Выявление мутаций в гене транстиретина (TTR) у больных с кардиомиопатиями

Работа выполнена согласно требований ГОСТ. Сдана на отлично. Уровень оригинальности текста на антиплагиат.ру составил 83 ...

Введение 6
1 Аналитический обзор 8
1.1 Транстиретин 8
1.1.1Строение и функции ТТR 8
1.1.2 Роль мутаций гена ТТR в образовании амилоидов 11
1.2 Амилоидоз 16
1.2.1 Представления об амилоидозах 16
1.2.2 Структура амилоида и фибрилл 20
1.2.3 Механизм образования амилоидных фибрилл 23
1.3 Общие сведения о кардиомиопатии 25
1.4 Методы выявления мутаций 27
2 Патентный поиск 33
3 Цель и задачи работы 35 4 Экспериментальная часть 36
4.1 Материалы исследования 36
4.1.1 Реактивы 36
4.1.2 Лабораторное оборудование 37
4.2 Методы исследования 39
4.2.1 Стандартные растворы 39
4.2.2 Выделение ДНК из замороженной крови 39
4.2.3 Электрофоретическое разделение ДНК
в агарозном геле 41
4.2.4 Выделение и очистка амплификатов
из агарозного геля 42
4.2.5 Полимеразная цепная реакция 42
4.2.6 Электрофоретическое разделение продуктов
амплификации в 8% полиакриламидном геле (ПААГ) 43
4.2.7 Окрашивание гелей 44
4.2.7.1 Окрашивание бромистым этидием 44
4.2.7.2 Окрашивание ПААГ нитратом серебра 44
4.2.8 Анализ конформационного полиморфизма
одноцепочечной ДНК (SSCP) 45
4.2.9 Анализ полиморфизма длин
рестрикционных фрагментов 46
5 Результаты и обсуждение 47
5.1 Результаты 47
5.2 Обсуждение полученных результатов 57
6 Выводы 59
Список использованных источников 60
Приложение А. Охрана труда и окружающей среды 67
Приложение Б. Оценка технико-экономических
результатов исследования 79

В последнее время большой интерес представляют так называемые «конформационные» заболевания, при которых происходят изменения пространственной организации белковых молекул. К этим заболеваниям, в первую очередь, относятся амилоидозы. В основе амилоидозов лежит способность некоторых белков формировать особые надмолекулярные агрегаты - фибриллы. Накапливаясь в различных тканях и органах, белковые фибриллы приводят к образованию амилоидных отложений [1].
К амилоидозам относятся болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона, кардиомиопатии, старческие системные амилоидозы и многие другие. В настоящее время известно около 30 белков человека, которые вызывают амилоидозы.
Кардиомиопатия – это достаточно распространенное тяжелое заболевание, при котором поражается миокард. Существуют разные причины разв ития этой болезни, одной из них является амилоидоз. Формирование амилоидных отложений происходит во внеклеточном матриксе и около малых сосудов, расположенных в толще миокарда [2].
Транстиретин является одним из амилоидогенных белков, фибриллы которых можно обнаружить при кардиомиопатиях, полинейропатиях и системных амилоидозах. Уже найдено около 100 мутаций гена этого белка в различных странах [3].
Исследуя спектр мутаций гена TTR, в дальнейшем можно разработать методы быстрого выявления наиболее распространенных в данном регионе мутаций. Подобные исследования осуществлялись в Португалии, Японии, Швеции и других странах, однако, в России такие исследования практически не проводились.
В настоящее время эффективных способов лечения транстиретиновых амилоидозов не существует, как и не существует быстрых методов диагностики.
Выявление мутаций можно проводить, используя стандартные методики: анализ конформационного полиморфизма одноцепочечной ДНК (SSCP-анализ) и анализ полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (ПДРФ-анализ).
Результаты поиска мутаций в гене транстиретина у больных с кардиомиопатиями могут быть использованы для создания методов точной и ранней диагностики этого заболевания.
