преимуществом флуориметрии является очень высокая специфичность определения. В случае фотометрического измерения, в рабочей полосе частот помимо поглощения анализируемого вещества может присутствовать поглощение и других веществ. При флуориметрии же лишь небольшое число веществ обладает способностью к флуоресценции. Таким образом, многие вещества, мешающие друг другу при одновременном присутствии в фотометрическом измерении, уже не могут помешать друг другу при измерении флуоресценции. Кроме того, вещества, имеющие сходные спектры возбуждения, могут иметь различные спектры испускания и наоборот.Совокупность этих свойств обеспечивает возможность флуориметрического определения пикограммовых количеств анализируемых веществ.Принципиальным недостатком флуориметрических методов является зависимость результатов измерений от температуры и рН в образце.Поляризация флюоресценции. При прохождении через кристаллическую решетку (поляризатор) волны света ориентируются в одной плоскости, такой свет называется поляризованным. В силу броуновского движения молекулы в растворе не только непрерывно перемешиваются, перемещаясь в пространстве, но и хаотически вращаются. Время, за которое молекулы успевают равномерно распределиться в пространстве, называется временем релаксации, соответственно говорят и о времени вращательной релаксации, как о том промежутке времени, который необходим для того, чтобы первоначально одинаково ориентированные молекулы оказались равномерно повернутыми в разные стороны. Для больших молекул этот промежуток времени длиннее, чем для маленьких. Если время вращательной релаксации велико по сравнению с временем между поглощением кванта света и его эмиссией (затухания флюоресценции), то молекула флюорофора не успевает повернуться и свет эмиссии будет поляризован в той же плоскости, что и возбуждающий свет. Если же молекула небольшого размера, то она вращается быстро и за время между поглощением света и его эмиссией успевает повернуться. Соответственно свет флюоресценции не будет поляризован в той же плоскости, что свет возбуждения, а будет деполяризованным. Таким способом можно оценить размеры молекулы [8]. Этот эффект используется при проведении гомогенных иммуноисследований. Пока меченый флюорофором антиген не образовал комплекса с антителом, его молекула невелика, вращается быстро и, если ее возбудить поляризованным светом, то флюоресценция будет неполяризованной. Однако, если реакция антиген-антитело уже прошла, образовались высокомолекулярные комплексы, флюоресцирующая группировка становится неповоротливой, и подобно большому флюорофору излучает поляризованный свет.Поляризация флюоресценции используется для определения лекарств, наркотиков и других малых молекул иммунохимическим методом. Методика основана на конкуренции между исследуемым аналитом и меченым флюорофором эталоном за ограниченное количество связывающих мест на антителе. Если исследуемого аналита в пробе мало, образуется много меченого флюорофором неповоротливого комплекса антиген-антитело и степень деполяризации мала. Наоборот, если концентрация аналита в пробе велика, образуется мало меченого флюорофором комплекса антиген-антитело и деполяризация будет значительна. Преимущество этого метода в том, что связанный флюорофор не надо отделять от свободного, отпадает необходимость в многократных отмываниях и т.д. поэтому методику называют гомогенной иммунопробой.Флюоресценция с разрешением во времени. Чувствительность флюоресцентных методов в значительной степени зависит от помех, вызванных тем, что свет возбуждения примешивается к свету эмиссии, а также неспецифической флюоресценцией исследуемого биологического объекта. Если сдвиг Стокса (т.е. различие в длинах волн света возбуждения и эмиссии) велик, помехи меньше как потому, что удается «уйти» от света возбуждения флюоресценции, так и потому что у неспецифической флюоресценции сдвиг Стокса мал. Помехи можно уменьшить и используя временнУю задержку (разрешение во времени) – возбуждать флюоресценцию короткими импульсами света, а измерять ее через некоторое время, когда возбуждающий импульс уже угас. Разумеется, технически это осуществимо только при условии, что время флюоресценции флюорофора велико. На этом основана ФРВ - флюоресценции с разрешением во времени – по-английски time-resolved fluorometry (TRF) [12].Используя ФРВ, удается создать флюоресцентные метки с чувствительностью и избирательностью намного более высокими, чем у органических красителей, например, флюоресцеина, эти метки по чувствительности приближаются к радиоактивным. В качестве флюорофоров используются лантаниды – редкоземельные элементы (№ № 58-71 по таблице Менделеева): самарий (Sm), европий (Eu), тербий (Tb) и др. Для них сдвиг Стокса измеряется сотнями нанометров, а время флюоресценции сотнями микросекунд, что во много раз больше, чем у обычных флюорофоров.Измеряя флюоресценцию на разных длинах волн и через разные промежутки времени после освещения импульсом возбуждающего света, можно одновременно количественно определять несколько флюорофоров этой группы. Это позволяет использовать двойные метки – например, одновременно пометить и измерять концентрации и антигена и антитела, что значительно повышает точность определения.Хемилюминесценция. Свечение молекул, перешедших в возбужденное состояние в результате химической реакции, называется хемилюминесценцией. Чаще всего ее вызывают, окисляя определенные органические вещества перекисью водорода, гипохлоридом, молекулярным кислородом.