Биологический метод контроля качества противотуберкулезных препаратов I группы

Заключение

Проблемы антимикробной терапии больных туберкулезом и микобактериозом в последние годы привлекает особое внимание клиницистов. В первую очередь это связано со значительным ростом численности резистентных и мультирезистентных штаммов микобактерий, а также с распространением эпидемии ВИЧ-инфекции в нашей стране. Результаты современных исследований наглядно демонстрируют постоянное уменьшение количества чувствительных и монорезистентных штаммов микобактерий и, наоборот, рост доли штаммов микобактерий, которые нечувствительны к трем или более антимикобактериальных препаратам.
Одной из основных ведущих причин неэффективности терапии туберкулеза является увеличение частоты множественнорезистентных М. tuberculosis, т. е. устойчивых минимум к изониазиду и рифампицину.
Следовательно, эф ...

Оглавление
Введение 2
Глава 1 Теоретические аспекты применения биологического метода контроля качества противотуберкулезных препаратов 5
1.1 Особенности использования биологических методов контроля качества лекарственных веществ 5
1.2 Значение биологических методов при определении антимикробной активности антибиотиков 13
1.3 Эпидемиология, диагностика, лечение туберкулеза. 17
1.4 Методы контроля качества препаратов, применяемых при лечении туберкулеза в соответствии с требованиями нормативной документации 27
Выводы по главе 35
Глава 2. Исследование эффективности использования биологического метода контроля качества противотуберкулезных препаратов I группы 36
2.1. Контроль качества препаратов (изониазида и рифампицина) как объектов фармакопейного анализа 36
2.1.1 Тонкослойная хроматография38
2.1.2 Уф-спектрофотометрический анализ препаратов рифампицина 41
2.1.3. Тест «растворение» 44
2.2 Методика биологического контроля качества противотуберкулезных препаратов I группы 50
2.3 Результаты использования рекомендуемой методики 53
Заключение 54
Список литературы 55

Введение

На современном этапе развития человеческой цивилизации инфекционные заболевания являются проблемой, касающейся не только здоровья и жизни граждан. Они непосредственно влияют на социально - экономическую ситуацию в стране, их последствия становятся все более значимыми для благополучия государства и всего человечества в целом.
Туберкулез сегодня является одной из самых актуальных медико-социальных проблем не только в нашей стране, но и во всем мире.
Переход тысячелетий охарактеризовался распространением эпидемии туберкулеза в нашей стране и во многих других, что заставило ВОЗ объявить в апреле 1993 туберкулез глобальной опасностью.
Туберкулез - это особо опасная инфекционная болезнь, вызываемая микробактериями туберкулеза, что протекает с периодическими обострениями, рецидивами и р емиссиями, поражает преимущественно беднейшие слои населения и лица, утратившие социальные связи, и требует длительного комплексного лечения и реабилитации больных.
В течение последнего десятилетия во всем мире резко ухудшилась эпидемиологическая ситуация по туберкулезу. Все чаще наблюдаются остропрогресирующие, труднопротекающие, а порой и неизлечимые формы туберкулеза.
Изучение актуальных вопросов туберкулеза органов дыхания проводят во многих институтах многочисленные ученые, которые соглашаются с выводом: актуальность проблемы детерминирована аспектами этиопатогенеза, иммунитета и аллергии, патоморфоза современного туберкулеза. В современной научной литературе по избранной теме изложены критерии активности туберкулезного процесса, особенности диагностики, течение и лечение основных форм туберкулеза.
Эффективность и качество анализа лекарственных средств непосредственно связаны с использованием современных физико-химических и биологических методов исследования которые обеспечивают высокую чувствительность и специфичность анализа.
Основным методом лечения ТБ является химиотерапия, направленная на уничтожение микобактерий туберкулеза (МБТ). Химиопрепараты, применяемые на разных этапах лечения, имеют характерные для каждого из них механизмы действия. Большинство противотуберкулезных препаратов (ПТП) производит разнообразное действие на микробную клетку, чем обуславливаются их бактериостатический и бактерицидный эффекты. Комбинированная химиотерапия ПТП позволяет предотвратить или существенно задержать появление лекарственно-устойчивых штаммов МБТ. Однако нельзя исключать состояние иммунитета организма, что играет существенную роль в манифестации туберкулеза.