Исследование причин фибриллогенеза является перспективной задачей, так как изучение этих причин позволит разработать безопасные для человека пути ингибирования амилоидогенеза, а также способы профилактики и лечения этих заболеваний. Поиск мутаций в гене TTR даст возможность выявить наиболее распространенные в данном регионе мутации, и определить риск развития заболевания у родственников пациентов, носителей мутации.

628Richard LabaudiniereCompounds, compositions and methods for stabilizing transthyretin and inhibiting transthyretin misfolding20.12.20052006CШАA61K38/0011/471.657Ehud Gazit, Ramat-HaSharonPeptides directed for diagnosis and treatment of amyloid-associated disease19.10.2006Продолжение таблицы 3ГодСтранаИндекс МПК№ заявки (а.с. патента)Патенто-владелецНазвание изобретенияДата публикации2007CШАC07C243/22;C07C229/00;C07C251/3211/350.664Kelly Jeffery W; Johnson Steven M; Petrassi H. MichaelInhibitors of transthyretin amyloid fibril formation25.12.20072008CШАA61K 36/0012/51,716Gerardo M. Castillo, Alan D. SnowComposition and methods for treating alzheimer's disease and other amyloidoses28.08.2008Цель и задачи работыЦелью дипломной работы является выявление и характеристика мутации в гене транстиретина у больных с кардиомиопатиями жителей Санкт-Петербурга.Для достижения поставленной цели было необходимо выполнить следующие задачи:Провести выделение ДНК из лейкоцитов замороженной периферической крови больных с кардиомиопатиями, используя метод Кюнкеля.С помощью полимеразной цепной реакции (с уже подобранными парами праймеров) получить специфические ПЦР-продукты каждого из четырех экзонов гена транстиретина у каждого больного.Провести SSCP-анализ экзонов гена транстиретина у каждого больного.Методом ПДРФ и автоматического секвенирования провести полную идентификацию (установление полной нуклеотидной последовательности) выявленных изменений и характеризовать мутации в случае положительных результатов.Экспериментальная частьМатериалы исследования4.1.1 РеактивыВ ходе работы были использованы следующие реактивы:Реактивы для электрофореза: акриламид (98,5%), персульфат аммония (98,5%), TEMED (99,0%), агароза (99,0%) («Serva»);Соли, кислоты и основания: NaOH, NaCl (99,0%), KCl (ХЧ), H3BO3 (ХЧ), CaCl2, AgNO3, SDS (99,5%), ЭДТА (>99,0%), Na2CO3, Na2S2O3 («Merck»); Органические реактивы и соли: HCOOH, формалин, глицерин (>99,9%), этанол, метанол, изопропанол, фенол, хлороформ, CH3COOH (ХЧ), PEG-6000, бромистый этидий (98,5%) («ВЕКТОН»); Tris (>99,8%), Triton-X100 (99,0%), 8-оксихинолин, глюкоза, ксиленцианол (99,9%), бромфенол (99,9%), глицин (>99,0%) («Amresco»);Реагенты для полимеразной цепной реакции («Fermentas»);Наборы для рестрикции («SibEnzime»);Наборы для очистки ДНК («Promega»).Праймеры для получения ПЦР-продуктов каждого из четырех экзонов были подобраны с помощью программы «Oligos» и синтезированы «ЗАО Синтол» (Москва). Использованные в работе праймеры:Экзон 1: праймер 1 – 5'-CACAGAAGTCCACTCATTCTTGGCGGG-3', праймер 2 – 5'-CGTGAATCTTAAATGTAGGAATGGGATGTC-3', размер продукта 139 п.н.;Экзон2: праймер 1 – 5'-CGTGTCTTCTCTACACCCAGGGCACCG-3',праймер 2 – 5'-CTGTGGGAGGGTTCTTTGGCAACTTACG-3', размер продукта 178 п.н.;Экзон3: праймер 1 – 5'-TAACTTAATCCAGACTTTCACACCTTAT-3',праймер 2 – 5'-CCAAAACCAAAACAACCCTCGAAGGTC-3', размер продукта 203 п.