Применение установок замкнутого водоснабжения для формирования маточных стад сиговых рыб (на примере тугуна)

Изучены особенности формирования маточных стад сиговых рыб (Coregonidae) в индустриальных условиях на примере модельного объекта – тугуна (Coregonus tugun). Проведено выращивание сеголеток тугуна в установке замкнутого водоснабжения в течении одного годового цикла.
Работа защищена на "отлично" ...

СОДЕРЖАНИЕ
ВВЕДЕНИЕ 4
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 6
1.1 Биология и экология тугуна 6
1.2 Рыбоводство в установках с замкнутым водоснабжением 9
1.2.1 История создания УЗВ 9
1.2.2 Устройство установок с замкнутым водоснабжением. 10
1.2.3 Биотехнологические основы получения половых продуктов рыб 12
1.2.4 Биологические основы осеменения икры 14
1.2.5 Биологические основы инкубации икры и подращивания личинок 15
1.3 Оценка морфофункционального состояния организма рыбы во время рыбоводного процесса 17
1.4 Гаметогенез рыб 20
1.4.1 Оогенез 20
1.4.2 Сперматогенез 24
ГЛАВА 2 МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 25
ГЛАВА 3 РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 27
ВЫВОДЫ 39
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 40

ВВЕДЕНИЕ
Использование установок замкнутого водоснабжения (УЗВ) для получения жизнестойкой молоди ценных видов рыб является одним из перспективных направлений развития аквакультуры. В настоящее время рыбные ресурсы Мирового океана истощаются, а внутренних водоёмов – поддерживаются почти исключительно за счёт искусственного воспроизводства, поэтому возможность получения качественного посадочного материала, независимо от времени года, является важным стимулом совершенствования УЗВ [1].
Высокие репродуктивные возможности рыб, быстрый рост при невысоких кормовых затратах, наличие в хозяйствах достаточного количества маточного поголовья, выращивание рыбы в местах её потребления и независимо от внешнеэкономической ситуации - всё это позволяет говорить о несомненной пользе развития технологий а квакультуры. Кроме непосредственной практической пользы новые рыбоводные технологии востребованы и фундаментальной наукой – производители, эмбрионы и молодь являются удобным объектом для исследований (эмбриологических, физиологических, биохимических и др.).
Не исключена ситуация, при которой потребуется искусственное воспроизводство ценных видов рыб Обского бассейна, прежде всего сиговых. Различные исследования [2, 3, 4] показали, что состояние рыбных ресурсов в Обь-Иртышском бассейне ухудшается, а антропогенное воздействие на водные экосистемы нарастает. Экологическая обстановка складывается, главным образом, под воздействием нефтегазового комплекса, а также транспорта и коммунального хозяйства. Промышленное освоение газоносных пластов Обской губы (особенно в местах крупных скоплений рыбы в период заморных явлений) повысит негативное антропогенное воздействие на сиговых, особенно чувствительных к загрязнителям. В таких условиях содержание маточных стад сиговых рыб и получение их жизнестойкой молоди в установках замкнутого водоснабжения может оказаться необходимым для сохранения и увеличения их численности.
В связи с этим, встаёт вопрос об оценке морфофизиологического состояния рыб, выращиваемых в УЗВ, их репродуктивного потенциала.
Целью нашей работы являлось исследование морфофункционального состояния тугуна, выращиваемого в установке замкнутого водоснабжения, для установления особенностей формирования маточных стад сиговых рыб в индустриальных условиях.
Для достижения цели были поставлены следующие задачи:
1) Изучить температурный и гидрохимический режимы УЗВ в период содержания в ней тугуна.
2) Изучить динамику размерно-весовых показателей тугуна с 6-месячного возраста до полового созревания.
3) Провести гистологический анализ дыхательной, пищеварительной и репродуктивной систем тугуна.