В последнее время эффективность антибактериальной и симптоматической терапии туберкулеза значительно уменьшилась. Выросла частота диссеминированных процессов, стали чаще встречаться случаи (72,3%) прогрессирующего течения с острым началом и массивным бактериовыделением, резко увеличилось (до 50%) число больных с первичной устойчивостью к МБТ. Устойчивость к двум препаратам - изониазиду и рифампицину - отмечена в 12% случаев, к трем - более чем в 67,8% случаев.
Кроме резистентности микобактерий туберкулеза к ПТП, малая эффективность химиотерапии связана с применением нерациональных лекарственных форм антибактериальных средств, которые не могут создать их высокую терапевтическую концентрацию на длительное время в организме больного.
Важным фактором, влияющим на эффективность терапии при туберкулезе, является наличие у больных тех или иных дефектов иммунной системы. Для рационального применения ПТП необходимо учитывать их воздействие на неспецифическую резистентность и иммунитет. В связи с этим большое значение приобретает оценка иммуномодклирующего эффекта препаратов, применяемых для химиотерапии туберкулеза при назначении их больным с различными иммунодефицитными состояниями. Однако в литературе практически нет данных о взаимовлиянии ПТП и показателей иммунитета.
Целью исследования является исследование эффективности биологических методов анализа однокомпонентных и многокомпонентных противотуберкулёзных лекарственных средств.
Для достижения указанной цели необходимо было решить следующие задачи:
- осуществить выбор оптимальных условий определения качества исследуемых лекарственных веществ;
- определить методы контроля качества препаратов, применяемых при лечении туберкулеза в соответствии с требованиями нормативной документации
- провести исследование эффективности использования биологического метода контроля качества противотуберкулезных препаратов I группы.
Объект исследования. Активность противотуберкулезных препаратов.
Предмет исследования. Противотуберкулезные препараты первого ряда: рифампицин, изониазид.
Методы исследования. При выполнении работы были использованы результаты исследования активности противотуберкулезных препаратов, а также методы математической статистики.

Капреомицин
1,0
1,0
«Амоксиклав»
1,2
1,2
Ципрофлоксацин
1,0-1,25
1,5
Офлоксацин,норфлоксацин
0,6-0,8
0,8-1,0
Кларитромицин
0,5-1,0
0,75-1,0
Азитромицин
0,25-0,50
0.5‰

Больных туберкулезом в процессе лечения разделяют на четыре категории29. К первой категории относятся впервые выявленные больные с бактериальным туберкулезом легких и впервые обнаружены больные с тяжелыми формами туберкулеза. Ко второй категории относят больных с реактивацией (обострения, рецидивы). Третью категорию составляют больные, у которых впервые обнаружен бактерионегативный туберкулез легких с ограниченным поражением паренхимы легких. Остальные больные (IV категория) имеют хронический туберкулез легких. Для каждой категории пациентов предложено свою схему лечения30.
Профилактика. Профилактика всегда была составной частью противотуберкулезной работы. Профилактическая работа предусматривает проведение вакцинации, ревакцинации детей, подростков, лиц до 30 лет, осуществления санитарных мер по изоляции больных заразными формами туберкулеза31.
Суперинфекция опасна тем, что в условиях контакта заболеваемость туберкулезом в 3-4 раза выше по сравнению с лицами, у котороых прямого общения с больным нет. В очагах туберкулезной инфекции нужно проводить химиопро-профилактику для оздоровления очага, изоляцию больного, лиц, контактирующих с бактериовыделителем32.
Основой для выбора антибактериальных препаратов, подлежащих включению в исследование, являются данные о естественной устойчивость или чувствительность отдельных микроорганизмов или их групп, о распространении среди них приобретенной резистентности, а также о клинической эффективности антибиотиков.
В исследование не целесообразно включать антибактериальные препараты, обладающие природной активностью в отношении выделенных микроорганизмов и клинически подтвержденной эффективностью при соответствующих инфекциях.
Для значительной части клинически значимых микроорганизмов рациональный выбор препаратов, подлежащих включению в исследование, можно осуществить на основании предварительной групповой идентификации до уровня семьи или рода.
