ИССЛЕДОВАНИЕ АДАПТИВНОЙ РЕАКЦИИ ПОПУЛЯЦИИ ДРОЖЖЕВЫХ КЛЕТОК НА ДЕЙСТВИЕ ИОНИЗИРУЮЩЕГО ИЗЛУЧЕНИЯ

РЕФЕРАТ
Выпускная квалифицированная работа выполнена на тему «Исследование адаптивной реакции популяции дрожжевых клеток на действие ионизирующего излучения». Работа выполнялась на кафедре экспериментальной физики физико-технологического института.
Целью работы является исследование адаптивной реакции популяции дрожжевых клеток на действие ионизирующего излучения
Выпускная квалификационная работа включает 3 основные главы.
Первая глава посвящена литературному обзору по тематике работы. Рассмотрены основные определения, используемые в радиобиологии. Также рассмотрено действие ионизирующего излучения на клетку и ответ клетки на излучение. Приведено описание кривой «доза – эффект » и адаптивной реакции.
Вторая глава посвящена используемым материалам и методам. В данной главе описываются поп ...

Содержание

ЗАДАНИЕ -
РЕФЕРАТ 3
ПЕРЕЧЕНЬ СОКРАЩЕНИЙ 4
ВВЕДЕНИЕ 5
1. БИОЛОГИЧЕСКОЕ ДЕЙСТВИЕ ИОНИЗИРУЮЩЕГО ИЗЛУЧЕНИЯ 7
1.1 Ионизирующее излучение: основные характеристики 7
1.2 Прямое и косвенное действие ионизирующего излучения на клетку 8
1.3 Реакции клетки на действие ионизирующего излучения 11
1.4 Зависимость биологического эффекта от дозы излучения. Кривая «доза-эффект» 14
1.5 Адаптивная реакция дрожжевых клеток 15
2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 18
2.1 Объекты исследования 18
2.2 Источники ионизирующего излучения и условия облучения 21
2.3 Методика анализа жизнеспособности клеток 24
3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 27
3.1 Построение кривой фазы роста дрожжевых клеток 27
3.2 Построение кривой выживаемости 28
3.3 Проявление адаптивной реакции дрожжевых клеток 30
4. ЗАКЛЮЧЕНИЕ 34
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ 35

ВВЕДЕНИЕ
В настоящее время в радиобиологии и радиоэкологии наиболее актуальным направлением является изучение эффектов «малых» доз. Это обусловлено тем, что биологические объекты подвергаются облучению в «малых» дозах от естественного радиационного фона и в результате различных техногенных факторов. «Большие» дозы в настоящее время получают лишь больные при лучевой терапии и отдельные лица при авариях на производствах атомной промышленности. Вопрос о биологических эффектах действия «малых» доз ионизирующего излучения, а также проблема их количественной оценки продолжают оставаться предметом многочисленных дискуссий и мнений по поводу их опасности для человека и среды его обитания. Понятие «малые дозы» не имеет единого определения. Принято считать, что «малые» дозы это дозы, равные естественному фоновому облучению или превышающие его в десять раз; это дозовые пределы для профессиональных работников или дозы, незначительно превышающие их и не оказывающие непосредственного влияния на состояние здоровья.
В последние годы в радиобиологии были открыты новые эффекты воздействия ионизирующего излучения в области «малых» доз. К ним относятся эффект гормезиса, адаптивный ответ, гиперчувствительность. Все это приводит к изменению радиочувствительности биологического объекта и поэтому требует детального исследования. Так, на примере изменения радиочувствительности одноклеточных организмов предварительным облучением «малой» дозы можно оценить эффект адаптации клеток к повреждающему облучению.
Целью данной работы является экспериментальное исследование адаптивной реакции популяции дрожжевых клеток на действие ионизирующего излучения.
Для достижения поставленной цели необходимо решить следующие задачи:
1. Провести литературный обзор по теме исследования.