Однако в настоящее время набор методов для такой оценки ограничен. К ним относятся: биохимический анализ крови, гистологический анализ печени, гонад, крови, интерренальной ткани (гомолог коры надпочечников).Интерренальная ткань рыб находится в головной части мезонефроса и легко выявляется на гистологических препаратах. Рядом исследователей показано, что активность интерренальной ткани у молоди лососевых возрастает в период смолтификации [49].Печень является удобным объектом гистологического анализа, позволяющим оценить морфофункциональное состояние организма рыбы, как в естественном состоянии, так и в условиях выращивания, в т.ч. в установках замкнутого водоснабжения (УЗВ).Печень — орган с чрезвычайно широким функционально-метаболическим профилем. Главное ее назначение в организме — трансформировать питательные вещества в такие физические и химические формы, которые могли бы быть использованы организмом или подвергнуты экскреции. Характеристики гепатоцитов некоторых водных позвоночных представлены в таблице 3.Таблица 3Характеристики гепатоцитов некоторых водных позвоночных [50]Вид животногоВлажный вес (мг/млн клеток)Сухой вес (мг/млн клеток)Содержание белка (мг/млн клеток)Минога речная (Lampetra fluviatilis)1,60,430,23Угорь европейский (Anquilla anquilla)2,010,440,21Плотва обыкновенная (Rutilus rutilus)1,390,380,2Лосось стальноголовый (Salmo gairdnery)1,1 – 6,000,15 – 0,77Клетки печени рыб в 6 – 8 раз меньше гепатоцитов млекопитающих. Возможно, что большее отношение поверхности к объему мелких клеток имеет преимущества, поскольку субстраты и кислород входят, а продукты метаболизма покидают мелкие клетки быстрее, чем крупные.Важной особенностью гепатоцитов, отражающей запасающую функцию печени, является наличие в них жировых включений. Отклонение от нормы содержания жира в гепатоцитах (30% для лососевых) снижает функциональное возможности печени и уменьшает сопротивляемость организма неблагоприятным условиям. Анализ доли липидных включений позволяет оценить энергетические резервы организма, а также стрессовое воздействие. У многих видов рыб имеется глубокое качественное и количественное различие по липидам у самцов и самок перед нерестом, что по видимому объясняется особенностями в формировании репродуктивной системы [51, 52].При воздействии на печень различных токсикантов в ней могут появляться такие отклонения как жировое перерождение, лизис паренхимы вокруг центральных вен, скопления расположенных концентрическими слоями гепатоцитов, появление в гепатоцитах крупных вторичных и третичных лизосом, миелиновых фигур, сокращение числа митохондрий, увеличение числа комплексов Гольджи [53, 54, 55].Жабры рыб являются полифункциональным органом, в них осуществляются процессы дыхания, поддержания ионного баланса, удаления продуктов метаболизма [56, 57]. Гистологическое состояние жаберного эпителия является важным показателем качества внешних условий, т.к. гистологические нарушения в жаберном эпителии могут быть следствием неудовлетворительного кислородного режима и ионного состава воды в УЗВ, присутствия избыточного количества метаболитов.Различные исследования [58, 59] показали, что в жабрах сиговых рыб могут встречаться различные отклонения, такие как гиперплазия и адгезия филаментов и ламелл, отёчность респираторных ламелл, срастание филаментов и др.Гаметогенез рыбОогенезВажнейшим показателем качества рыбоводных работ является состояние репродуктивной системы объектов разведения. Рядом исследований [60, 361] показано, что любые изменения в окружающей среде или воздействия на организм рыбы могут повлиять на процессы гаметогенеза, икрометания и эмбриогенеза, и даже привести к нарушению нормального протекания этих процессов, а впоследствии – к появлению нежизнеспособного потомства, что снижает репродуктивный потенциал рыб.