Кроме спектра микробиологической активности препаратов, необходимо учитывать фармакокинетические, токсикологические и экономические параметры, а также особенности тактики терапии в конкретном заведении. Необходимо учитывать также локализацию и тяжесть инфекции, например, при тяжелых и крайне тяжелых генерализованных инфекциях нецелесообразно изучать устойчивость к перорально ных антибактериальных препаратов, препаратов узкого спектра действия, бакте- риостатикамы.
Целесообразно формировать несколько наборов антибактериальных препаратов для определения резистограмм: наборы для оценки антибиотикорезистентности с целью оптимизации индивидуальной терапии и наборы для проведения микробиологического мониторинга, к которым следует включать максимально возможное количество препаратов33.
По оценкам ВОЗ, почти полмиллиона случаев заболевания туберкулезом с множественной лекарственной устойчивостью возникает ежегодно во всем мире в результате несоответствующего применения режимов лечения, дефицита или низкого качества противотуберкулезных препаратов и передачи лекарственно-устойчивых штаммов. Наиболее высокий уровень распространенности туберкулеза с множественной лекарственной устойчивостью, — заболевания, гораздо более сложного и дорогостоящего в лечении, чем формы туберкулеза, реагирую­щие на обычные лекарства, — составляет 28,3% среди новых и 61,6% среди ранее леченых случаев заболеваний туберкулезом. Была высказана гипотеза, что одним из наиболее важных факторов в возрождении этой патологии и значительном росте распространенности туберкулеза с множественной лекарственной устойчивостью в странах бывшего СССР стал общественно-экономический кризис, последовавший за распадом Советского Союза в 1991 г. В результате этого кризиса возникали перебои с лекарственным снабжением и ухудшилась ситуация в секторе здравоохранения. Это оказало влияние на передачу туберкулеза и повышение восприимчивости к нему с образованием форм возбудителя, устойчивых к фармакотерапии.
В этот период регулирующие механизмы пребывали в переходном периоде, и качество закупаемых лекарств регулировалось в недостаточной степени. Во многих странах развитие устойчивости к лекарствам также могло быть обусловлено отсутствием стандартизированных режимов лечения. Научные исследования в отношении факторов, способствовавших возникновению лекарственной устойчивости в данном регионе, а также в отношении выявленных региональных и национальных различий между ее показателями, проводились в недостаточном объеме. В частности, мало внимания было уделено масштабам обращения некондиционных, поддельных, ложно маркированных, фальсифицированных, контрафактных противотуберкулезных препаратов на региональном рынке.
В 1950–1989 гг. в Советском Союзе и странах Восточной Европы учетные данные по туберкулезу сократились в 10-кратном размере для городов и 3-кратном для сельской местности. Однако за десятилетие 1990–2000 гг. учетные данные по туберкулезу в постсоветских странах более чем удвоились (чему способствовали ухудшение работы служб по борьбе с туберкулезом и дальнейший социально-­экономический спад). После 2000 г. показатели несколько стабилизировались, хотя по сравнению со странами Западной Европы, где оценочные показатели новых случаев туберкулеза не превышают 25 на 100 тыс. населения, во всех странах бывшего СССР (за исключением Беларуси и государств Балтии) выявлен высокий уровень заболеваемости — от 100 до 299 случаев на 100 тыс. населения.
1.4 Методы контроля качества препаратов, применяемых при лечении туберкулеза в соответствии с требованиями нормативной документации
Всю противотуберкулезную работу следует проводить в условиях постоянного эпидемиологического контроля по распространенности туберкулеза среди населения.
Группа противотуберкулёзных препаратов включает ряд природных и полусинтетических соединений, общим свойством которых является активность в отношении микобактерий туберкулёза (Mycobacterium tuberculosis). Согласно общепринятой классификации, противотуберкулёзные препараты разделяются на препараты I ряда (основные) и II ряда (резервные) (табл. 2).