Специальная форма хемилюминесценции биологического материала, когда каталитический белок, например, люцифераза, повышает эффективность люминесцентной реакции, называется биолюминесценцией. Чувствительность определения с помощью биолюминесценции выше, чем при прямом флюоресцентном исследовании, и сравнима с чувствительностью иммунных проб. Для измерения люминесценции используются люминометры [7].Принцип хемилюминесцентной детекции реализуется в вариантах хемилюминесцентных методик и хемилюминесцентной детекции ферментных меток в иммунохимических исследованиях. Основными хемилюминесцентными метками служат сульфонамиды и эфиры акридина, инициаторами их свечения выступает смесь перекиси водорода и гидроокиси натрия. Вспышки длительностью до 5 сек регистрируются, предел детекции эфира акридина 0,5 аттомолей (5·10-18).Хемилюминесцентная детекция ферментных методик чувствительнее и удобнее колориметрической или флюоресцентной детекции.Еще одним вариантом является электрохемилюминесценция, представляющая собой процесс возникновения свечения, при котором высоко реактивные соединения, способные испускать свет, образуются из стабильных предшественников на поверхности электрода, к которому приложен положительный потенциал. Для этого могут использоваться соединения рутения, осмия, рения и других элементов. В электрохемилюминесцентном методе, который реализуется на приборах Elecsys («Roche Diagnostics»), в качестве метки применяется комплекс рутений (II)-трис (бипиредил)32+ NHS эфир, который способен сопрягаться с аминогруппами белков, гаптенов и нуклеиновых кислот. Бипиридиловые лиганды могут легко преобразовываться в форму активных хемилюминесцентных соединений [10].1.2. Устройство флюоресцентного микроскопаФлуоресцентный микроскоп является мощным исследовательским инструментом и предназначен для регистрации флуоресценции. Современные исследовательские флуоресцентные микроскопы являются главным компонентом систем анализа изображения (флуоресцентных станций). Флуоресцентный микроскоп имеет свои конструктивные особенности. Принципиальная схема флуоресцентного микроскопа представлена на рисунке 2.Рис.2. Устройство флуоресцентного микроскопа.Свет от источника (ртутная или ксеноновая лампа) проходит через возбуждающий светофильтр. При этом из всего спектра лампы вырезается свет определенного диапазона длин волн. Далее этот свет попадает на светоделитель, представляющий собой специфическое зеркало, устроенное таким образом, что свет с длиной волны меньшей некоторого значения - отражается, а более длинноволновый - проходит через светоделитель. Светоделитель расположен под углом в 45о к оси распространения возбуждающего света. Свет, отраженный светоделителем попадает в объектив флуоресцентного микроскопа и фокусируется на образце. При этом в образце происходит возбуждение флуоресценции. Возбужденный флуорофор начинает излучать свет. Вследствие смещения Стокса, этот излученный свет (свет флуоресценции) будет иметь большую длину волны (смещен в сторону красной области спектра), чем возбуждающий свет. Попадая в объектив, излученный свет достигает светоделителя. Но теперь светоделитель не отражает свет флуоресценции в сторону осветителя, а напротив, пропускает его. За светоделителем излученный свет встречает еще одну преграду - фильтр эмиссии. Он нужен для того, чтобы дополнительно вырезать из света флуоресценции некоторый участок спектра. Оставшийся свет направляется на окуляры или детектор [2].Отрезающие светофильтры разделяют поток излучения на проходящий и отраженный потоки различного спектрального состава. Различают два вида отрезающих светофильтров: длинноволновые отрезающие (shot pass filter или SP filter, также используется аббревиатура KP, где K - kurz и длинноволновые пропускающие (long pass filter или LP filter). SP фильтры задерживают более длинноволновый свет, но пропускают коротковолновый, а LP фильтры, напротив, пропускают длинноволновый свет, задерживая коротковолновый. Если использовать комбинацию из LP и SP фильтров, можно получить запирающий фильтр (BP band pass), который позволяется проходить свету определенного участка спектра, а остальные длины волн задерживаются. В современных системах запирающие фильтры применяются при многоканальной регистрации флуоресценции, а LP наиболее эффективны в системах с цветными камерами в качестве детектора.Отметим основные отличительные особенности флуоресцентного микроскопа:1.Наличие мощного источника света с преимущественным спектром в ультрафиолетовой и синей областях для возбуждения флуоресценции.2.Наборы светофильтров (фильтр возбуждения, светоделитель, фильтр эмиссии) для избирательного по длине волны пропускания или отражения света.3.Объектив одновременно играет роль конденсора, поэтому отсутствует необходимость приведения в соответствие параметров конденсора и объектива и облегчается юстировка.2. Методы создания флюоресцентных РНК-зондовМетод гибридизации in situ (на месте, лат.) основан на способности ДНК или РНК образовывать устойчивые гибридные молекулы с ДНК / РНК - зондами непосредственно на препаратах фиксированных хромосом и интерфазных ядер. С помощью этого метода можно определить точное местоположение практически любой последовательности ДНК или РНК непосредственно в клетке, клеточном ядре или на хромосомах.Для проведения гибридизации in situ пригодны цитологические или гистологические препараты клеток любых тканей или органов, приготовленные по стандартным методикам. В условиях клинической цитогенетической лаборатории используют препараты культивированных лимфоцитов периферической крови, клеток цитотрофобласта хорионального эпителия, культивированных и некультивированных клеток амниотической жидкости, различных тканей из абортного материала, а также мазков клеток буккального эпителия и крови [4].