2. Освоить методы культивирования дрожжей и количественного учета клеток в камере Горяева.
3. Приготовить образцы популяции дрожжевых клеток.
4. Построить кривую выживаемости популяции дрожжевых клеток при облучении в диапазоне доз 2-12 кГр.
5. Определить значения показателей летальной дозы излучения LD50 и LD37.
6. Исследовать адаптивный ответ дрожжевых клеток на действие "малыми" дозами излучения.

Годы, столетияОтдаленные биологические эффекты; стойкое нарушение функций; генетические мутации, действующие на потомство; соматические эффекты (рак, лейкоз, сокращение продолжительности жизни, гибель организма).Повреждения цитоплазматических структур проявляются в нарушении энергетического обеспечения клеток и проницаемости клеточной мембраны, нарушении обмена веществ, целостности лизосом, что ведёт к гибели клеток. Изменения в ядре клетки под влиянием приводят к торможению синтеза ДНК. Возникают однонитевые и двунитевые разрывы, приводящие к хромосомным нарушениям. Появляются генные мутации. При однонитевых разрывах и других незначительных повреждениях могут идти репаративные процессы. Повреждения ядра приводит к синтезу изменённых белков, которые впоследствии способствуют образованию злокачественных опухолей, вторичных радиотоксинов, вызывающих лучевую болезнь и преждевременное старение. Наиболее чреваты последствиями повреждения генома клетки и хромосомного аппарата, ведущие к нарушению механизма митоза. Малые дозы ИИ вызывают обратимые изменения клетки. Они проявляются сразу или через несколько минут после облучения и с течением времени исчезают. К ним относятся: ингибирование нуклеинового обмена, изменения проницаемости клеточных мембран, задержка митозов, изменения хроматина ядер и др. При «больших» дозах облучения в клетках наступают летальные изменения, приводящие к их гибели до вступления в митоз, интерфазная гибель, либо в момент митотического деления, митотическая репродуктивная гибель. Основной причиной репродуктивной гибели клеток являются структурные повреждения ДНК, возникшие под влиянием облучения. Погибают все делящиеся клетки. Гибель клеток ведёт к опустошению тканей, нарушению их структуры и функции. Полное подавление митозов наступает после воздействия больших доз ИИ, когда клетка значительное время продолжает жить, но необратимо утрачивает способность к делению. В результате такой необратимой реакции на облучение часто образуются патологические формы гигантских клеток, содержащие несколько наборов хромосом вследствие их репликации в пределах одной и той же не разделившейся клетки. Зависимость биологического эффекта от дозы излучения. Кривая «доза-эффект»Строгие количественные эксперименты впервые были проведены в конце 20-х годов. Для количественных экспериментов радиобиологи стали использовать клоны генетически однородных клеток, вирусные частицы, препараты макромолекул, т. е. такие системы, в которых легко определить реакцию единичного объекта на действие излучения в данной дозе.Уже в первых радиобиологических исследованиях отмечалась важнейшая закономерность — вероятностная природа проявления реакции клеток на облучение. При оценке зависимости доли погибших клеток от величины дозы облучения выяснялось, что различные одноклеточные объекты гибнут при самых малых дозах облучения, с ростом дозы увеличивается число погибших клеток, однако даже при облучении в очень высоких дозах некоторое число клеток сохраняет жизнеспособность.Существенно, что с ростом дозы облучения наблюдалось увеличение не столько степени проявления эффекта (глубины поражения отдельной клетки), сколько доли летально пораженных клеток в облученной популяции.