Таблица 2
Классификация противотуберкулёзных препаратов
Препараты I ряда
Препараты II ряда
Изониазид
Рифампицин
Пиразинамид
Этамбутол
Стрептомицин
Этионамид, протионамид
Канамицин
Амикацин
Ципрофлоксацин
Офлоксацин
Циклосерин
Капреомицин
Рифабутин
Парааминосалициловая кислота
Тиоацетазон
Такая систематизация обусловлена различиями в их активности и токсичности. Препараты I ряда сочетают высокую активность против M.tuberculosis и умеренную токсичность. Препараты II ряда характеризуются либо меньшей активностью, либо более высокой токсичностью, либо тем и другим. Препараты I ряда применяют для лечения пациентов с впервые выявленным туберкулёзом, II ряда - при неэффективности или плохой переносимости основных препаратов.
Некоторые из противотуберкулёзных препаратов, в силу особенностей спектра активности, применяются и при других инфекциях, вызываемых микобактериями (лепра и др.).
Изониазид – производное изоникотиновой кислоты (ГИНК). Изониазид быстро проникает в цианид – ингибирующий кислород зависимый процесс МБТ с активной жизнедеятельностью. Внутри МБТ, изониазид взаимодействует с catG, продуктом гена [catalase-peroxidase энзим] и формирует активную половину. Активизированный препарат связывает и подавляет активность гена inhA, кодирующего enoy1 редуктазу. Изониазид подавляет синтез миколевой кислоты в МБТ, с помощью специфического воздействия на синтез насыщенных жирных кислот, сщстщящих более 26 углеродных радикаловб взывая удлинение жирных кислот как мишень их действия. Поскольку изониазид также является мощным ингибитором микобактериальной каталазы-пероксидазы, он может усиливать восприимчивость бактерий к реактивной разновидности кислорода, продуцируемого в фагосомах макрофагов. Изониазид также действует как антиникотинамид адениндинуклеотид [НАД] метаболит и может также взаимодействовать с микобактериальным белком. Белки, кодирующие inhA в MBT способствуют накоплению или активизации изониазида.
Рифампицин - полусинтетическое производное Рифамицина В, продуцируемый антибиотик широкого спектра действия Amycolatopsis mediterranei. Является бактерицидным в отношении МБТ.
Рифампицин, связываясь с с beta-субединицей микобактериальной ДНК зависимой РНК полимеразы, предотвращает инициирование транскрипции. Препарат активен в отношении МБТ, внутри и вне клеток и имеет особо быстрый эффект на медленно растущих МБТ, находящихся в казеозном содержимом, где pH нейтрален, а содержание кислорода снижено.
В настоящее время происходит смещение акцента с анализа готовой продукции на аналитический контроль производства, т.е. качество должно быть заложено в продукт и контролироваться в процессе производства. Это означает, что аналитический контроль производства лекарственных средств должен проводиться в полном соответствии с действующей нормативной документацией: технические условия (ТУ), ГОСТы на сырье и материалы, раздел технологических регламентов «Контроль производства», стандарты предприятия на полупродукты, производственные инструкции, фармакопейные статьи и др.
На основании исходных данных лабораторной прописи для составления лабораторного регламента проводятся исследования по окончательному выбору схемы синтеза лекарственного вещества. При этом подбираются также методы анализа, позволяющие по ходу процесса исследовать химические превращения и устанавливать структуры побочных и промежуточных продуктов на всех стадиях синтеза. Предпочтение отдается универсальным методам анализа, обеспечивающим наибольшую информативность: ЯМР, хромато-масс-спектрометрия, ИК- и УФ-спектроскопия, тонкослойная хроматография, ВЭЖХ, полярография и др. Такой подход обусловлен тем, что на данном этапе разработки регламента рассматриваются различные варианты сырья и полупродуктов, оптимизируются(в масштабах лабораторного регламента) технологические параметры (температура, продолжительность реакции, рН и т.п.), определяется максимальное число контрольных точек, исследуется влияние природы и количества примесей на последующие процессы и определяется требуемая степень очистки полупродуктов, а иногда и исходного сырья.
Применительно к химическому синтезу лекарственных веществ нами предложена обобщающая схема разработки аналитического контроля для лабораторного регламента.
Разработка аналитического контроля для лабораторного регламента методологически сочетается с исследованиями технологических процессов, реализуемых на лабораторном оборудовании. Определение технологических параметров процессов синтеза в этом случае осуществляется также с помощью лабораторных приборов, имеющих широкий диапазон измерений. Поскольку на заключительном этапе разработки лабораторного регламента формируются основы технологических стадий производства, методики постадийного контроля разрабатываются с учетом перехода к опытно-промышленному регламенту.