Список литературы

1. Балалаева И.В., Сергеева Е.А., Катичев А.Р. Оптическая микроскопия в исследовании структуры и функций биологических объектов.– Нижний Новгород: Нижегородский госуниверситет, 2012. – 58 с.
2. Бережнов А.В., Зинченко В.П., Федотова Е.И.,Яшин В.А. Применение флуоресцентной микроскопии висследованиях динамики Са2+ в клетках. Пущино, 2007. - 65 с.
3. Гаврилов В. Б. Определение параметров связывания флуоресцентного зонда пирронового красного с сывороточным альбумином человека // Биофизика. — 2001.– Т. 46, Вып. 1. — С. 39–42.
4. Добрецов Г. Е. Флуоресцентные зонды в исследовании клеток, мембран и липопротеинов.– М.: Наука, 1989.– 277 с.
5. Летута С. Н., Маряхина В. С., Пашкевич С. Н., Рахматуллин Р. Р. Длительная люминесценция органических красителей в клетках биологических тканей // Оптика испектроскопия. − 2011. − Т. 110, № 1. − С. 72–75.
6. Рогоза Л.А. Флуоресцентные зонды для исследования пептидов. Biotechnologia Аcta, V. 6, No5, 2013. – р. 108-113.
7. Сайфитдинова А.Ф. Двумерная флуоресцентная микроскопия для анализа биологических образцов. – СПб.: «СОЛО», 2008-72 с.
8. Татарец А. Л., Поврозин Е. А., Дюбко Т. С. И др. Новые длинноволновые флуоресцентные зонды для исследования белков // Тез. докл. XXI Междунар. науч.-практ. конф. «Применение лазеров в медицине и биологии», Одесса, 26–29 мая 2004.— C. 134.
9. Alander, J. T., Kaartinen, I., Laakso, A., Patila, T., Spillmann, T., Tuchin, V. V., Venermo, M., Valisuo, P. A Review of Indocyanine Green Fluorescent Imaging in Surgery. // International Journal of Biomedical Imaging (2012). DOI:10.1155/2012/940585. 940585.
10. Joseph R. Lakowicz Principles of Fluorescence Spectroscopy. — Springer Science+Business Media, 2006. — ISBN 978-0-387-31278-1
11. Lavis, L. D.; Raines, R. T. Bright Ideas for Chemical Biology // ACS Chemical Biology 3 (2008) (3) С. 142—155. DOI:10.1021/cb700248m.
12. Zheng, H.; Zhan, X.-Q.; Bian, Q.-N.; Zhang, X.-J. Advances in modifying fluorescein and rhodamine fluorophores as fluorescent chemosensors // Chemical Communications 49 (2012) С. 429—447. DOI:10.1039/c2cc35997a.
Пожалуйста, внимательно изучайте содержание и фрагменты работы. Деньги за приобретённые готовые работы по причине несоответствия данной работы вашим требованиям или её уникальности не возвращаются.
* Категория работы носит оценочный характер в соответствии с качественными и количественными параметрами предоставляемого материала. Данный материал ни целиком, ни любая из его частей не является готовым научным трудом, выпускной квалификационной работой, научным докладом или иной работой, предусмотренной государственной системой научной аттестации или необходимой для прохождения промежуточной или итоговой аттестации. Данный материал представляет собой субъективный результат обработки, структурирования и форматирования собранной его автором информации и предназначен, прежде всего, для использования в качестве источника для самостоятельной подготовки работы указанной тематики.
© Рефератбанк, 2002 - 2022