Оценка состояния репродуктивной системы рыб часто, особенно в полевых условиях производится на основании макроскопических визуальных признаков, однако значительно более точные сведения о состоянии и развитии половых клеток даёт метод гистологического анализа. Важным показателем репродуктивного потенциала организма рыбы является соотношение половых клеток, находящихся на разных стадиях развития. У самок также определяют диаметр ооцитов, строение их оболочек, структуру цитоплазмы (степень вакуолизации, диаметр желтковых гранул, жировые включения), положение ядра в ооците, количество и расположение ядрышек.Для успешного изучения функционирования репродуктивной системы рыб необходимо однозначно определять и обозначать идентичные процессы и состояния половых клеток и желёз. Первая наиболее разработанная и принятая большинством отечественных исследователей схема периодизации оогенеза и развития яичников была предложена В. А. Мейеном [62, 63], предложившим разделить развитие половых клеток на периоды (синаптенного пути, малого и большого роста) и фазы. В дальнейшем было признано целесообразным дополнить три периода, выделенные Мейеном, двумя новыми: оогониальным периодом и периодом созревания [64, 65, 66]. В полном виде с некоторыми дополнениями эта схема представлена в таблице 3 [67].Половые клетки, находящиеся в оогониальном периоде, обладают следующими характерными особенностями: 1) присутствие в цитоплазме специфических структур, так называемого “nuage” материала и свободных рибосом; 2) способность к митотическим делениям; 3) чувствительность к рентгеновскому облучению, температуре [68, 69]. Считая главной особенностью первичных половых клеток и гониев их способность к митотическим делениям, некоторые авторы [70] объединяют эти два периода под общим названием «период митотического размножения половых клеток». С переходом к ранней профазе мейоза гонии утрачивают способность к митотическим делениям, происходит премейотическая репликация ДНК [71, 72]. В ядрах формируется синаптонемальный комплекс, обеспечивающий конъюгацию хромосом, происходит синтез экстрахромосомной ДНК [73]. В этом состоянии половой клетки определяется, пойдёт ли её развитие по пути оогенеза или сперматогенеза. Одним из методов реверсии пола у рыб является индукция с помощью стероидных гормонов синтеза экстрахромосомной ДНК [74].Таблица 4Периодизация гамето- и гонадогенеза у самок рыбГаметогенезГонадогенезПериодыФазы, стадии, ступениПериоды и стадииОогониальный (митотического размножения половых клеток)Первичные половые клетки, оогонииИндифферентный периодПремейотических преобразований ядра (ядерных превращений, синаптенный путь, ранняя профаза мейоза)Лептотена, зиготена, пахитена, ранняя диплотенаПериод цитологической дифференцировки пола, I стадия зрелостиПротоплазматического роста (ППР, цитоплазматического роста, превителлогенеза)начало ППР;накопление РНК в околоядерной зоне цитоплазмы;накопление РНК в периферическом слое цитоплазмы;формирование желточного ядраII стадия зрелостиТрофоплазматического роста (вителлогенеза)начало вакуолизации цитоплазмы;середина вакуолизации цитоплазмы;заполнение цитоплазмы вакуолями;начало отложения желтка;интенсивное желтконакопление;наполненный желтком ооцит;начало поляризации ооцитаIII стадияIV стадияСозреваниезавершение поляризации и гидратация;деления созреванияV стадияОсновные особенности ооцитов периода превителлогенеза следующие: 1) интенсивный рост ооцитов (увеличиваются в 12 раз); 2) включение предшественников синтеза РНК и белка; 3) наличие первичного и краевых ядрышек, различающихся по биосинтетической активности [75]; 4) наличие, при определённых условиях «желточного ядра» и циркумнуклеарного кольца [66, 76]; 5) преимущественный синтез 4S-транспортной и 5S-рибосомной РНК, накапливающихся в цитоплазме ооцитов [77]; 6) синтез м-РНК для биосинтеза белков – рецепторов вителлогенина [78]; 7) клетки фолликуляного эпителия имеют веретеновидную форму и слабо размножаются [79]. При переходе к вителлогенезу у ооцитов в ядрышках появляется гранулярный компонент, отмечается активация синтеза 18S и 28S рибосомных РНК [77]. Для периода вителлогенеза характерно появление следующих включений в цитоплазме ооцитов: глыбки гликогена; капли нейтрального жира, появляющиеся у некоторых видов рыб ещё в превителлогенезе; кортикальные гранулы и желточные зёрна.