Параметры технологических процессов, записанные в лабораторном регламенте, проверяются на пилотной установке. При этом с применением методик анализа, заложенных в лабораторный регламент, уточняется состав реакционных смесей, требующий контроля, устанавливаются более узкие диапазоны измеряемых концентраций, определяются окончательные контрольные точки и периодичность анализов. На основе полученных результатов предварительно разработанные методики адаптируются к условиям опытно-промышленного производства. При отработке технологии в этом масштабе используется в основном оборудование и контрольно-измерительные приборы промышленного исполнения (рН-датчики, расходомеры, термометры, термисторы и т.д.).
Необходимым переходом от лабораторного регламента к опытно-промышленному является определение условий управления и стабилизации технологических процессов по величинам отклонений результатов анализа от нормативных значений. На практике технологу достаточно знать величину отклонения содержания ключевого компонента или какого-либо параметра процесса от норматива без излишней информации о полном составе реакционной смеси.
Для аналитического контроля на опытно-промышленном этапе производства целесообразно использовать простые, но надежные и производительные экспрессные методики анализа. Такие методики могут быть разработаны на основе неселективных методов(полярография, рефрактометрия, кондуктометрия, редокс- и потенциометрия и т.п.), и они могут быть с успехом использованы для автоматического контроля и управления непрерывными и периодическими процессами. Очевидно, что исходные данные для создания экспрессных методик могут быть получены с помощью лабораторных методик, позволяющих находить зависимости состава реакционных смесей от физико-химических характеристик.
Редоксметрический контроль внедрен в производство продуктов, получаемых через стадию диазотирования анилина. При правильном проведении этого процесса выход продукта близок к теоретическому. Заслуживает внимания кондуктометрический метод автоматического контроля в химико-фармацевтических производствах на стадиях приготовления растворов электролитов заданной концентрации, процессов разделения водно-органических слоев при экстракции и т.п..
Опубликовано большое количество статей и обзоров, посвященных применению проточно-инжекционного анализа. Зарубежные фирмы выпускают целые комплексы и линии для анализа лекарственных препаратов по проточно-инжекционной схеме в производственных условиях. В основном это установки, снабженные фотометрическими, электрохимическими и хемилюминесцентными детекторами. Например, парацетамол (N-ацетил-п-аминофенол) количественно определяют в двухканальной проточно-инжекционной системе со спектрофотометрическим детектированием, производительность аналитической системы 26 проб в час. Достоинства проточно-инжекционного анализа очевидны: высокая производительность, автоматизация стадий пробоподготовки и измерения аналитического сигнала; легко осуществляемый переход от одного типа анализа к другому, возможность эффективного использования для контроля качества очистки жидких отходов производства, широкое применение в клиническом и фармацевтическом анализе.
Требованиям информативности, экспрессности и достоверности к постадийному аналитическому контролю более других отвечают методы анализа с предварительным разделением, прежде всего это различные варианты хроматографии. В настоящее время они чаще других включаются в технологические регламенты, фармакопейные статьи и другую нормативную документацию.
Из хроматографических методов наиболее доступным, получившим наибольшее распространение в контроле лекарственных средств является тонкослойная хроматография. Метод не требует сложного аппаратурного оформления, какой-либо специальной подготовки персонала, относительно дешевый. Тонкослойная хроматография доступна и эффективна в тех случаях, когда возможности применения других хроматографических методов ограничиваются свойствами анализируемых объектов, например, термолабильностью или малой летучестью соединений, присутствием большого количества мешающих анализу смол, солей, пигментов и т.п. Метод предпочтителен для контроля за ходом процессов, протекающих в агрессивных средах.
Большая часть методик предписывает визуальную полуколичественную оценку путем сравнения пятен веществ с пятнами стандартов по их размеру и интенсивности окраски, поглощения или флуоресценции пятен в УФ свете. Гибридные методы, в частности хроматоспектрофотометрия и особенно хроматоденситометрия, позволяют проводить количественный анализ в производстве многих лекарственных препаратов.