н.;Экзон4: праймер 1 – 5'-GAAATGGATCTGTCTGTCTT-3',праймер 2 – 5'-GTGCCTTTCACAGGAATTCTTT-3', размер продукта 284 п.н.4.1.2 Лабораторное оборудованиеДля проведения всех необходимых исследований понадобилось следующее оборудование:Амплификатор «Терцик» («ДНК-технология»);Холодильник лабораторный LRM 630 («Dairei») c температурными пределами -5…+12 °С; Морозильник LF300-ST («Dairei») с температурными пределами -10…-25 °С;Центрифуга «Minispin» («Eppendorf») для пробирок объемом 1,5 мл;Миницентрифуга-вортекс «Microspin» FV 2400 («BioSan»);Шейкер Mini Shaker PSU 2T («BioSan»);Инкубатор с воздушной рубашкой МСО-15АС («Sanyo»);Трансиллюминатор (Vilber Lourmat);Весы Discovery («Ohaus»), 110/0,1 мг;Весы Adventurer Pro («Ohaus»), 810/0,01 г;Программируемый источник питания Эльф-4 («Helicon»);Аппарат для горизонтального электрофореза («Helicon»);Камера для вертикального электрофореза VE-10 («Helicon»);Набор автоматических дозаторов переменного объема 2-20 мкл, 20-200 мкл, 100-1000 мкл, 1000-5000 мкл («LabMate»);Одноразовые наконечники для дозаторов, микропробирки объемом 0,5 и 1,5 мл («Ленпипет», «Axigen»);Штативы для наконечников, микропробирок («Ленпипет»);Лента лабораторная «Parfilm M».4.2 Методы исследования4.2.1 Стандартные растворыДля работы потребовалось приготовление некоторых стандартных растворов:Приготовление 1 л раствора 10×ТВЕ:- 108 г Tris;- 55 г Н3ВО3;- 7,5 г ЭДТА.2) Приготовление 1 М TrisHCl pH=8.0:- 121,1г Tris;- 42 мл 6н HCl.4.2.2 Выделение ДНК из замороженной кровиДля выделения ДНК из лейкоцитов замороженной периферической крови использовали метод Кюнкеля [53]. Для этого потребовались: Раствор I 0.32 М Сахароза 10мМ Трис-НСl pH 7.5 5мМ MgCl2 1% Тритон Х-100Раствор II0.075М NaCl 0.024М ЭДТА pH 8.01×ТЕ-буфер 10мМ Трис-HCl pH 8.0 0.5мМ ЭДТАФенол, хлороформ, 10% SDS, протеиназа КВыделение проводится в течение двух дней.День 1: все процедуры делаются на льду, центрифугируем при 4◦СК 0,5 мл крови добавить 1 мл холодного раствора I, перемешиваем переворачиванием.Центрифугировать 5000грт, 10 минут при 4◦С.Слить надосадочную жидкость, и, не переворачивая, поставить на фильтровальную бумагу и дать стечь (около 1 минуты).К осадку добавить 0,5 мл раствора I и ресуспендировать носиком.Центрифугировать 5000грт, 10 минут при 4◦С.Повторить п.3-5 несколько раз до получения белого осадка (возможно розоватого) ≈ 2-3 раза.Слить надосадочную жидкость, дать стечь.Добавить 0,465 мл раствора II, 0,025 мл 10% SDS, 0,01 мл протеиназы К и ресуспендировать осадок.Инкубировать ночь, +37◦С в термостатеДень2Добавить 0,5 мл фенола, перемешать аккуратным переворачиванием 5 минут.Добавить 0,5 мл хлороформа, аналогично перемешать.Центрифугировать 6000грт, 10 минут при комнатной t◦.Отобрать верхнюю водную фазу в другой эппендорф.Добавить 0,5 мл хлороформа, перемешать 5 минут.Центрифугировать 6000грт, 10 минут при комнатной t◦.Отобрать верхнюю водную фазу в другой эппендорф, считая объем.Добавить 2,5 объема 96% этилового спирта.Ставим на полчаса в - 20◦С.Центрифугировать 13000грт, 10 минут при комнатной t◦.Слить спирт.Добавить 0,5 мл 70% этилового спирта, дать постоять 5 минут.Центрифугировать 13000грт, 10 минут при комнатной t◦.Аккуратно слить спирт, остатки отобрать пипеткой, стенки промокнуть фильтровальной бумагой. Дать высохнуть при комнатной температуре.Добавить 0,2 мл 1×ТЕ-буфер.