Примеры типичных графических кривых, отражающих зависимость доли выживших клеток от величины дозы облучения (кривые «доза-эффект»), приведены на рисунке 4. Рисунок 4 - Зависимость конечных биологических эффектов от дозы облучения: а) гибель инфузорий Colpidium colpoda через 2 часа после облучения; б) гибель яиц аскариды после облучения в аэробных условиях; в) инактивация вируса табачной мозаики γ - лучами; г) инактивация сухой рибонуклеазыНа графике на оси абсцисс откладывают величину дозы, а на оси ординат – меру радиобиологического эффекта: выживаемость клеток, выход хромосомных аберраций, интенсивность дыхания и т. п.Для построения этих кривых определенное количество объектов данного вида облучали в широком диапазоне доз; после облучения в каждой дозе определяли долю объектов, сохранивших исходные свойства, по отношению к их общему числу до облучения. Основными параметрами, которые определяются при построении кривой, является максимальный возможный эффект (Еmax) и доза, что вызывает полумаксимальный эффект (LD50). [1]Адаптивная реакция дрожжевых клетокАдаптивный ответ – это реакция биологических объектов, которая заключается в том, что после действия адаптирующих малых доз, при повторном облучении через определенный интервал времени больших повреждающих доз, радиобиологических эффект от повреждающей дозы понижается. Другими словами приобретение биологическим объектом устойчивость к поражающему действию излучения в большой дозе.Специфической особенностью радиационно АО является значительная, порой более чем на несколько порядков, разница в величинах адаптирующего и повреждающего воздействия. Обычно первая доза не вызывает регистрируемых нарушений, но при дополнительном облучении в высокой дозе наблюдается значительное снижение выхода радиогенетических повреждений, по сравнению с однократным острым облучением в суммарной дозе.Кроме основного отличия в величине адаптирующей и повреждающей дозы стоит отметить некоторые характерные величины: время между завершением предварительного облучения адаптирующей дозой и началом облучения повреждающей дозой; и время сохранения АО клеток. В частности, для клеток интервал между облучениями может составлять от 4 до 6 часов, а длительность сохранения эффекта от часов до месяцев. Обязательное соблюдение интервала времени между адаптирующей и повреждающей дозами указывает на то, что программа переключения клеток на АО требует сравнительно продолжительной перестройки радиорезистентности, которая может сохраняться в течение многих клеточных циклов. Так, если экспозиция адаптивного ответа на клеточном уровне обычно требует 4—6 часов, то сохраняться ответ может несколько часов, суток, месяцев. Выделяют два возможных способа реализации, адаптирующего воздействия:включение новой генетической программы;индуцированные радиацией синтез белков и мобилизация антиокислителей, т.е. эндогенных защитных ресурсов клетки, в количествах, способных поддержать состояние готовности к АО в течении нескольких клеточных поколенийТаким образом, можно сделать вывод, что АО это специфическая общая реакция клеток, возникающая в ответ на незначительное повреждающее воздействие стресорного типа. [1, 8, 9, 10]ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯОбъекты исследованияВ данной работе для проведения исследований в качестве биологического объекта взяты представители микроорганизмов: винные дрожжи, относящиеся к классу грибов.Дрожжи – грибы, которые не образуют специфического вегетативного тела – мицелия и существуют в одноклеточной форме. Дрожжи живут в жидких или полужидких субстратах, в которых много органических веществ: например, в сахарном растворе, оставленном на несколько дней в помещении при комнатной температуре, появляется пена, а запах становится алкогольным – это дрожжи, попав из воздуха в раствор, начинают активно расти и размножаться. Дрожжи имеют клетки шаровой, лимонообразной, овальной или яйцевидной, палочковидной или вытянутой, амебообразной, ветвистой формы (Рисунок 5) размером от 5-6 до 10-14 мкм. Они размножаются при помощи почкования и спорообразования.