Фармакопейное качество готовых лекарственных средств во многом зависит от качества наполнителей - вспомогательных веществ, входящих в состав всех твердых и мягких лекарственных форм. В настоящее время используется около180 видов вспомогательных веществ, и только10-15% от этого количества отвечают фармакопейным требованиям качества, включая физико-химические и биологические(микробная чистота и др.) показатели. Проблема состоит в дополнительной очистке таких наполнителей, как крахмал, тальк, производные целлюлозы, соли жирных органических кислот и щелочноземельных металлов, вазелин, воск, масла, поливинилпирролидон и т.д. Государственным фармакопейным комитетом МЗ РФ принято решение о разработке соответствующих фармакопейных статей взамен действующих ТУ и ОСТ-ов на наиболее важные и часто применяемые в производстве лекарственных форм наполнители.
Для распознавания фальсификатов могут применяться аналитические методы: тонкослойная хроматография, ВЭЖХ, хромато-масс-спектрометрия, ИК-спектрометрия в ближней области, газо-жидкостная хроматография (остаточные растворители), а также экспрессные тесты на подлинность по характерным цветным реакциям.
Эффективным способом выявления фальсифицированных твердых лекарственных средств (таблетки, капсулы) может служить испытание на растворение препаратов.
Определение антимикробной активности антибиотиков методом диффузии в агар основано на их способности угнетать рост микроорганизмов. Определение проводят методом диффузии в агар на плотной питательной среде путем сравнения размеров зон угнетения роста тест-микробов, образующихся при испытании растворов определенных концентраций Государственного стандартного образца и испытуемого препарата34.
Антимикробная активность антибиотиков выражается в ЕД или “мкг”. Для большинства антибиотиков 1 ЕД или “мкг” соответствуют 1 мкг активного вещества (кислоты или основания); для антибиотиков, имеющих иное количественное выражение единицы, соответствующие указания даются в частных статьях.
При определении антимикробной активности антибиотиков используют стандартные образцы, активность которых, как правило, устанавливают в соответствии с Международными биологическими стандартами. При отсутствии последних для указанных целей могут быть использованы Международные химические стандарты, антимикробную активность которых рассчитывают на основании показателей качества, установленных физико-химическими методами. Антимикробную активность стандартных образцов антибиотиков, не имеющих аналогов в международной коллекции стандартов, рассчитывают также на основании показателей качества, установленных физико-химическими методами.
Стандартные образцы антибиотиков утверждаются и рассылаются Государственным научно-исследовательским институтом по стандартизации и контролю лекарственных средств Минздрава РФ, хранятся и используются в соответствии с рекомендациями, указанными на этикетке стандартного образца35.
В чашки Петри (стеклянные или пластмассовые), установленные на столиках со строго горизонтальной поверхностью, разливают расплавленные питательные среды определенного состава в один или два слоя. Для нижнего слоя используют незасеянные среды, для верхнего или одного слоя — агаровую среду, предварительно засеянную соответствующим тест-микробом. Если культура представляет собой суспензию вегетативных клеток, то температура расплавленной среды, в которую вносят тест-микроб, должна быть 49±1 °С: при использовании суспензии спор — 65— 70 °С. К среде следует добавить такое количество суспензии вегетативных клеток или спор, которое обеспечивает оптимальный рост тест-микроба и четкость зон угнетения его роста.
Шесть стерильных цилиндров единого размера и массы, высотой 10,0±0,1 мм и внутренним диаметром 6,0±0,1 мм, из нержавеющей стали или алюминия расставляют на поверхности засеянной среды на равном расстоянии друг от друга и от края чашки. Вместо цилиндров могут быть использованы лунки диаметром от 6 до 8 мм, сделанные в толще агара с помощью стерильного сверла либо другого соответствующего приспособления.
В цилиндры или лунки каждой чашки вносят равные объемы рабочих растворов стандартного и испытуемого образцов. Основные растворы стандартных и испытуемых образцов готовят в стерильных растворителях с концентрацией 1 мг/мл. Затем из основных растворов в зависимости от применяемого варианта метода диффузии в агар (трехдозного или с построением стандартной кривой) готовят рабочие растворы трех или одной концентраций испытуемого образца и растворы трех или пяти концентраций стандартного образца.