Полученную смесь оставляли на 1 сутки при комнатной температуре для растворения ДНК. Качество полученного образца ДНК определяли визуально при проведении электрофореза в агарозном геле.4.2.3 Электрофоретическое разделение ДНК в агарозном гелеЭлектрофорез проводили в горизонтальных блоках 0.8% агарозного геля в аппарате для горизонтального электрофореза.Состав геля: 0.8% агароза 0.5х ТВЕ буфер 1 мкг/мл этидиум бромид Электродный буфер: 0.5х буфер ТВЕ 10х буфер ТВЕ: 890 мМ Tris 890 мМ борная кислота (pH 8.0) 20М EDTA Для приготовления геля смесь компонентов прогревали до полного растворения агарозы, после чего охлаждали до 60°С, добавляли бромид этидия до концентрации 0.5 мг/мл и заливали на горизонтальную платформу размером 80x110мм. Толщина геля составляла 5 мм. Электрофорез проводили при постоянном токе 30 мА. Контроль миграции ДНК осуществляли по флуоресценции комплексов с бромистым этидием при возбуждении флуоресценции с использованием трансиллюминатора. 4.2.4 Выделение и очистка амплификатов из агарозного геляОчистку амплификатов проводили по стандартной методике с помощью наборов фирмы «Promega» (Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System, США).4.2.5 Полимеразная цепная реакцияПолимеразная цепная реакция (ПЦР) [51] проводилась в реакционной смеси конечным объемом 30 мкл на 1 пробу.Состав реакционной смеси: праймеры (прямой и обратный) 10 мкМпо 0,2 мкл10×буфер для Taq-полимеразы 3 мкл dNTP (dATP,dTTP,dGTP,dCTP) 10 мМ0,6 мкл MgCl2100 мМ0,6 мкл Taq-полимераза 0,5 мкл ПЦР проводилась в пробирках объемом 0.6 мл на аппарате «Терцик» (Россия) с набором программ, определяющих температурный режим ПЦР. Температурный профиль ПЦР:5 минут95°С1 цикл1 минута95°С (денатурация)30 циклов1 минута55-58°С (отжиг)1 минута72°С (достройка)10 минут72°С (достройка)1 циклТемпература отжига для каждого экзона своя:экзон - 58°С;2экзон - 56°С;экзон - 56°С;экзон - 55°С.4.2.6 Электрофоретическое разделение продуктов амплификации в 8% полиакриламидном геле (ПААГ)Для оценки количества и специфичности продуктов амплификации ДНК проводили электрофоретическое разделение этих продуктов в вертикальных пластинах полиакриламидного геля (80х100х2мм). При электрофорезе ДНК в ПААГ в неденатурирующих условиях происходит разделение молекул в зависимости от их размера.Состав геля: 30% акриламид 1Х буфер ТВЕ 0.1% персульфат аммония 0.08% TEMED Буфер для образцов: 8% глицерин 0.025% ксиленцианол 0.025% бромфеноловый синий Электродный буфер: 1Х буфер ТВЕ 1х буфер ТВЕ: 89 мМ Трис 89 мМ борная кислота (pH 8.0) 2 мМ EDTA Электрофорез проводили при постоянном токе 30 мА.4.2.7 Окрашивание гелей4.2.7.1 Окрашивание бромистым этидиемГель помещали в кювету с водой. Добавляли раствор бромистого этидия до конечной концентрации 0.5 мкг/мл. Окрашивали гель при покачивании в течение 10 минут. Для удаления бромистого этидия, не вступившего в реакцию с ДНК, несколько раз промывали гель водой. Оценивали электрофоретическую подвижность ДНК визуально по интенсивности свечения в проходящем ультрафиолетовом излучении. 4.2.7.2 Окрашивание ПААГ нитратом серебраРаствор I: 0,1% раствор нитрата серебра (AgNO3). Раствор II (проявляющий): на 100 миллилитров -карбоната натрия (Na2CO3) 3г;-раствора формальдегида 37% 400 мкл; -раствора тиосульфата натрия (Na2S2O3) 1% 40 мкл; -вода до 100 мл.Проявляющий раствор II готовили непосредственно перед использованием.Раствор III: 10%-ая уксусная кислота.