Рисунок 5 - a — шаровая; б — лимонообразная; в — овальная или яйцевидная; г — палочковидная или вытянутая; д — амебообразная; е — ветвистаяВинные дрожжи обладают более высокой спиртоустойчивостью по сравнению с другими дрожжами, а также способны подавлять другие микроорганизмы во время сбраживания вина.Дрожжи в питательной среде растут до тех пор, пока содержание питательных компонентов среды, не достигнут минимума, после рост дрожжей прекращается. Если на протяжении этого времени не добавлять питательных веществ, то получим периодическую культуру (популяцию клеток в ограниченном жизненном пространстве). Кривая зависимости логарифма числа живых клеток от времени, называется кривой роста (Рисунок 6). Она имеет четыре фазы роста, протекающие с разными скоростями. Промежуток времени между инокуляцией и достижением максимальной скорости деления находится в начальной фазе роста. Продолжительность этой фазы зависит от условий культивирования и возраста инокулята, а также от того, насколько пригодна для роста питательная среда. Когда происходит максимальная скорость деления клеток дрожжей, это означает, что дрожжи перешли во вторую стадию роста, называемая, экспоненциальной фазой роста. После периода экспоненциальной фазы рост клеток начинает замедление, это связано с большой плотности дрожжевых культур или накопления токсичных продуктов обмена. Эти факторы вызывают переход к третьей стационарной фазе. В стационарной фазе происходят такие процессы, как использование запасных веществ, распад части рибосом и синтез ферментов. Быстро гибнут лишь очень чувствительные клетки; другие еще долго сохраняют жизнеспособность - до тех пор, пока есть возможность получать необходимую для этого энергию в процессе окисления каких-либо запасных веществ или клеточных белков. Когда все запасы истрачены и в питательной среде не осталось пригодных для питания веществ, происходит переход к последней фазе - фазе отмирания.1379855914400100119297656229352002298958010191753003408495510191754004Рисунок 6 - Типичная кривая роста периодической культуры клеток. 1 - Начальная фаза, 2 - Экспоненциальная фаза, 3 - Стационарная фаза, 4 - Фаза отмиранияДалее мы будем рассматривать клетки дрожжей, находящиеся в стационарной фазе роста. Внешний вид дрожжей представлен на рисунке 7.Основными критериями для выбора биообъекта стали: высокая скорость размножения, размер дрожжей и доступность.Рисунок 7 - Винные дрожжи под микроскопом МБИ - 15 Биологические объекты содержались в питательной среде состава: 4% сахара, 96% дистиллированной воды. Разведение суспензии и дальнейшее выдерживание дрожжевых клеток в питательной среде осуществлялось при температуре 20⁰С. Дрожжи разводились 0,16 г на 80 мл питательной среды, начальная концентрация клеток составляла 108 клеток/мл. Начальную концентрацию определяли с помощью камеры Горяева и микроскопа МБИ-15. Источники ионизирующего излучения и условия облученияВ данной работе в качестве адаптирующего ИИ использовался радионуклидный источник 137Cs. При повторном воздействии ИИ, которое называется повреждающим, использовался поток электронов, полученных на линейном ускорителе. Радионуклидный источник 137CsВ работе использовали γ – излучения изотопа 137Cs с мощностью дозы 10-4 – 10-2 Гр/ч. Варьирование мощности дозы осуществляется изменением расстояния от источника. Энергия гамма-излучения радионуклида: 0,662 МэВ.137Cs извлекается методами соосаждения с гексацианоферратами железа, никеля, цинка или фторовольфраматом аммония из растворов, полученных при переработке отходов ядерных реакторов. 