Кортикальные гранулы являются предшественниками кортикальных альвеол, которые, благодаря находящимся в них кислым мукополисахаридам, обеспечивают кортикальную реакцию – формирование перивителлинового пространства (после оплодотворения). Опыты с введением меченых предшественников кислых мукополисахаридов показали, что синтез и формирование кортикальных гранул постоянно происходят под оболочкой ооцита [80, 81].Первые желточные зёрна, появляющиеся в самом начале периода вителлогенеза имеют в основном эндогенное происхождение, хотя в них присутствуют белки экзогенного происхождения, что показано на опытах с использованием Н3-вителлогенина [82]. В дальнейшем интенсивность этого процесса возрастает. Согласно классической схеме [83], вителлогенин поступает в ооцит благодаря микропиноцитозной активности мембраны, имеющей на своей поверхности рецепторы для его обнаружения. Синтез вителлогенина происходит в печени, откуда он движется к ооциту через кровеносные сосуды и пространство между фолликулярными клетками [84].Во время вителлогенеза наблюдается увеличение интенсивности размножения фолликулярных клеток, изменение их формы, а также появление радиальной исчерченности оболочки ооцита. Синтез белков, участвующих в формировании оболочки ооцита происходит в печени [85]. Во время периода вителлогенеза ооциты чувствительны к рентгеновскому облучению, вызывающему гибель фолликулярных клеток [86]. Воздействие низких температур замедляет вителлогенез; повышенные температуры ускоряют ранние стадии вителлогенеза, но на поздних стадиях наблюдается резорбция ооцитов. Температурный оптимум для развития яйцеклеток в процессе оогенеза сужается [87]. Период созревания начинается с миграции ядра к оболочке ооцита (фаза миграции ядра). К концу этой фазы происходит концентрация хромосом в центре ядра и разрушение ядрышек. Затем следуют первое и второе деления созревания и образование направительных телец. На этом этапе ооциты обладают высокой чувствительностью к гипофизарным гормонам [36], к облучению и химическим веществам [88], к температуре [65, 89].СперматогенезРазвитие мужских половых клеток проходит через несколько стадий, которые охватывают период от начала размножения сперматогониев до формирования зрелых спермиев. На стадии размножения происходит интенсивное деление крупных первичных сперматогониев. Размножающиеся сперматогонии формируют в стенках канальцев так называемые цисты, в пределах которых половые клетки находятся на одинаковых стадиях развития, так как являются потомками одной сперматогониальной клетки [90]. Интенсивное деление сперматогониев часто сопровождается появлением «фрагментированных», «лопастных» или «полиморфных» ядер, что возможно связано с интенсификацией обменных процессов во время активного размножения половых клеток.На определённом этапе развития сперматогонии вступают в стадию роста и с этого момента называются сперматоцитами I порядка. В это время в ядре сперматоцита происходят сложные преобразования, связанные с подготовкой к делениям созревания.С наступлением стадии созревания каждый сперматоцит I делится на два сперматоцита II порядка, а они, в свою очередь, производят по две сперматиды, которые вскоре вступают в стадию формирования и преобразуются в зрелые спермии.