Гель фиксировали в растворе III при постоянном покачивании 20 минут. Промывали гель водой при постоянном покачивании 2 раза по 2 минуты. Выдерживали гель в растворе нитрата серебра при постоянном покачивании 30 минут. Промывали гель водой в течение 20 секунд. Проявляли гель в растворе II до нужной степени окраски. Фиксировали окрашивание раствором III. 4.2.8 Анализ конформационного полиморфизма одноцепочечной ДНК (SSCP) Реагенты: общий объем 12 мл9% гель12% гель36% АА 3 мл4 мл3×Т-F4 мл4 млPEG(6000) 60 мг60 мгPSA 0,12 мл0,12 млTEMED0,01 мл0,01 млH2O 4,87 мл3,87 млСостав буфера: 1×Т-F буфер:60 мМ HCOOH1 М Tris рН 9,01×T-Gly буфер:25 мМ Tris рН 8,3250 мМ глицинПриготовление:Смешать амплификат с формамидом в соотношении 1:5.Прогреть на кипящей водяной бане 3 минуты.Поставить на лед на 15-30 минут.Нанести на гель.Установить стекла на прибор, залить буфер. В крайние дорожки залить формамид, в самую последнюю залить краску – кселен-цианол. Нанести пробы (весь объем, который смешали). Прибор заполнить Tr-Gly буфером, установить напряжение 210 В (снижать по мере нагревания стекла). Полученный гель окрашивать с помощью нитрата серебра.4.2.9 Анализ полиморфизма длин рестрикционных фрагментовАнализ ДНК проводили при помощи эндонуклеаз рестрикции («SibEnzime», Новосибирск) по стандартной методике в соответствии инструкции производителя. Реакционная смесь имела конечный объем 20 мкл. В состав смеси входили следующие реактивы:- эндонуклеаза рестрикции в количестве, необходимом для гидролиза заданного количества ДНК;- 10×буфер.Рестрикцию проводили при температуре, оптимальной для данной эндонуклеазной рестрикции.Результаты и обсуждение5.1 РезультатыВ Отделе молекулярной генетики НИИЭМ СЗО РАМН совместно с лабораторией кардиомиопатий ИССЗ СПбГМУ им. акад. И.П. Павлова ранее проводилось комплексное исследование, направленное на изучение механизмов фибриллогенеза транстиретина. Одним из аспектов исследования являлось исследование гена ТТR у больных кардиомиопатиями [54]. В этом исследовании были обследованы 270 образцов, и найдены изменения в гене только у трех пациентов. В ходе написания данной дипломной работы был использован материал, которым являлась коллекция геномной ДНК, полученная из крови больных с кардиомиопатиями разного генеза (гипертрофической, дилатационной, рестриктивной). Были исследованы ДНК 60 пациентов из числа жителей Санкт-Петербурга. Биоматериал также был предоставлен лабораторией кардиомиопатий ИССЗ СПбГМУ им. акад. И.П. Павлова.Включение в исследование пациентов происходило при наличии данных морфологического и инструментального обследования и клиническим симптомам, соответствующим кардиомиопатиям различного рода [55]. Возраст пациентов – от 18 до 80 лет. У всех больных была выявлена хроническая сердечная недостаточность II – IV функционального класса NYHA (New York Heart Association), диастолическая дисфункция левого и/или правого желудочков сердца. У всех пациентов при окрашивании гистологических препаратов миокарда и/или слизистой щеки Конго красным была положительная реакция. Было получено согласие больных для изучения геномной ДНК с целью поиска мутаций в гене транстиретина.В процессе работы было выделено ДНК из крови пациентов по стандартной методике (методом Кюнкеля) [53]. Таким образом, было получено 60 образцов. В дальнейшем все образцы были проверены на качество выделения и концентрацию с помощью электрофореза в 0,8% агарозном геле.