137Cs является дочерним продуктом распада нуклида 137Xe (Т ½ = 3,818 мин):, (6)137Cs претерпевает β—распад (Т ½ = 30,17 лет), в результате которого образуется стабильный изотоп бария137Ba:, (7)В 94,4% случаев распад происходит c промежуточным образованием ядерного изомера 137Bam (его период полураспада составляет 2,55 мин), который в свою очередь переходит в основное состояние с испусканием гамма-кванта с энергией 661,7 кэВ (или конверсионного электрона с энергией 661,7 кэВ, уменьшенной на величину энергии связи электрона). Схема распада 137Cs представлена на рисунке 8.899795289560001987550601979002646680765175γ 0,66 МэВ00γ 0,66 МэВ249808960198000139954022669594,6% 0,51 МэВ0094,6% 0,51 МэВ198691511690340020942302336800016510289559009740902901950055137Cs (30,17 лет)120713549847556137Ba0056137Ba272415908055,4% 1,17 МэВ005,4% 1,17 МэВРисунок 8 - Схема распада 137CsВ данной работе использовался лабораторный источник, который находится в свинцовой бочке (Рисунок 9). Облучение с помощью данного источника проводилось в лаборатории прикладной ядерной физики кафедры ЭФ ФТИ УрФУ.Рисунок 9 - Свинцовая бочка с 137CsЛинейный ускоритель электронов модели УЭЛР-10-10С2В настоящее время в Физико-технологическом институте УрФУ расположен инновационно-внедренческий центр радиационной стерилизации. В нем расположен линейный ускоритель электронов модели УЭЛР-10-10С2 «КОРАД» (Рисунок 10), который предназначен для использования в качестве источника электронов для радиационной стерилизации медицинских изделий, облучения продуктов питания, облучения заготовок термоусаживаемых изделий и других радиационно-технологических процессов. Параметры пучка ускоренных электронов линейного ускорителя УЭЛР – 10 - 10С2 представлены в таблице 2.Рисунок 10 - Установка Центра радиационной стерилизации УрФУ на базе кафедры ЭФ ФТИТаблица 2 - Параметры пучка ускоренных электронов линейного ускорителя УЭЛР – 10 - 10С2ПараметрЗначениеМаксимальная энергия ускоренных электронов, МэВ10Максимальный средний ток выведенного в атмосферупучка электронов, мА1Диапазон регулирования энергии электронов, МэВ8 – 10Частота следования импульсов электронного тока, 1/с50-240Максимальный размер поля облучения на расстоянии 100 мм от выпускной фольги, мм600 х 20Равномерность поля облучения по длине развертки на поверхности облучаемых коробок, %± 5Частота сканирования электронного пучка, Гц1-3На ускорителе образцы облучались дозами в пределах от 2 до 12 кГр. Для того чтобы получить желаемые дозы, на образцы выкладывалась защита из алюминия.Для определения поглощенной дозы и контроля облучения используются дозиметры на основе сополимера с 4-диэтиламиноазобензоловым красителем СО ПД(Э)–1/10 (Рисунок 11).Рисунок 11 - Пленочный дозиметр СО ПД(Э)–1/10Дозиметр СО ПД(Э)–1/10, относящийся к цветовым визуальным индикаторам дозы, предназначен для определения поглощенной дозы фотонного и электронного излучения в диапазоне доз 1-10 кГр. Он представляет собой полимерную пленку размером 10 х 35 мм. Данный дозиметр может использоваться в водном растворе, что позволяет производить дозиметрический контроль в пробирках типа эппендорфа с питательной средой.Определение поглощенной дозы после облучения осуществляется путем измерения оптической плотности облученной полимерной пленки на спектрофотометре на длине волны 512 нм.Методика анализа жизнеспособности клетокДля изучения биологического эффекта действия ионизирующего излучения определялось жизнеспособность клеток в клеточной культуре при помощи микроскопа МБИ-15 и камеры Горяева. Универсальный исследовательский биологический микроскоп МБИ-15 предназначается для визуального наблюдения и фотографирования объектов в проходящем и падающем свете (Рисунок 12). В состав каждого микроскопа входят наборы объективов, окуляров, фотоокуляров и принадлежностей. Микроскоп может применяться для исследований в области биологии, ботаники, зоологии, а также в других областях науки и техники.Рисунок 12- Микроскоп МБИ-15Счетные камеры используются для подсчета крупных объектов – дрожжей, одноклеточных водорослей, конидий грибов и некоторых относительно крупных бактерий (Рисунок 13). Состоит из толстого предметного стекла, имеющего прямоугольное углубление (камеру) с нанесенной микроскопической сеткой и тонкого покровного стекла. Камера разработана профессором Казанского университета Горяевым Н.К. Благодаря увеличенному объему сетки, отличается большей точностью подсчета, по сравнению с другими камерами.