Опыты по оперативному удалению или химической инактивации гипофиза показали, что у гипофизэктомированных самцов происходит задержка сперматогенеза на стадии деления сперматогониев и превращения их в сперматоциты, сопровождаемая дегенерацией гонад. Сперматогенез является термозависимым процессом. Пониженные и повышенные температуры являются факторами, тормозящими сперматогенез, хотя физиологические механизмы у этих процессов различны [91]. ГЛАВА 2 МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯНами было проведено исследование состояния сеголеток тугуна, содержащихся в установке с замкнутым водообеспечением с октября 2008 по октябрь 2009 гг. В ходе исследования проводились систематические измерения линейных размеров и массы рыб, учёт количества потребляемого корма, анализ химического состава воды (pH, аммонийный азот, нитриты, нитраты, фосфаты, железо, растворённый кислород), температурного режима в УЗВ. Прижизненный сплошной учет размерно-весовых показателей проведен на 157 особях каждые 1.5-2.5 месяца (до апреля 2009 г.), в дальнейшем измерения и взвешивания проводили на отбираемых для гистологического анализа экземплярах – по 10 шт. Гистологический анализ проведен на 42 самках и 39 самцах тугуна.В ходе работ проводились исследования печени, гонад и жаберного аппарата. Печень и жабры фиксировали в смеси Буэна, гонады фиксировали в смесях Буэна и Карнуа. Фиксированные органы проводили через спирты возрастающей концентрации через бутанол и заливали в парафин. При помощи микротома HM 355S изготовляли серийные парафиновые срезы толщиной 5 мкм. Окраску препаратов печени, жабр и части гонад осуществляли железным гематоксилином по Гейденгайну [92]. Для части гонад была проведена гистохимическая реакция на РНК/ДНК по Браше [93]. Препараты, окрашенные гематоксилином, рассматривали при стократном увеличении объектива микроскопа AXIO A1. Анализ клеток проводили при помощи лицензионного программного обеспечения AxioVision 4.7. Для анализа печени из 25-30 срезов этого органа на каждом 5-6 срезе исследовали участок площадью 1600 мкм2. Измеряли размеры гепатоцитов, их ядер, площадь липидных включений в них. Вычисляли долю липидных включений в гепатоцитах, как отношение площади липидов к площади всей клетки (Sлипидных включений/Sклетки×100%). Проводили статистический анализ результатов измерений, для каждого исследуемого параметра вычисляли 99% доверительный интервал. В жабрах исследовали отношение площади участков с различными гистологическими отклонениями к площади всего среза. В яичниках исследовали площадь и диаметр ооцитов и их ядер, проводили подсчёт количества ооцитов, находящихся на разных стадиях развития. Поскольку количественный анализ ооцитов на разных стадиях (нерестового и резервного фондов) затруднён из-за вероятности повторного подсчёта одних и тех же клеток на соседних срезах, нами была использована методика введения поправочных коэффициентов [67]. В соответствии с ней учитываются диаметры клеток (чем меньше диаметр клетки тем больше вероятность повторного подсчёта), и относительное количество ооцитов данной группы вычисляется по формуле:Ni(%)=(niDii : i=1nniDi) × 100,(1)где Ni(%) – относительное количество ооцитов данной группы, %; n – число размерных групп ооцитов; D – диаметр ооцитов данной группы.Ещё одним способом устранения вероятности повторного подсчёта или пропуска ооцитов является методика тотального подсчёта половых клеток на серийных срезах. Эта методика является наиболее приемлемой в аспекте достоверности полученных результатов, но она чрезвычайно трудоёмка. Возможным решением этой проблемы является получение толстых парафиновых срезов гонад, окраска их флуоресцентными красителями и построение при помощи конфокального лазерного сканирующего микроскопа трёхмерных изображений участков яичника.Препараты, окрашенные метиловым зелёным – пиронином по Браше, анализировали при помощи микроскопа AXIO A1 и лазерного сканирующего конфокального микроскопа LSM 510 (Zeiss) при длине волны возбуждения 543 нм, волны испускания – 560 нм [94]. Гидрохимический анализ проводился один или два раза в неделю, а также за день до контрольных измерений, в день измерений и через день после измерений при помощи ионспецифичного измерителя C 205 (Hanna). Образцы для анализа отбирались утром до первого кормления.