ПЦР-продукты каждого из четырех экзонов гена транстиретина были получены с помощью метода полимеразной цепной реакции (ПЦР). Для этого были подобраны соответствующие пары праймеров для всех четырех экзонов гена TTR. Для улучшения выхода амплификата были отработаны условия и подобраны оптимальные температуры отжига для праймеров: 1 экзон - 58°С, 2 экзон - 56°С, 3 экзон - 56°С, 4 экзон - 55°С. Была проведена амплификация ДНК всех 60 пациентов с праймерами для 1, 2, 3 и 4 экзонов.С помощью электрофореза в 8%-ном полиакриламидном геле (ПААГ) в однократном ТВЕ-буфере была проведена проверка специфичности реакции и количества продуктов амплификации. Размер фрагмента оценивали с помощью маркера молекулярного веса от 100 до 1000 с шагом 100 пар нуклеотидов фирмы «Медиген» (Новосибирск, Россия). Все ПЦР-продукты соответствуют своим размерам, это можно увидеть на рисунках 6-9.100 п.н.200 п.н.139 п.н. 1 2 3 4 51-4 – образцы ДНК исследуемых пациентов; 5 – маркер молекулярного веса от 100 до 1000 с шагом 100 пар нуклеотидовРисунок 6 - Электрофореграмма продуктов амплификации участка экзона 1 гена TTR в 8% ПААГ 1 2 3 4 5178 п.н.200 п.н.1 – маркер молекулярного веса от 100 до 1000 с шагом 100 пар нуклеотидов; 2-5 – образцы ДНК исследуемых пациентовРисунок 7 - Электрофореграмма продуктов амплификации участка экзона 2 гена TTR в 8% ПААГ12 3203 п.н.300 п.н.200 п.н.1 – маркер молекулярного веса от 100 до 1000 с шагом 100 пар нуклеотидов; 2-3 – образцы ДНК исследуемых пациентовРисунок 8 - Электрофореграмма продуктов амплификации участка экзона 3 гена TTR в 8% ПААГ1 2 3200 п.н.300 п.н.284 п.н.1-2 – образцы ДНК исследуемых пациентов; 3 – маркер молекулярного веса от 100 до 1000 с шагом 100 пар нуклеотидовРисунок 9 - Электрофореграмма продуктов амплификации участка экзона 4 гена TTR в 8% ПААГПоиск мутаций проводили с помощью анализа конформационного полиморфизма однонитевых фрагментов ДНК (SSCP-анализ), суть которого заключается в регистрации различий в электрофоретической подвижности однонитевых фрагментов ДНК, одинаковых по протяженности, но отличающихся по пространственной структуре молекул вследствие нуклеотидных замен.Для лучшего разделения однонитевых конформеров ДНК при SSCP-анализе использовали трис-глициновый буфер и полиакриламидные гели (ПААГ) разной концентрации. Так, для 1 и 2 экзона использовался 12%-ный ПААГ, а для 3 и 4 экзонов – 9%-ный ПААГ. Окрашивание образцов ДНК после проведения электрофореза в ПААГ осуществляли раствором нитрата серебра. Результаты SSCP-анализа на рисунках 10-12. 1 2 3 41-4 – образцы ДНК пациентов без мутацийРисунок 10 – Электрофореграмма SSCP-анализа продуктов амплификации 1экзона гена TTR в 12% ПААГ1 2 3 41-4 – образцы ДНК пациентов без мутацийРисунок 11 – Электрофореграмма SSCP-анализа продуктов амплификации 3экзона гена TTR в 9% ПААГ1 2 3 41-4 – образцы ДНК пациентов без мутацийРисунок 12 – Электрофореграмма SSCP-анализа продуктов амплификации 4 экзона гена TTR в 9% ПААГНа электрофореграмме SSCP-анализа продуктов амплификации 2 экзона гена ТТR видны дополнительные зоны однонитевых конформеров ДНК. Их можно заметить на дорожке 1 – это образец ДНК пациента №84, несущий ранее идентифицированную в нашей лаборатории мутацию V30M [54], и на дорожке 3 – образец ДНК исследуемого пациента №37 с найденной мутацией (рисунок 13). Электрофоретическая подвижность однонитевых конформеров ДНК на этих дорожках изменяется одинаковым образом, что, вероятнее всего, свидетельствует о наличии одной и той же мутации у обоих пациентов.1-3 – образцы ДНК пациентов с мутацией; 2-4 – образцы ДНК пациентов без мутацийРисунок 13 – Электрофореграмма SSCP-анализа продуктов амплификации 2 экзона гена TTR в 12% ПААГДля подтверждения наличия мутации V30M у пациента №37 был проведен анализ полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (ПДРФ-анализ). Если найденная мутация аналогична ранее выявленной (мутация с.1679G>A), то она должна приводить к замене кодона GTG, кодирующего валин (Val) в 30 положении аминокислотной последовательности транстиретина, на кодон ATG, кодирующий метионин (Met).Подбор эндонуклеаз рестрикции проводили с помощью компъютерных программ Primer Primier 5 и BioEdit v.7.0.1. Была выбрана эндонуклеазой рестрикции MscI. При обработке продукта амплификации 2 экзона гена TTR с канонической последовательностью длиной 178 п.н. эндонуклеазой рестрикции MscI ферментативного гидролиза не происходит. Замена нуклеотида G на A в положении 1679 приводит к появлению сайта для MscI, и образованию двух фрагментов длиной 96 п.н. и 82 п.н. (рисунок 14). Рисунок 14 – Схема ферментативного гидролиза канонической последовательности 2 экзона гена TTR и последовательности с мутацией V30M эндонуклеазой рестрикции MscI.Таким образом, наличие фрагментов длиной 178 п.н., 96 п.н. и 82 п.н. на дорожках 3 и 4 на рисунке 15 говорит о том, что ферментативный гидролиз прошел, что в свою очередь свидетельствует о наличии мутации V30M в гетерозиготном состоянии в последовательности ДНК пациентов №84 и №37.1 – образец ДНК пациента, не обработанного эндонуклеазой рестрикции MscI, 2 – маркер молекулярного веса с шагом 100 п.н.; 3,4 – образцы ДНК пациентов с мутацией V30M в гетерозиготном состоянии; 5 - образец ДНК пациента без мутацииРисунок 15 – Детекция мутации V30M (с.1679G>A) в гене TTR с помощью эндонуклеазы рестрикции MscIЧтобы с уверенностью говорить, что найдена нами мутация во 2 экзоне гена транстиретина соответствует мутации V30M, необходимо было установить нуклеотидную последовательность 2 экзона с помощью автоматического секвенирования по Сэнгеру. Для этого была подготовлена и очищена проба, содержащая продукт амплификации ДНК пациента №37. Данная процедура проводилась в фирме «Евроген» (Москва, www.evrogen.ru). T G G C C G/A T G C A TРисунок 16 – Графические данные автоматического секвенирования последовательности 2 экзона гена TTR, содержащей мутацию с.1679G>A в гетерозиготном состоянии. Секвенирование выявило замену с.1679G>A в гетерозиготном состоянии (рисунок 16). Как и подтвердилось, мутация приводит к замене кодона GTG, кодирующего валин в 30-ом положении аминокислотной последовательности транстиретина, на кодон ATG, кодирующий метионин.5.2 Обсуждение полученных результатовВ ходе дипломной работы удалось обнаружить мутацию только у одного из 60 обследованных пациентов. Эта мутация (с.1679G>A), приводящая к замене V30M в аминокислотной последовательности TTR, обнаружена во втором экзоне гена транстиретина в гетерозиготном состоянии и является самой распространенной и хорошо изученной в мире. Такая замена была идентифицирована во многих популяциях Португалии, Японии и Швеции (тип Андрадэ) [56], также США, Британии и Греции.