ГЛАВА 3 РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕНа рисунке 2 представлены данные о температуре воды, концентрации кислорода, pH, и концентрации аммония. Температура в исследуемый период значительно колебалась: 12-16 Со с октября по декабрь, 2-6 Со в декабре-январе, 10-16 Со в марте-апреле и 18-22 Со с мая по июль, при оптимальной для нагула тугуна – 16-20 Со, для нереста – 1-9 Со. pH составлял 8,0 – 8,6. Концентрация растворённого в воде кислорода варьировала от 7 до 10 мг/л. Максимальная концентрация аммония составляла 0,43 мг/л, фосфатов – 2,5 мг/л, нитритов – 0,28 мг/л, нитратов – 4,8 мг/л. Железо не выявлялось. В ходе анализа гидрохимических показателей наблюдались кратковременные превышения предельно допустимых концентраций компонентного состава воды для выращивания тугуна [95], что вызвано увеличением плотности посадки за счет временного введения в бассейны УЗВ производителей карпа и повышения температуры в установке.Размерно-весовые показатели тугуна за весь период исследования заметно увеличились, хотя в зимний период рост замедлился из-за низких температур (рис. 3). По достижении возраста 1+ средняя масса тугуна составила 35 г, при средней длине 150 мм, что значительно превышает показатели тугуна в естественных популяциях – 10,5 г и 100 мм соответственно [96].Связь линейных размеров и массы сеголеток приведена на рисунке 4а. Можно видеть, что корреляция этих показателей в течение первого месяца возрастала, затем данная тенденция сменилась на противоположную – в декабре и, в особенности, в январе, при максимальном снижении температуры воды отмечали соответствующее снижение коэффициентов корреляции. С началом повышения температур воды связь между исследуемыми параметрами вновь возросла. Кормовой коэффициент в осенний период составлял 2,14, в декабре – 1,33, к началу апреля – 2,42 (рис. 4б). В январе увеличение кормового коэффициента до 5,2 связано с резким понижением температуры воды в УЗВ, из-за чего сеголетки тугуна почти не брали корм.температура водысодержание кислородаpHNH4+нитритыфосфатыРис. 2. Динамика температурного и гидрохимического режима в УЗВ (2008-2009гг.)абРис. 3. Динамика размерно-весовых показателей тугуна в УЗВ (2008-2009 гг.) а - линейные размеры (по Смитту); б - общая масса тела АБРис. 4. Динамика коэффициента корреляции размерно-весовых показателей (а) и кормового коэффициента (б) тугуна за время содержания в УЗВВ связи с тем, что интенсивный рост тугуна в установке при повышенной температуре в летний период сопровождался увеличением интенсивности загрязнения воды продуктами метаболизма – аммонийным азотом, фосфатами (рис. 2), это оказывало угнетающее воздействие на процессы роста и развития. При нормализации температурного и гидрохимического режимов в УЗВ уровень развития тугуна оптимизируется. Гонады. Гистологический анализ гонад тугуна показал, что у большинства особей в возрасте 430 суток яичники и семенники достигли IV стадии зрелости. В природных условиях в этом возрасте IV стадии достигают лишь единичные особи при меньших размерах и массе. При анализе соотношения половых клеток разных генераций в яичниках тугуна отмечено, что с возраста 153 до 211 суток в них повышалось число превителлогенных ооцитов (до 70 – 80%) и ооцитов фазы вакуолизации цитоплазмы (20 – 30%, рис. 5а, б), в дальнейшем (до 251 сут.) возрастала доля вителлогенных ооцитов (7%, рис. 5в). У самок в возрасте 428 суток некоторые вителлогенные ооциты начинали резорбироваться (рис. 5д). Резорбция ооцитов нерестового фонда обусловлена, главным образом, неблагоприятными температурными условиями. Как известно, температурный оптимум для развития яйцеклеток в процессе оогенеза сужается, достигая минимального интервала к периоду созревания, поэтому, при необходимости получения половых продуктов тугуна необходимо понижать температуру в УЗВ до 1 – 9˚С. К двухлетнему возрасту диаметр превителлогенных ооцитов у рыб составил 110.5 мкм, ооцитов фазы вакуолизации – 190.8 мкм, фазы накопления желтка – 340-990 мкм, что соответствует их размерам у тугуна в природе [97].д Рис. 5. Половые клетки самок тугуна (2008 – 2009гг.